Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

L'obiettivo di questa procedura è quello di internalizzare e visualizzare biomolecole come il DNA o le proteine marcate con Fluor organico all'interno di microrganismi viventi utilizzando un metodo basato sull'elettroporazione. Ciò si ottiene incubando prima cellule elettrocompetenti con biomolecole marcate in fluorescenza prima di trasferirle in un veicolo di elettroporazione. Applicando un'alta tensione attraverso il vete, le formazioni transitorie di pori sia sulla parete cellulare che sulla membrana cellulare consentiranno la diffusione biomolecolare nelle cellule.

Successivamente, le cellule vengono incubate in un terreno ricco per consentire loro di riprendersi prima che le biomolecole non internalizzate in eccesso vengano rimosse. Infine, le cellule vengono trasferite su un tampone a bassa fluorescenza con un nutriente minimo, quindi un vetrino coprioggetto viene sovrapposto per formare un sandwich agro di vetro. In definitiva, la microscopia dell'essenza viene utilizzata per analizzare la posizione, il modello di diffusione e le proprietà dinamiche delle biomolecole marcate all'interno delle cellule viventi.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto dei limiti dell'imaging su cellule vive. A causa del rapido glitch delle proteine fotofluorescenti come la GFP, abbiamo pensato che caricando le cellule viventi con biomolecole marcate con forza organica del fluoro, avremmo trapiantato in microrganismi viventi. I principali vantaggi di questa forza sono la luminosità, la stabilità fotografica e le dimensioni ridotte.

Speriamo quindi di seguire la localizzazione e la diffusione del DNA o delle proteine nei loro ambienti nativi su scale temporali molto più lunghe, che corrisponderebbero a molti importanti processi biologici. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti, come la microiniezione, è che possono essere applicate anche a microrganismi più piccoli del diametro del tipico ago per microiniezione. Un ulteriore vantaggio dell'elettroporazione è che un gran numero di cellule può essere caricato contemporaneamente con biomolecole fluorescenti e visualizzare in parallelo quelle rendendo l'elettroporazione una tecnica particolarmente efficace per gli occhi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla diffusione e sul comportamento dinamico di biomolecole marcate in fluorescenza in vivo, può essere applicato anche in altri contesti, ad esempio per biomolecole di elettrodi che non sono marcate, ma può, ad esempio, innescare una risposta fisiologica quando viene internalizzato dalla cellula. Per costruire cuscinetti aros per batteri o microscopia fluorescente per lieviti, iniziare preparando alcuni mezzi a bassa fluorescenza di due volte, Quindi sciogliere prontamente una soluzione di 2%AROS in acqua distillata con un forno a microonde da laboratorio. Aggiungere un volume corrispondente della rosa HA calda al terreno e pipettare delicatamente la miscela su e giù. Evitando la formazione di bolle, pipettare immediatamente circa 200 microlitri della miscela di arorose su un vetrino coprioggetti per microscopio di dimensioni standard.

Lasciare il vetrino coprioggetti sul banco per un minuto a temperatura ambiente fino a quando il gel non si solidifica o la conservazione temporanea posiziona un secondo vetrino coprioggetti pulito sul tampone fresco e applica delicatamente una pressione dall'alto per far scorrere la rosa d'uovo, iniziando con una scorta di biomolecole fluorescenti preparate in un tampone a bassa forza ionica. Trasferisci fino a cinque microlitri di biomolecole in un'aliquota da 20 microlitri di batteri competenti o 50 microlitri di cellule di lievito competenti. La quantità di biomolecole fluorescenti incubate con le cellule è direttamente correlata alla quantità di biomolecole internalizzate per cellula.

Dopo l'elettroporazione, incubare la miscela su ghiaccio per un massimo di 10 minuti. Allo stesso tempo, selezionare un controllo di elettroporazione con una distanza tra gli elettrodi appropriata e raffreddare sul ghiaccio. Trasferire il composto cellulare nella vete pre-raffreddata.

Picchiettare delicatamente il vete un paio di volte per rimuovere eventuali bolle dalla soluzione. Rimuovere l'umidità dal veterinario con un tovagliolo di carta e posizionare il veterinario nell'elettroventilatore. Applicare un impulso ad alta tensione alle celle subito dopo questo processo.

Verificare che la costante di tempo visualizzata sull'elettro sia compresa tra quattro e sei millisecondi. Costanti di tempo più basse sono spesso dovute alla presenza di sale in eccesso o bolle all'interno del qve e possono diminuire o inibire completamente l'assorbimento di biomolecole nelle cellule. Impulsi di tensione più elevati migliorano il carico della cella, ma possono anche influire sulla vitalità della cella subito dopo l'elettroporazione.

Aggiungere 500 microlitri di terreno ricco e trasferire le cellule in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Lascia che la membrana cellulare si riprenda incubando i batteri a 37 gradi Celsius o il lievito a 29 gradi Celsius per 2-10 minuti. Dopo l'incorporazione della biomolecola e il recupero della crescita, far girare le cellule per un minuto in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius e scartare l'agente supino Reese.

Sospendere il pellet in 500 microlitri di tampone e ripetere i processi di centrifugazione e rimozione e sospensione del tampone resus. Altre tre volte. Queste fasi di lavaggio rimuoveranno tutte le tracce di biomolecole non internalizzate dalla sospensione cellulare.

Nel caso di proteine marcate, l'internalizzazione e l'ulteriore fase di purificazione vengono eseguite pipettando la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri dotata di un filtro a membrana da 0,22 micron sulla parte superiore. Separare le celle dal tampone mediante centrifugazione, assicurandosi che rimanga abbastanza liquido sopra il filtro per evitare che le celle si secchino e scartino la frazione di flusso. Sotto il filtro, aggiungere 500 microlitri di PBS fresco sulle cellule e ripetere la combinazione di uno spin down seguito da una nuova edizione di PBS.

Altre due volte. Eseguire una centrifuga finale a 3.300 g per un minuto. Per rimuovere il precedente lavaggio PBS, risospendere le cellule con 150 microlitri di PBS.

Infine, rimuovere il vetrino coprinte superiore dal tampone aros precedentemente realizzato. Caricare le cellule sul tampone pipettando goccia a goccia 10 microlitri della sospensione cellulare. Dopo aver posizionato un nuovo vetrino coprioggetti pulito sopra il tampone di arose, le celle sandwich sono ora pronte per la microscopia a fluorescenza.

I controlli negativi come i controlli non classificati, che sono stati incubati con biomolecole marcate o cellule vuote, che non sono state elettro-classificate né incubate, devono essere preparati in parallelo con i campioni caricati, le cellule caricate possono essere visualizzate su qualsiasi microscopio a fluorescenza appropriato. Mentre la modalità di imaging ad ampio campo consente l'imaging e l'analisi a livello cellulare, il tappeto erboso o l'illuminazione alta e bassa o ottimale per l'osservazione e il tracciamento di singole molecole. Per evitare un eccessivo fotosbiancamento delle biomolecole, assicurarsi che tutte le illuminazioni laser sul tavolino siano piuttosto spente o bloccate con un filtro opaco prima del caricamento del campione.

Inoltre, disattivare il guadagno della fotocamera E-M-C-C-G per evitare danni da sovraesposizione alla fotocamera. Per una configurazione del microscopio invertito, posizionare il sandwich Aris pad sul tavolino del microscopio con il lato coperto della cella rivolto verso il basso verso l'obiettivo inferiore. Quindi accendere la luce alogena sul lato superiore e mettere a fuoco le celle in modalità di microscopia a luce bianca trasmessa prima di accendere il laser, scattare una fotografia delle celle in modalità di trasmissione della luce bianca.

Questa foto verrà utilizzata come mappa di riferimento posizionale che correlerà le regioni di fluorescenza biomolecolare alle posizioni effettive delle cellule all'interno dello stesso campo visivo. Per la misurazione della vitalità, utilizzare un riscaldatore dell'obiettivo impostato alla temperatura ottimale e registrare immagini sequenziali dello stesso campo visivo in luce bianca ogni 30 minuti senza spostare il tavolino, disattivare l'illuminazione superiore e proteggere il campione da tutte le altre fonti di luce ambientale presenti in laboratorio. Quindi accendere la telecamera CCD e iniziare l'acquisizione dei dati.

Iniziare a registrare lo ione fluorescente appena prima di accendere l'illuminazione laser. Dopo aver eseguito la microscopia a fluorescenza, iniziare l'analisi dei dati aprendo tutte le fotografie con un software di elaborazione delle immagini come Image J per iniziare a normalizzare tutti i parametri fondamentali dell'immagine come la luminosità o il contrasto su tutte le immagini premendo il pulsante di impostazione e selezionare la propagazione a tutte le altre immagini. L'opzione uno può accertare qualitativamente se il caricamento delle celle ha avuto successo poiché le celle caricate dovrebbero essere significativamente più luminose delle celle non elettroporate utilizzate come controllo negativo per una data immagine.

Usa lo strumento di selezione a mano libera e circonda diverse regioni di fluorescenza con poligoni disegnati a mano. Confronta l'intensità della fluorescenza tra tutti i poligoni pertinenti scegliendo l'opzione di misurazione dal menu Analizza. Ripeti questo processo manualmente o utilizzando uno script automatizzato per estrarre l'intensità per pixel di tutte le celle in ciascun campione e i controlli negativi.

Quando una cella elettrolitica è caricata con una o più biomolecole fluorescenti, la sua intensità media di emissione sarà maggiore dell'intensità media di un campione di controllo negativo. Per valutare manualmente la vitalità cellulare, contare la percentuale di cellule in divisione intatte da quelle non in divisione e danneggiate. Nello stesso campo visivo per il quale i dati sono stati registrati ogni 30 minuti su diverse divisioni, non è sempre possibile contare direttamente il numero di biomolecole internalizzate per cellula, in particolare quando le biomolecole diffondono velocemente o quando le cellule sono caricate con più di cinque biomolecole marcate.

L'analisi del fotosbiancamento su base cellulare consente di valutare il numero di biomolecole marcate per cellula in tali condizioni. Utilizzando il pulsante di selezione a mano libera, tracciare il contorno di una data cella fluorescente ed estrarre e tracciare la fluorescenza della cellula grezza in funzione del tempo dovuto agli effetti del fotosbiancamento. Il grafico dell'intensità rispetto al tempo sarà una curva decrescente esponenzialmente, le celle pesantemente caricate, ma per le celle contenenti meno di 10 biomolecole, dovrebbero essere distinguibili passaggi chiari.

Calcolare l'autofluorescenza media dopo il fotobleaching calcolando la media dei valori di intensità della fluorescenza grezza vicino alla parte dell'estremità della coda piatta dell'esperimento, che potrebbe essere, ad esempio, dagli ultimi 50 a 100 fotogrammi dell'immagine nella serie time-lapse. Dopo aver determinato l'intensità di base, calcolare l'intensità del fotosbiancamento dipendente dal tempo sottraendo l'autofluorescenza di base dai dati grezzi di fluorescenza, quindi bloccare i dati di intensità del fotosbiancamento risultanti e quantizzare l'altezza di ogni passo manualmente o utilizzando un algoritmo. Questo processo dovrebbe essere ripetuto per diverse celle che presentano più di 100 passi complessivi al fine di ottenere una stima accurata dell'altezza media del passo, questo valore corrisponde all'intensità unitaria del fluoro quattro dovuta allo sbiancamento di un singolo fluoro quattro.

Infine, il numero di molecole internalizzate per cellula può essere calcolato dividendo l'intensità cellulare sottratta al basale al tempo uguale a zero per il fluoro unitario. Quattro intensità per questo protocollo di elettroporazione. La quantità di DNA o proteina marcata in fluorescenza che può essere internalizzata in batteri o lieviti può essere controllata regolando la quantità di sonde di DNA presenti all'interno del tampone di elettroporazione.

Quando il tasso di internalizzazione biomolecolare è elevato, il tempo di fotosbiancamento della biomolecola marcata, che può essere trovato tracciando prima l'intensità fluorescente in funzione del tempo e poi estraendo la sua costante di tempo esponenziale, fornisce informazioni sulla fotostabilità dei coloranti in vivo. Nel caso di bassi tassi di incorporazione, la quantizzazione dell'intensità fluorescente fornirà un mezzo per approssimare il numero totale di biomolecole all'interno di una data cellula. L'elettroporazione può essere utilizzata anche per incorporare proteine in batteri o lieviti.

Nel caso di proteine marcate in fluorescenza. Poiché i fluorofori liberi possono essere internalizzati in modo molto efficiente, è importante rimuovere tutti i fluorofori liberi e non legati in modo covalente dallo stock proteico. Infine, le molecole doppiamente marcate possono anche essere internalizzate utilizzando il nostro metodo per consentire l'osservazione del tasto di una singola molecola nelle cellule viventi per diversi secondi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare e analizzare anche i campioni di controllo come le celle non elettrolitiche, che vengono incubate con una biomolecola marcata o le cellule vuote, che non vengono né elettroporate né incubate con una molecola marcata. Questi controlli ci permettono di valutare il livello di autofluorescenza cellulare e la carenza delle fasi di lavaggio, e come tali sono necessari per valutare se l'esperimento di elettroporazione ha avuto successo dopo i suoi sviluppi. Questa tecnica ha aperto nuove strade ai ricercatori nel campo della biofisica e della terza biologia per esplorare la diffusione e il comportamento dinamico della biomolecola marcatrice nei microrganismi viventi.

E questo su una scala temporale di uno o due ordini di grandezza più lunga rispetto alle proteine autofluorescenti come le GFP. Ha trasferito la flessibilità della marcatura del d organico in vivo, rendendo gli esperimenti di minaccia di una singola molecola molto più fattibili per lo studio delle dinamiche intra e intermolecolari nelle cellule viventi.