Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare una sezione corticale del talamo di Calot contenente quattro strutture uditive principali: il collicolo inferiore, il talamo uditivo, la porzione uditiva del nucleo talamico reticolare e la corteccia uditiva. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo il cervello dal topo. Il secondo passaggio consiste nel sagomare il cervello in preparazione per il taglio.

Successivamente, tagliare il cervello per ottenere sezioni contenenti la connessione talamo-corticale di Calot. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare l'immagine autofluorescente della flavoproteina per valutare la connettività. In definitiva, la sezione cerebrale contenente la connessione talamo-corticale può essere utilizzata per una varietà di esperimenti volti a comprendere meglio l'elaborazione delle informazioni nelle regioni uditive del mesencefalo e del telencefalo. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per bloccare il cervello prima della sezionatura sono difficili da apprendere, in quanto richiedono un taglio doppio angolato complesso, essenziale per ottenere proiezioni integre.

Per dimostrare la tecnica, interverrà BJ Slater, studente laureato nel mio laboratorio. Per preparare la piattaforma di taglio, tagliare un piccolo pezzo di agar al 3% di circa un centimetro cubo da utilizzare come fermo per il cervello e un altro pezzo di 1,5 centimetro per 1,5 millimetro per tre millimetri da utilizzare come sporgenza per sostenere il collicolo inferiore. Successivamente, incollare il fermo sulla piattaforma utilizzando colla cianoacrilica, quindi incollare la sporgenza sul lato destro del fermo in modo che formino un angolo di 80 gradi. Su un vetrino contrassegnato con due linee a 90 gradi e una linea diagonale a 17 gradi che va dall'angolo in alto a sinistra a quello in basso a destra, posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto nel punto di intersezione delle due linee. Utilizzando una lametta, rimuovere due-quattro millimetri dell'estremità rostrale del cervello per creare una superficie piana.

Successivamente, posizionare il cervello con il lato coddle rivolto verso l'alto sulla nuova superficie piana. Allineare la superficie dorsale del cervello con una linea orizzontale e la linea mediana del cervello con una linea verticale marcata sul vetrino. Quindi allineare la lama del rasoio con una linea a 17 gradi.

Inclinare il rasoio a un angolo di 30 gradi ed eseguire un doppio taglio diagonale per rimuovere circa tre millimetri della corteccia destra, in modo da montare il cervello sulla piattaforma del vibratome. Posizionare un piccolo pezzo di carta da filtro sul lato ventrale del cervello in modo che la sua dimensione maggiore sia perpendicolare alla linea mediana. Applicare con attenzione una piccola quantità di adesivo cianoacrilico nell'area antistante il fermo posteriore e a sinistra della sporgenza.

Successivamente, posizionare il lato del cervello tagliato diagonalmente sulla colla in modo che la parte coddle del cervello e il cervelletto siano appoggiati sul rilievo, e il lato destro del cervello sia contro lo stop posteriore. In questa procedura, posizionare rapidamente la piattaforma di taglio nel vibratome e riempire la camera con soluzione di taglio. Successivamente, allineare la lama con la sommità del cervello.

Rimuovere da uno a 1,5 millimetri della parte superiore del cervello. Successivamente, tagliare e rimuovere ulteriori sezioni di 300-500 micrometri procedendo in profondità. Quando il collicolo inferiore, il corpo mediale ate e il nucleo laterale del ICT sono tutti visibili, il giro dentato dovrebbe apparire con una forma a C e la struttura dovrebbe essere allineata.

Prelevare circa due fette di 600 micrometri. Queste sono le fette corticali carotidi. Successivamente, trasferirle nella camera di mantenimento a 32 gradi Celsius.

Per acquisire l'immagine di autofluorescenza delle flavoproteine, acquisire le immagini a quattro hertz per 105 secondi. Illuminare il tessuto con luce blu compresa tra 470 e 490 nanometri e acquisire al di sopra di 515 nanometri, assicurandosi che l'immagine non sia né troppo scura né sovraesposta. Successivamente, utilizzare una stimolazione elettrica per attivare il tessuto e acquisire un'immagine del calcio.

Acquisire immagini a 10 hertz per 25 secondi. Illuminare il tessuto con luce a 365 nanometri e catturare la fluorescenza al di sopra di 510 nanometri. Ancora una volta, assicurarsi che l'immagine non sia né troppo scura né sovraesposta.

Quindi utilizzare la stimolazione elettrica per attivare le cellule. Questa immagine mostra la conferma della connessione corticale carotidea nella sezione di tessuto cerebrale mediante autofluorescenza della flavoproteina. La stimolazione elettrica applicata a 0,05 hertz al collicolo inferiore è stata acquisita a quattro hertz e successivamente elaborata per mostrare l'intensità corrispondente a tale stimolazione.

Frequenza, il talamo uditivo, talamico, reticolare, nucleo e corteccia uditiva vengono attivati sinapticamente. Ecco una sezione non collegata. Una stimolazione elettrica del collicolo inferiore con attivazione è stata osservata solo nel talamo uditivo.

L'intero percorso non è stato probabilmente catturato a causa di un taglio leggermente fuori piano. Con le proiezioni corticali di Alam. Questa immagine mostra un'attivazione atipica della corteccia uditiva.

La stimolazione elettrica del collicolo inferiore ha attivato la corteccia uditiva senza segnale visibile. Nel talamo uditivo, è probabile che il talamo fosse ancora attivato, ma non era visibile sulla superficie dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una sezione talamo-corticale del talamo AAL e di come valutarne la connettività.