Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging
18 settembre 2015
L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare la fetta corticale di Calot Thal con quattro strutture uditive principali, il colon inferiore, il talamo uditivo, la porzione uditiva del nucleo reticolare talamico e la corteccia uditiva. Ciò si ottiene rimuovendo prima il cervello dal topo. Il secondo passo è bloccare il cervello in preparazione per l'affettatura.
Successivamente, tagliare il cervello per ottenere fette contenenti la connessione corticale Calot thal. Il passo finale consiste nell'utilizzare l'imaging delle flavoproteine per valutare la connettività. In definitiva, la fetta di cervello contenente la connessione corticale carotale può essere utilizzata per una varietà di esperimenti per comprendere meglio l'elaborazione delle informazioni nelle regioni uditive del cervello medio e quattro La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi per bloccare il cervello prima dell'affettatura sono difficili da apprendere perché richiede un complesso taglio a doppio angolo, che è la chiave per ottenere proiezioni intatte.
A dimostrare la tecnica sarà BJ Slater, uno studente laureato nel mio laboratorio, per preparare la fase di taglio per l'affettatura, tagliare un piccolo pezzo di trivella al 3% di circa un centimetro cubo da utilizzare come antiritorno per il cervello, e un altro pezzo di 1,5 centimetri per 1,5 millimetri per tre millimetri da utilizzare come protuberanza per sostenere il collicolo inferiore. Quindi, incolla il backstop sul palco con adesivo cianoacrilato, quindi incolla la protuberanza sul lato destro del backstop in modo tale da formare un angolo di 80 gradi su una diapositiva contrassegnata da due linee a 90 gradi e una linea diagonale a 17 gradi dall'alto a sinistra al basso a destra. Usando una lama di rasoio, rimuovi da due a quattro millimetri dell'estremità rostrale del cervello per creare una superficie piana.
Quindi, posiziona il cervello con il lato della coccola rivolto verso l'alto sulla superficie piana appena creata. Allineare la superficie dorsale del cervello con una linea orizzontale e la linea mediana del cervello con una linea verticale segnata sul vetrino. Quindi allineare la lama del rasoio con una linea di 17 gradi.
Inclinare il rasoio con un angolo di 30 gradi e rimuovere circa tre millimetri della corteccia destra in un doppio taglio diagonale per montare il cervello sul palco del vibrato. Posiziona un piccolo pezzo di carta da filtro sul lato ventrale del cervello in modo che la dimensione lunga sia perpendicolare alla linea mediana. Applicare con cura una piccola quantità di adesivo cianoacrilato sull'area davanti al dispositivo antiritorno e a sinistra del dosso.
Successivamente, posiziona il lato del cervello tagliato in diagonale sulla colla in modo che la parte coccolare del cervello e il cervello posteriore siano appoggiati sulla protuberanza e il lato destro del cervello sia contro il backstop. In questa procedura, posizionare rapidamente la fase di taglio nel vibrato, costruire una fase con soluzione di taglio. Quindi, allinea la lama con la parte superiore del cervello.
Rimuovere da uno a 1,5 millimetri dalla parte superiore del cervello. Quindi affettare e rimuovere altre fette da 300 a 500 micrometri mentre ci si sposta più in profondità. Quando il collicolo inferiore, il corpo ato mediale e il nucleo ICT laterale sono tutti visibili, il giro dentato dovrebbe apparire a forma di C e la struttura dovrebbe essere allineata.
Ricavare circa due fette da 600 micrometri. Queste sono le fette corticali carotali. Successivamente, trasferiscili nella camera di contenimento a 32 gradi Celsius.
Per acquisire l'immagine dell'autofluorescenza della flavoproteina, raccogliere le immagini a quattro hertz per 105 secondi. Illumina il tessuto con luce blu da 470 a 490 nanometri e cattura oltre i 515 nanometri assicurandoti che l'immagine non sia né troppo scura né spenta. Quindi utilizzare la stimolazione elettrica per attivare il tessuto per acquisire un'immagine del calcio.
Raccogli immagini a 10 hertz per 25 secondi. Illuminare il tessuto con luce a 365 nanometri e catturare la fluorescenza superiore a 510 nanometri. Ancora una volta, assicurandosi che l'immagine non sia né troppo scura né sbiadita.
Quindi utilizzare la stimolazione elettrica per attivare le cellule. Questa immagine mostra la conferma della connessione corticale carotale nella fetta cerebrale mediante l'autofluorescenza della flavoproteina. La stimolazione elettrica somministrata a 0,05 hertz al colon inferiore è stata ripresa a quattro hertz e quattro a elaborata per mostrare la potenza a quella stimolazione.
La frequenza, il talamo uditivo, il talamo, il reticolo, il nucleo e la corteccia uditiva sono attivati sinapticamente. Di seguito è riportata una sezione non connessa. La stimolazione elettrica del colon inferiore con attivazione è stata osservata solo nel talamo uditivo.
L'intero percorso non è stato catturato, probabilmente a causa di uno dei tagli leggermente fuori piano. Con proiezioni corticali di Alam. Questa immagine mostra l'attivazione atipica della corteccia uditiva.
La stimolazione elettrica del colon inferiore attivava la corteccia uditiva senza segnale visibile. Nel talamo uditivo, è probabile che il talamo fosse ancora attivato, ma non era sulla superficie dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere la fetta corticale talamica AAL e di valutarne la connettività.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per preparare la sezione corticale di Calot Thal, concentrandosi sulle principali strutture uditive nel cervello del topo. La tecnica migliora la comprensione della connettività nelle regioni uditive.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Elaborazione uditiva
- Tecniche di taglio del cervello
Sfondo
- Lo studio mira a investigare l'elaborazione uditiva nel cervello del topo.
- Si concentra su quattro principali strutture uditive: il collicolo inferiore, il talamo uditivo, il nucleo reticolare del talamo e la corteccia uditiva.
- Comprendere queste connessioni è cruciale per esplorare l'elaborazione delle informazioni nelle regioni uditive.
- Il metodo coinvolge tecniche di taglio complesse per preservare la struttura del cervello.
Obiettivo dello studio
- Preparare sezioni cerebrali che mantengano l'integrità delle connessioni uditive.
- Facilitare esperimenti che migliorano la comprensione dell'elaborazione delle informazioni uditive.
- Dimostrare l'importanza di tecniche di taglio precise nella preparazione delle sezioni cerebrali.
Metodi utilizzati
- Rimozione del cervello del topo per il taglio.
- Blocco del cervello per prepararlo al taglio.
- Esecuzione di un taglio doppiamente angolato per ottenere le sezioni.
- Utilizzo dell'imaging delle flavoproteine per valutare la connettività nelle sezioni.
Risultati principali
- Il metodo cattura con successo le connessioni tra le principali strutture uditive.
- L'imaging delle flavoproteine rivela l'integrità dei percorsi uditivi.
- Ha dimostrato l'efficacia del taglio doppiamente angolato nel preservare le proiezioni.
- Ha fornito una tecnica affidabile per futuri esperimenti sull'elaborazione uditiva.
Conclusioni
- Lo studio presenta un metodo raffinato per preparare sezioni cerebrali uditive.
- Evidenza l'importanza di tecniche di taglio precise nella ricerca neuroscientifica.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione dell'elaborazione delle informazioni uditive.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
