Name: Flusso di lavoro globale per lidentificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri un flusso di lavoro globale per l'identificazione genomica e la meta-analisi dell'espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi in Vitis vinifera. Questo metodo fornisce una caratterizzazione completa della struttura genica, dei motivi proteici e dei modelli di espressione.

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Il lavoro è stato supportato dall'Università di Verona all'interno della cornice del comune progetto 2014 (caratterizzazione della famiglia del gene ATL a grapevine e del suo coinvolgimento nella resistenza alla peronospora della vite).

<ol><li>Jaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+grapevine+genome+sequence+suggests+ancestral+hexaploidization+in+major+angiosperm+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla.</a> Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).</li>
<li>Adam-Blondon, A. -F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdam-Blondon%2C+A-F+%22Genetics%2C+Genomics%2C+and+Breeding+of+Grapes%22">Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes</a>. , Science Publishers. 211-234 (2011).</li>
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<li>Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-26S+proteasome+system+at+the+nexus+of+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 385-397 (2009).</li>
<li>Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATL+Gene+Family+from+Arabidopsis+thaliana+and+Oryza+sativa+Comprises+a+Large+Number+of+Putative+Ubiquitin+Ligases+of+the+RING-H2+Type%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Evol%22%5BJournal%5D)">The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type.</a> J. Mol. Evol. 62 (4), 434-445 (2006).</li>
<li>Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+the+Architecture+of+ATLs%2C+a+Family+of+Plant+Ubiquitin-Ligases%2C+Leads+to+Recognition+and+Targeting+of+Substrates+in+Different+Cellular+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments.</a> PLoS One. 6 (8), e23934(2011).</li>
<li>Guzmán, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolific+ATL+family+of+RING-H2+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases.</a> Plant Signal Behav. 7 (8), 1014-1021 (2012).</li>
<li>Grimplet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+grapevine+gene+nomenclature+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The grapevine gene nomenclature system.</a> BMC Genomics. 15, 1077(2014).</li>
<li>Prince, V. E., Pickett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitting+pairs%3A+the+diverging+fates+of+duplicated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (11), 827-837 (2002).</li>
<li>Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+duplication+as+a+major+force+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen%22%5BJournal%5D)">Gene duplication as a major force in evolution.</a> J. Gen. 92 (1), 155-161 (2013).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Gene+Duplication+and+Their+Contribution+to+Expansion+of+Gene+Families+in+Grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 31 (4), 852-861 (2013).</li>
<li>Fasoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li>
<li>BLAST. BLAST2.6.0. , Available from:
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<li>MEGA. MEGA7.0.25 build 7170412. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.megasoftware.net/">http://www.megasoftware.net/</a> (2017).</li>
<li>MEME. MEME Suite Version 4.11.4. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://meme-suite.org/">http://meme-suite.org/</a> (2017).</li>
<li>ProtParam. ExPASy Server. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://web.expasy.org/protparam/">http://web.expasy.org/protparam/</a> (2005).</li>
<li>ngLOC v1.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html">http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html</a> (2007).</li>
<li>TargetP v1.1 Server. , Available from:
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<li>Prowler v1.2. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/">http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/</a> (2005).</li>
<li>MuSite v1.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://musite.sourceforge.net/">http://musite.sourceforge.net/</a> (2010).</li>
<li>Pfam. Pfam version 31.0. , Available from:
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<li>TMHMM v2.0c. , Available from:
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<li>Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+FCA+pre-mRNA+processing+controls+Arabidopsis+flowering+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time.</a> EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).</li>
<li>Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+cis-regulatory+element+structure+and+discovery+of+motif-driven+gene+co-expression+networks+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine.</a> DNA Res. 24 (3), 311-326 (2017).</li>
<li>Wong, D. C. J., Matus, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+Integrated+Networks+for+Identifying+New+Secondary+Metabolic+Pathway+Regulators+in+Grapevine%3A+Recent+Applications+and+Future+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities.</a> Front. Plant Sci. 8, 505(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nell'era genomica, molte famiglie geniche sono state profondamente caratterizzate in diverse specie di piante. Queste informazioni sono preliminari studi funzionali e forniscono una cornice per studiare ulteriormente il ruolo di diversi membri di una famiglia. In questo contesto, c'è anche un'esigenza di un sistema di nomenclatura che permette di identificare in modo univoco ogni membro di una famiglia, evitando la ridondanza e le confusioni che possono sorgere quando i nomi vengono assegnati in modo indipendente per div...

Durante l'ultimo decennio, molta ricerca è stata effettuata in grapevine genomica. Vigna è una coltura economicamente rilevante riconosciuta, che è diventato un modello per la ricerca sullo sviluppo di frutta e sulle risposte delle piante legnose agli stress biotici e abiotici. In questo contesto, il rilascio del genoma di Vitis vinifera c.v. PN40024 nel 20071 e la sua versione aggiornata nel 20112 ha portato a un rapido accumulo di dati "Omics"-scala e a una raffica di studi di alto-rendimento. Base ai dati pubblicati sequenza, l'analisi completa di una famiglia di dato gene (generalmente composta da proteine condividono motivi conservati, somiglianze strutturali e/o funzionali e rapporti evolutivi), possono ora essere eseguite per scoprire la funzioni molecolari, evoluzione e profili di espressione genica. Queste analisi possono contribuire alla comprensione di come le famiglie geniche controllano processi fisiologici a livello del genoma.
Molti aspetti del ciclo di vita della pianta sono regolati dalla degradazione ubiquitina-mediata di proteine chiave, che richiedono un fatturato fine-tuned per garantire regolari processi cellulari. Importanti componenti del processo di degradazione ubiquitina-dipendente sono la ligasi di ubiquitin E3, che sono responsabili della flessibilità del sistema, grazie all'assunzione di specifici obiettivi3. Di conseguenza, questi enzimi rappresentano una famiglia di geni enorme, con circa 1.400 E3 ligasi-codifica geni preveduti in Arabidopsis thaliana genoma4, ogni E3 ubiquitina ligasi che agiscono per l'ubiquitinazione delle proteine target specifici. Nonostante l'importanza del substrato specifico ubiquitinazione nella regolazione cellulare nelle piante, piccolo è conosciuto circa come è regolato il pathway di ubiquitinazione e solo in pochi casi sono state identificate proteine bersaglio. La decifrazione di tali meccanismi di specificità e regolamento si basa innanzitutto sull'identificazione e la caratterizzazione delle diverse componenti del sistema, in particolare la ligasi E3. Tra ubiquitin-ligasi, sottofamiglia ATL è caratterizzata da 91 membri identificati in a. thaliana visualizzati un anello-H2 dito dominio5,6, alcuni di loro un ruolo in difesa e ormone risposte7.
Il primo passo cruciale per definire i membri di una nuova famiglia genica è la definizione precisa delle caratteristiche familiari, quali motivi di consenso, settori chiave e le caratteristiche di sequenza della proteina. Infatti, il recupero affidabile di tutti i membri della famiglia genica basato su analisi BLAST richiede alcune caratteristiche di sequenza obbligatoria, nei domini di particolare proteina responsabile di funzione/attività della proteina, che funge da firma di proteina. Questo può essere facilitato dalla caratterizzazione precedente della famiglia del gene stesso in altre specie vegetali o ottenuto analizzando diversi geni putativamente appartenendo alla stessa famiglia in specie di piante diverse, per isolare sequenze comuni. I membri della famiglia possono singolarmente denominati seguendo regole comuni che si stabilì di consorzi internazionali per una determinata specie. A grapevine, per esempio, tale procedura è sottoposta alle raccomandazioni del Comitato Super-nomenclatura per l'annotazione del Gene dell'uva (sNCGGa), che stabilisce la costruzione di un albero filogenetico tra cui V. vinifera e a. thaliana membri della famiglia genica per consentire l'annotazione del gene basato su sequenze di nucleotidi8.
Localizzazione del cromosoma dei membri della famiglia e indagine di duplicazione genica consentire evidenziando la presenza di geni duplicati intero genoma o tandem. Tali informazioni appaiono utile per svelare le funzioni del gene presunto, poiché esso potrebbe mostrare ridondanza funzionale o rivelare situazioni differenti, cioè, non-funzionalizzazione, neo-funzionalizzazione o Sub-funzionalizzazione9. Entrambi neo - e sub - functionalization sono eventi importanti che creano novità genetica, fornendo nuove componenti cellulari per adattamento della pianta alle mutevoli ambienti10. In particolare, le duplicazioni dei geni ancestrali e produzione di nuovi geni erano molto frequenti nel corso dell'evoluzione del genoma della vite e neonate geni provenienti dalle duplicazioni prossimali e tandem a grapevine erano più probabili produrre nuovo funzioni11.
Un altro fattore chiave nel decifrare la funzione della famiglia genica è il profilo di trascrittomica. La disponibilità di banche dati pubbliche, dando accesso a un'enorme quantità di dati di trascrittomica può essere così sfruttata per assegnare funzioni putative ai membri della famiglia genica utilizzando su larga scala in silico analisi di espressione. Infatti, la peculiare espressione di alcuni geni negli organi vegetali specifiche o in risposta a determinate sollecitazioni possa dare alcuni suggerimenti per quanto riguarda i presunti ruoli delle proteine corrispondenti in condizioni definite e dare sostegno alle ipotesi sulle possibili Sub-funzionalizzazione dei geni duplicati per rispondere alle diverse sfide. A tale scopo, è importante prendere in considerazione diversi set di dati: questi possono essere già disponibili gene matrici di espressione, come l'Atlante di trascrittomica genoma della vite organi e fasi di sviluppo12, o possono essere costruiti ad hoc di recupero di trascrittomica DataSet per la specie di pianta particolare definito sollecitato. Inoltre, un approccio semplice utilizzando due matrici, una con dati pairwise somiglianza e l'altra con coefficienti pairwise co-espressione può essere applicati per valutare le relazioni tra modelli di somiglianza ed espressione di sequenza all'interno di una famiglia di geni.
Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un approccio globale, definizione di struttura del gene, conservato proteina motivi, posizione cromosomica, duplicazioni del gene e modelli di espressione, come anche la previsione di siti di localizzazione e fosforilazione di proteine, per raggiungere un esauriente caratterizzazione di una famiglia di geni in piante. Un tale approccio globale viene applicato qui alla caratterizzazione della famiglia ATL E3 ubiquitina ligasi a grapevine. Secondo il ruolo emergente dei membri sottofamiglia ATL nella regolazione dei processi cellulari chiave7, questo lavoro può anche aiutare l'identificazione dei forti candidati per studi funzionali e finalmente svelare i meccanismi molecolari che regolano la adattamento di questa coltura importante al suo ambiente.

<table><tbody><tr><td>Personal computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>Analisi genetica evolutiva molecolare (MEGA)</td><td></td><td></td><td>http://www.megasoftware.net/</td></tr> Strumenti <tr><td>di analisi di sequenze basati su motivi (MEME)</td><td></td><td></td><td>http://meme-suite.org/</td></tr> <tr><td>Geneious</td><td>Biomatters Limited</td><td></td><td>http://www.geneious.com/</td></tr> <tr><td>ProtParam Tool</td><td></td><td></td><td>http://web.expasy.org/protparam/</td></tr> <tr><td>ngLOC</td><td></td><td></td><td>http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html</td></tr><tr><td>TargetP v1.1 Server</td><td></td><td></td><td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/</td></tr> <tr><td>Protein Prowler</td><td></td><td></td><td>http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/</td></tr> <tr><td>MUsite</td><td></td><td></td><td>http://musite.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>Pfam</td><td></td><td></td><td>http://pfam.xfam.org/</td></tr> <tr><td>TMHMM Server v. 2.0</td><td></td><td></td><td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td></tr> <tr><td>ProtScale</td><td></td><td></td><td>http://web.expasy.org/protscale/</td></tr> <tr><td>Database del genoma dell'uva (CRIBI)</td><td></td><td></td><td>http://genomes.cribi.unipd.it/grape/</td></tr> <tr><td>PhenoGram</td><td></td><td></td><td>http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot</td></tr><tr><td>MCScanX</td><td></td><td></td><td>http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/</td></tr> <tr><td>Albero della Vita Interattivo (iTOL)</td><td></td><td></td><td>http://itol.embl.de/</td></tr> <tr><td>UniProt</td><td></td><td></td><td>http://www.uniprot.org/</td></tr> <tr><td>Phylogeny.fr</td><td></td><td></td><td>http://www.phylogeny.fr/index.cgi</td></tr><tr><td>MUSCLE</td><td></td><td></td><td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/</td></tr> <tr><td>Gblocks Server</td><td></td><td></td><td>http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html</td></tr><tr><td>Vitis vinifera cv. Corvina espressione genica Atlas datamatrix</td><td></td><td></td><td>https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012</td></tr><tr><td>Visualizzatore multi-esperimento (MeV)</td><td></td><td></td><td>http://mev.tm4.org/#/welcome</td></tr><tr><td>Sequence Read Archive (SRA)</td><td></td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>EMBOSS Needle (EMBL-EBI)</td><td></td><td></td><td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/</td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la meta-analisi di espressione della famiglia genica atl e3 ubiquitina ligasi a grapevine

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Classificazione e nomenclatura dei geni in una famiglia può contribuire significativamente alla descrizione della diversità delle proteine codificate e alla previsione delle funzioni di famiglia basato su diverse funzionalità, come la presenza di motivi di sequenza o di particolare siti per modificazione post-traduzionale e il profilo di espressione dei membri della famiglia in condizioni diverse. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per la caratterizzazione dei geni familiari. Qui, la procedura viene applicata per la caratterizzazione della famiglia Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi a grapevine. I metodi includono l'identificazione del genoma di membri della famiglia, la caratterizzazione del gene localizzazione, struttura e duplicazione, l'analisi dei motivi della proteina conservata, la previsione dei siti di localizzazione e la fosforilazione delle proteine, nonché espressione genica in tutta la famiglia in diversi set di dati. Tale procedura, che potrebbe essere esteso a ulteriori analisi a seconda gli scopi sperimentali, potrebbe essere applicato a qualsiasi famiglia genica in qualsiasi specie di piante per i quali sono disponibili dati genomici e fornisce informazioni utili per identificare i candidati interessanti per gli studi funzionali, dando comprensioni nei meccanismi molecolari dell'adattamento della pianta al loro ambiente.

Il gene VIT_05s0077g01970, identificato come il più simile a a. thaliana ATL2 (At3g16720) attraverso una ricerca di BLASTp, fu usato come sonda per rilevare i membri della famiglia ATL del genoma della vite (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). L'analisi di PSI-BLAST convergenti dopo alcuni cicli rivelando una lista di geni putativi appartenendo alla famiglia del gene ATL grapevine (Figura 1A). La presenza del dominio canonico anello-H2 per o...

Questo articolo descrive la procedura per l'identificazione e la caratterizzazione di una famiglia di geni a grapevine applicato alla famiglia di Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi.

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una caratterizzazione esaustiva di una famiglia genica nelle piante con un approccio globale che includa la definizione della struttura genica, i motivi proteici interessati, la posizione cromosomica, le duplicazioni geniche e i modelli di espressione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella classificazione delle piante in famiglie, come l'identificazione genomica mondiale dei membri della famiglia e la loro trascrittomia fornisce questo attraverso l'analisi dell'espressione genica. Il vantaggio principale dell'intera procedura è quello di fornire un elenco esaustivo di passaggi sperimentali per ottenere una caratterizzazione completa della famiglia genica.Questa procedura può essere applicata a qualsiasi famiglia genetica di qualsiasi specie vegetale per la quale sono disponibili dati genetici. Inoltre, questo approccio fornisce informazioni preziose per identificare candidati interessanti per gli studi funzionali. A dimostrare l'intera procedura sarà Pietro Ariani del mio laboratorio.Apri la pagina web Blast e fai clic sulla sezione dell'esplosione proteica. Nel campo Inserisci sequenza di query, immettere la sequenza di amminoacidi della proteina che verrà utilizzata come sonda per identificare gli altri membri della famiglia. Utilizzare una proteina che abbia tutte le caratteristiche importanti che caratterizzano la famiglia.Successivamente, nel campo scegli set di ricerca, seleziona la banca dati proteica di riferimento e l'organismo di interesse. Ora, nella selezione del programma sul campo, selezionare l'algoritmo PSI-BLAST. Se lo si desidera, fare clic sui parametri dell'algoritmo per regolare i parametri avanzati come la sequenza target massima e la matrice di punteggio.Il valore E è la soglia, che per questa ricerca viene ridotta da 005 a 001. Fare clic sul pulsante BLAST per eseguire l'analisi. Da tutte le sequenze che mostrano corrispondenze relative alla query, deselezionare le voci che chiaramente non appartengono alla famiglia.Fallo facendo clic sul segno di spunta nella colonna di selezione per PSI-BLAST. Quindi, esegui una seconda iterazione PSI-BLAST facendo clic sul pulsante Vai. Tutte le sequenze appena identificate saranno evidenziate in giallo.Anche in questo caso, deselezionare i risultati che non appartengono alla famiglia. Continuare questo processo fino a quando l'algoritmo non trova alcuna voce rilevante o raggiunge la convergenza. Una volta eliminati tutti i falsi positivi, raccogli le sequenze di amminoacidi in un file formattato FASTA e carica il file nella suite di software bioinformatici.Quindi, seleziona tutte le sequenze importate nell'elenco e fai clic sul pulsante di allineamento/assemblaggio nella barra degli strumenti. Quindi fare clic su allineamento multiplo a coppie e selezionare Allineamento MUSCOLARE e OK. L'allineamento verrà ora effettuato utilizzando le impostazioni predefinite. Ora visualizza il logo della sequenza dell'allineamento e ispeziona visivamente i geni per cercare falsi positivi.Ulteriori analisi dei parametri fisici e dei domini delle proteine, della distribuzione cromosomica, delle duplicazioni e dell'organizzazione dell'introne dell'esone sono descritte nel protocollo testuale. Successivamente analizzare le relazioni tra i membri della famiglia ATL attraverso la costruzione di un albero filogenetico di alta qualità e la definizione di una nomenclatura familiare. In primo luogo, recuperare le sequenze ATL arabe adopt systelliana, richieste come riferimenti per la nomenclatura di un gene della vite, dal database UmoProt come riferimento.Successivamente realizzare un file FASTA comprendente tutte le sequenze nucleotidiche della vite e i membri della famiglia genica Arabidopsis per l'analisi filogenetica. Ora sfoglia la home page di phylogeny France e seleziona la pipeline di analisi della filogenesi. Un clic è adatto nella maggior parte dei casi, ma se necessario, è possibile selezionare impostazioni avanzate specifiche utilizzando le opzioni avanzate o anche un'analisi completamente personalizzata utilizzando le opzioni à la carte.Quindi, inserisci un nome per l'analisi e carica il file FASTA. Quindi fare clic su Invia per eseguire l'analisi. Se questa procedura genera un messaggio di errore, completare singolarmente ogni passaggio della pipeline della suite filogenetica.Innanzitutto, vai alla home page del software MUSCLE e carica il file FASTA. Seleziona Pearson FASTA come formato di output e invia. Successivamente, scarica il file in formato FASTA ed elimina eventuali posizioni mal allineate.Apri lo strumento del server G-block, carica il file FASTA di allineamento, seleziona DNA come tipo di sequenza e scegli il rigore che meglio si adatta all'analisi. Per un allineamento della famiglia genica ATL della vite, selezionare tutte e tre le opzioni proposte per una selezione meno rigorosa a causa dell'elevata divergenza di sequenza. Quindi fare clic su Ottieni blocchi per eseguire l'analisi.Per salvare i risultati, fare clic sull'allineamento risultante nella parte inferiore della pagina di output e creare un nuovo file FASTA. I blocchi G eliminano la posizione mal allineata nelle regioni divergenti di un DNA o l'allineamento di pungolo in modo che diventi più adatto per un'analisi filogenetica. Per questo passaggio, la selezione dei parametri impericle per il rigore delle colonne è fondamentale per garantire che siano una passività delle tre.Per completare l'albero, ci rivolgiamo alla home page di Phylogeny France. Lì, seleziona la pipeline à la carte e deseleziona le seguenti opzioni: allineamento multiplo e cura dell'allineamento. Quindi, fai clic su crea flusso di lavoro, carica il file FASTA curato da G-blocks, seleziona la procedura di bootstrap e utilizza i parametri e le impostazioni predefiniti.Infine, fai clic su Invia per eseguire l'analisi. Questo completa il processo passo dopo passo. Ora che l'albero filogenico è stato creato, collassare i rami scarsamente supportati con valori di bootstrap inferiori al 70%Quindi scaricare i risultati finali nel formato Newick per ulteriori analisi.Il protocollo testuale fornisce istruzioni su come assegnare un nome genetico in base alla filogenesi. Per questo protocollo, creare un file in formato testo filettato, lineato e di valori di espressione normalizzati da arma presi da una libreria di espressione genica. Organizza i valori per ogni gene della famiglia sotto le stesse righe del modello.Successivamente, esegui l'analisi gerarchica bi-clustered utilizzando il software di visualizzazione multi-esperimento. Innanzitutto, carica la matrice di dati di lavoro e seleziona il file di testo. Selezionare l'array monocolore e rimuovere il segno di graduazione dall'annotazione di caricamento quando non viene fornita un'annotazione automatica.Selezionare il valore dell'espressione più in alto a sinistra dell'anteprima della tabella delle espressioni e fare clic sul pulsante di caricamento. Quindi, regolare i dati, applicando la trasformazione Log2 e la normalizzazione di geni/righe. Quindi impostare il limite di scala corretto.Ora calcola il clustering gerarchico. Nel campo di ottimizzazione dell'ordinazione, selezionare ottimizza l'ordine delle foglie del gene e ottimizza l'ordine delle foglie del campione. Successivamente, nel campo di selezione del metodo di collegamento, selezionare il clustering del collegamento medio e nel campo di selezione della matrice di distanza scegliere Correlazione di Pearson.Quindi fare clic su OK per eseguire l'analisi. Visualizza i risultati nel pannello di sinistra della finestra ed esporta la mappa di calore facendo clic su Salva immagine nel menu file. Il gene più simile all'arabidopsis thaliana ATL2, secondo una ricerca BLAST-P, è stato utilizzato per esaminare i membri della famiglia ATL nel genoma della vite.L'analisi PSI BLAST è convergente dopo alcuni cicli, fornendo un elenco di geni putativi nella famiglia dei geni. La presenza del dominio H2 dell'anello canonico per ciascun candidato è stata valutata mediante l'ispezione visiva dell'allineamento MUSCLE. Questo ha ristretto la ricerca a 96 geni della vite.Per una nomenclatura è stata utilizzata un'analisi filogenetica dei geni identificati confrontandoli con la famiglia di geni ATL dell'arabidopsis. 13 dei 96 ATL della vite hanno ricevuto un identificatore specifico come ortologo del gene ATL dell'arabidopsis. La mappatura dei geni identificati nell'atlante globale dell'espressione genica della vite utilizzando un'analisi gerarchica bi-clustered ha mostrato che tutti i 96 sono espressi in almeno un tessuto e cinque cluster di espressione possono essere identificati.Un approccio simile è stato applicato per studiare l'espressione di questi geni in risposta a stress biotici. C'è stato un coinvolgimento diretto della famiglia di geni ATL in risposta all'infezione da patogeni con 62 geni che hanno mostrato una modulazione significativa in almeno due condizioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire i software utilizzati per caratterizzare una famiglia di geni.Durante il tentativo di questa procedura, è importante definire attentamente le caratteristiche di una determinata famiglia di geni e la sonda corrispondente utilizzata per l'identificazione dell'intero membro della famiglia del genoma. Seguendo questa procedura, è possibile studiare l'evoluzione della famiglia genica e la funzione di P30 realizzando ulteriori alberi filogenetici basati su alcune specie diverse da quelle richieste per l'attribuzione della nomenclatura delle famiglie geniche.

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Flusso di lavoro globale per lidentificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine (Video) | JoVE Journal

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

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