Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere sezioni coronali ipofisarie adeguate con architetture tissutali ben conservate da topi in via di sviluppo. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo ipofisario, come l'istologia ipofisaria, la differenziazione cellulare, la proliferazione e l'apoptosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'epifisi murina in via di sviluppo può essere sezionata senza danni visibili e orientata correttamente per ottenere sezioni coronali.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che, per lo sviluppo di ipofisi murine, era tecnicamente difficile ottenere sezioni coronali adeguate. Dopo aver anestetizzato e fissato i topi secondo il protocollo di testo, utilizzare le forbici per tagliare l'osso del cranio. Successivamente, con una pinza, sollevare delicatamente il rombencefalo dalla base del cranio.

Quindi, al primo segno della sella turcica, smettere di sollevare ma tenere il rombencefalo, e utilizzare le forbici sottili per tagliare il gambo ipofisario e le fibre nervose collegate alla base del cervello. Continua a sollevare e rimuovere l'intero cervello per esporre completamente la ghiandola pituitaria. La ghiandola pituitaria poggia sulla superficie dorsale dell'osso sfenoidale ed è circondata lateralmente dai nervi trigemino.

Quindi usa le forbici per tagliare l'intera regione sellare, compresa la ghiandola pituitaria, i nervi trigemino laterali e sotto l'osso sfenoide. Mettere il fazzoletto in una capsula da 35 mm contenente il 4% di PFA e incubarlo a 4 gradi Celsius per 40 minuti o 3 ore, a seconda dell'età. Quindi utilizzare 10 ml di PBS per lavare il fazzoletto fissato per cinque cambi a 15 minuti ciascuno.

Trasferire il tessuto fissato in un piatto da 35 mm contenente 1 mL di PBS e, sotto uno stereomicroscopio, dissociare le ghiandole pituitarie. Per le pituitarie da P5 a P14, con pinze sottili e forbici rimuovere le membrane connettive tra i nervi e l'osso e isolare accuratamente la ghiandola pituitaria insieme ai nervi trigemino laterali nel loro insieme, ma lasciando la sella turcica. Per la P21 e l'ipofisi adulta, rimuovere i nervi e le membrane connettive attorno all'ipofisi e liberare la ghiandola dai tessuti circostanti.

Dopo la disidratazione, l'eliminazione dello xilene e l'infiltrazione di cera effettuate secondo il protocollo di testo, su un sistema di console di inclusione dei tessuti, rimuovere il campione dalla cassetta e posizionarlo in uno stampo di base riempito a metà con cera di paraffina fusa. Per la ghiandola pituitaria P21 e adulta, utilizzare una pinza fine riscaldata per posizionare la ghiandola pituitaria con il suo asse corto perpendicolare alla superficie inferiore di uno stampo di base. Per le ipofisi da P0 a P4, orientare i campioni con le ossa sfenoidali perpendicolari alla superficie inferiore di uno stampo di base.

Per le ghiandole pituitarie da P5 a P14, orientare i campioni con i nervi trigemino perpendicolarmente alla superficie inferiore di uno stampo di base. Dopo aver posizionato la ghiandola, utilizzare una pinza fine riscaldata per mantenere delicatamente il tessuto nella posizione desiderata fino a quando la cera diventa semisolida su una piastra di raffreddamento. Rabboccare lo stampo con cera di paraffina fusa.

Lasciare raffreddare il blocco di paraffina fino a quando la cera non si sarà completamente solidificata. Raffreddare il blocco di paraffina a meno 20 gradi Celsius per 10-20 minuti, quindi utilizzare un microtomo per tagliarlo a fette sottili, regolando con precisione la posizione del blocco di paraffina durante il sezionamento. Eseguire l'immunomarcatura secondo il protocollo di testo.

Come mostrato qui, per sezionare la ghiandola pituitaria dal topo neonatale, l'intera regione sellare contenente la ghiandola pituitaria, i nervi trigemino e l'osso sfenoidale sottostante sono stati sezionati dalla base del cranio. La minuscola e delicata ghiandola pituitaria è rimasta intatta durante il processo. Per i topi di età superiore ai cinque giorni, le ghiandole pituitarie attaccate ai nervi trigemino laterali sono state isolate.

La struttura di crescita della ghiandola pituitaria isolata dal topo P7 era ben conservata. Qui, la ghiandola pituitaria del topo P21 è stata isolata con successo senza danni visibili durante la rimozione del tessuto circostante. In questa figura, la colorazione H&E delle sezioni coronali correttamente orientate dimostra una morfologia ben conservata sia dell'adenoipofisi che della neuroipofisi nelle ghiandole pituitarie P0, P7 e P21.

Infine, i vetrini elaborati erano anche compatibili con la marcatura in immunofluorescenza. Ad esempio, l'adenoipofisi e la neuroipofisi hanno mostrato un'immunomarcatura specifica di GH e GFAP, rispettivamente. Una volta padroneggiato, il processo dalla dissezione all'inclusione può essere eseguito in 7,5 ore nei topi adulti e anche meno nei topi più giovani se viene eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sezionare l'intera regione sellare per evitare di toccare la ghiandola pituitaria con strumenti chirurgici. Seguendo questa procedura, è possibile isolare anche l'ipofisi che non è stata prefissata. In tal caso, è necessario prestare maggiore attenzione per evitare danni indesiderati.

Anche la ghiandola deve essere sezionata il più rapidamente possibile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare le ghiandole pituitarie dei topi e preparare le sezioni coronali ipofisarie in diverse fasi di sviluppo.