Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sinape traslazionalmente attiva alle zone neuronali dalla corteccia cerebrale del topo, utilizzando un gradiente discontinuo di densità di saccarosio perale. Ciò si ottiene raccogliendo e omogeneizzando prima le cortecce di topo e quindi centrifugando l'omogeneizzato. Successivamente, applicare l'omogeneizzato di centrifuga, o il sunnatante, ai gradienti di preport per co saccarosio.

Il passaggio finale consiste nella centrifugazione e nella raccolta della frazione sinaptosoma. In definitiva, l'analisi western blot e gli esperimenti di incorporazione della metionina S 35 mostrano che la frazione sinaptosomica è sinapticamente arricchita e attiva traduzionalmente. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la centrifugazione e la filtrazione, sono il primo danno meccanico che viene evitato utilizzando gradienti di densità, mentre il secondo per chiamata ha una bassa tossicità nei confronti delle cellule nei loro costituenti.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con questo protocollo perché il tempismo gioca un ruolo chiave. Una volta che il cortis è stato raccolto, la procedura dovrebbe essere completata rapidamente. Per iniziare la procedura, preparare gli strati di gradiente da 3, 10, 15 e 23% aggiungendo le rispettive quantità di SIP come descritto nel manoscritto di accompagnamento al tampone GM e mescolare bene.

Versare gli strati di gradiente pipettando due millilitri da ciascuna delle soluzioni di perolo isosmotico da 23, 15, 10 e 3% nelle provette da centrifuga Beckman con tappo. Utilizzando una pipetta P 1000, l'interfaccia tra gli strati dovrebbe essere chiaramente distinguibile senza mescolarli. Conservare le pendenze di quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti prima dell'uso.

Prima di iniziare questa procedura, prepara altre soluzioni necessarie come descritto nel manoscritto allegato. Sopprimere il topo all'età di P 13 a P 21 e prepararlo per la dissezione spruzzando la parte posteriore del collo e della testa con etanolo al 70%. Quindi usa un paio di forbici affilate per tagliare il midollo spinale alla base del cranio.

Quindi, rimuovi la pelle dalla parte superiore del cranio. Tagliare il cranio lateralmente tra l'osso parietale e l'osso interparietale, o tra il cervello e le regioni della corteccia. Successivamente, taglia il cranio dalla base al naso lungo la sutura sagittale.

A questo punto, rimuovere con cautela l'osso parietale morbido tirando lateralmente ciascun emisfero. Dopodiché, inserisci la spatola nel cervello sopra il cervelletto per estrarre la corteccia. Mettilo in un tampone GM ghiacciato e ripeti di nuovo le procedure per raccogliere più cortecce.

Ora sciacquare le cortecce in un tampone GM ghiacciato. Quindi trasferire due cortecce in un omogeneizzatore di vetro contenente cinque millilitri di tampone GM freddo. Omogeneizzare delicatamente le cortecce con da cinque a 10 colpi di pestello A, il pestello sciolto seguito da cinque a 10 colpi di pestello B, il tipo pestello.

Il numero di corse varia a seconda del singolo omogeneizzatore. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare 1000 volte.

Gravità per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga Allegra six KR per pellettare detriti cellulari e nuclei. Sovrapporre due millilitri di supinato per ogni gradiente per o saccarosio con un gradiente per ogni corteccia intera e tappare i tubi. Quindi centrifugarli in un rotore ad angolo fisso a 32, 500 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga Beckman J 2 21.

Utilizzando adattatori appropriati, una volta completato, il gradiente dovrebbe fornire una forte pipetta in banda SN e scartare la soluzione al di sopra della banda SN. Utilizzando una pipetta per pasta di vetro pipette fuori dalla banda SN all'interfaccia dal 15 al 23%, un gradiente generalmente fornisce circa 0,9-1,1 millilitri di sns. Dopodiché, trasferiscilo in un tubo conico e conservalo con ghiaccio.

Quindi regolare la concentrazione di sale del SNS aggiungendo un decimo volume di tampone di stimolazione 10 volte. Opzionalmente aggiungere 1000 volte cloruro di calcio per ottenere una concentrazione finale di 12 ano molare. Successivamente, aggiungere un ceppo TTX millimolare per ottenere una concentrazione finale di un micromolare per sopprimere l'eccitazione non specifica.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare l'SNS nell'applicazione a valle applicabile, come gli studi di traduzione delle proteine. Per altre applicazioni, il lisato SN può essere purificato o concentrato utilizzando il kit di preparazione del campione della pagina Pierce SDS. La concentrazione proteica del SNS può essere determinata utilizzando il kit di dosaggio delle proteine micro BCA.

Ecco un esempio di sei bande o frazioni. Quando la corteccia del topo è stata omogeneizzata e separata su gradienti discontinui di perolo saccarosio, gli SNS arricchiti erano contenuti nella banda cinque all'interfaccia dal 23 al 15%, questa banda è stata rimossa ed esaminata al microscopio elettronico. Un esempio di vescicole sinaptiche intatte e la conservazione di elementi pre-sinaptici e post-sinaptici sono mostrati qui nel western blot.

È stato dimostrato che un aumento dei marcatori sinaptici e una diminuzione delle impurità nella banda SN da un gradiente discontinuo per saccarosio confermano che l'aumento dell'incorporazione di S 35 metionina dopo l'aggiunta di glutammato è dovuto alla sintesi proteica de novo. 40 micromolare anesa micina un inibitore della sintesi proteica. Questa figura mostra la marcata diminuzione dell'incorporazione di S 35 metionina in presenza di anso micina con o senza glutammato presente rispetto ai livelli basali.

Pertanto, i gradienti discontinui di saccarosio perale producono rapidamente SNS altamente attivi e relativamente puri che possono essere utilizzati per studiare la traduzione delle proteine. Questa figura mostra che la banda cinque del gradiente discontinuo di saccarosio per core contiene i livelli più alti di sintesi proteica de novo. Il SNS preparato facendo passare la corteccia omogeneizzata attraverso una serie di filtri con dimensioni dei pori decrescenti e quindi centrifugando su un gradiente discontinuo di saccarosio per nucleo per il confronto contiene più membrane rotte e meno SNS intero rispetto al SNS preparato con il metodo del gradiente discontinuo di perolo e saccarosio

I SNS preparati da topi più giovani hanno dimostrato di avere una maggiore attività traslazionale rispetto ai topi più anziani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come isolare le zone neuronali sinaptiche traslazionalmente attive omogeneizzando le cortecce di topo centrifugando l'omogenato in un rotore a secchiello oscillante, centrifugando il surnatante su un gradiente di saccarosio per chiamata in un rotore ad angolo fisso e quindi raccogliendo la banda della zona neurologica sinaptica risultante.