Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR
30 luglio 2011
Analisi microarray è stato condotto per determinare profili di espressione genetica C. elegans, E real-time PCR è stato utilizzato per convalidare e quantificare i dati di microarray.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare i profili di espressione genica alla base di numerosi fenotipi o vie metaboliche. Ciò si ottiene isolando prima l'mRNA da due ceppi di nematodi contrastanti. Il secondo passo della procedura consiste nel sintetizzare CD NA contenente sequenze di cattura S, SI, tre o SFI e ibridarle in un microarray.
La terza fase della procedura consiste nell'ibridare il microarray con sequenze anti cattura contenenti S SI tre e SCIFI fluoro quattro. La fase finale della procedura consiste nella scansione del microarray e nell'analisi dei dati utilizzando strumenti bioinformatici come il software magic tool. In definitiva, i geni candidati che mediano il fenomeno biologico in esame vengono identificati e possono essere convalidati e quantificati con tecniche alternative come la PCR in tempo reale.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché i nucleotidi maculati non sono visibili all'utente, quindi è difficile sovrapporre una miscela di ibridazione omogenea agli oltre 23.000. Nucleotidi stampati in modo univoco Iniziate raccogliendo l'RNA da nematodi sincronizzati sani. In primo luogo, vengono lavati risospesi in tubi da 15 millilitri e i pellet di vermi pellettati vengono risospesi in sette millilitri di cloruro di sodio 0,1 molare e sette millilitri di saccarosio ghiacciato, 60% in peso per volume.
Dopo un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio, i vermi vengono nuovamente pellettati. Ora i vermi privi di batteri nuotano verso l'alto, vengono raccolti, lavati in RNA, acqua libera e pellettati. Anche in questo caso, il pellet pulito e compattato viene trasferito in una provetta da microcentrifuga fatta girare alla massima velocità per 30 secondi.
Aspirato e conservato in 10 volumi di RNA successivamente a quattro gradi Celsius fino al momento di procedere. Per preparare campioni di RNA totale, centrifugare i pellet preparati alla massima velocità, scartare il supernat e aggiungere un pizzico di resina di macinazione molecolare al pellet. Quindi congelare la miscela utilizzando azoto liquido utilizzando un pestello.
Macinare la sospensione di verme congelata in una polvere fine ad, azoto liquido secondo necessità per mantenere la polvere fredda dopo la macinazione. Mettere l'estratto sul ghiaccio per cinque minuti. Dopo cinque minuti, mescolare l'estratto con 700 microlitri di R-L-T-B-M-E e 472 microlitri di etanolo al 100% totale.
L'RNA può ora essere isolato utilizzando un kit disponibile in commercio fino a un volume finale di 60 microlitri di RNA isolato per campione biologico. Prima di procedere, rimuovere la potenziale contaminazione del DNA genomico trattandola con DNAS one, seguita dall'uso di un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio. Completa il kit alludendo ad un volume di 60 microlitri.
Infine, determinare la concentrazione di RNA e valutare l'integrità dell'RNA mediante trattamento con caricamento del campione di gliossale, analisi del colorante e del gel prima dell'ibridazione con microarray Utilizzando metodi convenzionali, l'RNA purificato viene trascritto in DNA complementare, che viene purificato dal modello degradato con un kit disponibile in commercio e alluso a un volume di 60 microlitri. Inizia l'ibridazione del microarray bloccando l'eleganza del mare. Vetrini microarray con DNA di sperma di salmone sonicato Dopo un'ora, rovesciare i vetrini bloccati in acqua distillata doppia e centrifugare.
Asciugare i vetrini in tubi conici da 50 millilitri imbottiti con una salvietta kim. Ora prepara un tampone di ibridazione a base di ammide a due forme x. Per prima cosa, scaldalo a 55 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente i suoi cristalli.
Quindi centrifugare per un minuto a 10.000 g. Quindi, mescola 25 microlitri di CD NA con 25 microlitri di tampone di ibridazione e mescola delicatamente la miscela. Ora esegui una rapida centrifuga della miscela e incubala a 80 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, pipettare con cura l'intero campione di CDNA sul vetrino del microarray senza toccare il vetrino. Per distribuire uniformemente il campione sul vetrino del microarray. Abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino utilizzando un ago per siringa prima che il vetrino coprioggetti sia completamente abbassato, tirare indietro verso l'alto e abbassare nuovamente con l'ago lasciando che il vetrino coprioggetti cada delicatamente in posizione.
Questa tecnica riduce al minimo la formazione di bolle d'aria. Ora posizionare il vetrino orizzontalmente in un tubo conico da 50 millilitri sotto il vetrino a 50 microlitri di acqua distillata doppia e lasciarlo incubare per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Una seconda ibridazione viene eseguita brevemente dopo il lavaggio del vetrino.
Più volte in SSC, il secondo tampone, che contiene reagenti di cattura sensibili alla luce e un reagente Antifa, viene applicato utilizzando la stessa tecnica, seguito da una breve incubazione, più lavaggi e asciugatura. Il vetrino può quindi essere scansionato. Le immagini possono essere analizzate utilizzando il software gratuito con lo strumento magico open source.
Brevemente nella scheda del progetto, creare e salvare un nuovo progetto nella scheda del profilo dell'espressione di compilazione, selezionare carica coppia di immagini e selezionare il file di immagine rosso come rosso e il file di immagine verde come verde. Selezionare quindi la scheda del profilo dell'espressione di compilazione. Scegli carica elenco geni per caricare un file di elenco genico C elegance ottenuto dal sito Web GCAT per indirizzare e grigliare l'immagine del microarray.
Selezionare la scheda del profilo dell'espressione di compilazione e creare l'opzione di modifica della griglia. Ora modifica la griglia. Imposta la finestra di dialogo utilizzando 48 per il numero di griglie, 22 righe e 22 colonne per ogni griglia e scegliendo di numerare i punti da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
Aumenta la percentuale di variazione del contrasto e ingrandisci la griglia fino a quando i singoli punti non sono facilmente distinguibili. Crea le griglie selezionando imposta punto in alto a sinistra nel pannello di sinistra e quindi facendo clic sul centro del punto in alto a sinistra, seguito dal punto in alto a destra e dalla riga in basso sulla griglia uno. Ripetere questa procedura di grigliatura per ciascuna delle 48 griglie procedendo da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
Quindi salva selezionando la scheda file e salva la griglia corrente come una volta salvata. Selezionate la scheda finita per eliminare dall'analisi tutti i punti non correlati. Aprire la scheda del profilo dell'espressione di compilazione e nell'opzione griglia di indirizzamento selezionare contrassegno spot.
Ora contrassegna eventuali macchie di strisce o fluorescenza di fondo e salva selezionando Salva bandiere correnti. Come nella scheda file, i file contrassegnati devono essere segmentati. Infine, analizza i geni indotti o repressi da un fattore specificato selezionando Esplora nella scheda Espressione.
Nella finestra di dialogo di esplorazione, imposta i criteri di corrispondenza dei geni fini. Il numero di raddoppia aumenta o diminuisce nell'espressione. L'intensità è nota come x e il valore di X è il criterio per il cambiamento di espressione.
X è l'input sotto il valore massimo maggiore di X per i geni indotti e il valore minimo inferiore a x per i geni repressi. In questo esperimento, viene eseguito un controllo di scambio di colorante: i due isolamenti indipendenti di RNA totale dallo stadio tre e dallo stadio quattro delle larve vengono ibridati come mutante verde rispetto al tipo selvatico rosso, mentre il mutante rosso rispetto al tipo selvatico verde per confermare i cambiamenti di espressione genica effettua tre isolamenti indipendenti di RNA totale utilizzando la stessa procedura per sintetizzare il CDNA con un kit disponibile in commercio, e per ogni campione di CD NA eseguire la PCR in tempo reale e triplicare utilizzando tre geni di housekeeping come controlli. A scopo dimostrativo, i seguenti risultati esaminano l'espressione genica indotta in VSM one.
AK 1468 mutanti, un ceppo di nematode caratterizzato da un aumento sinaptico Prima di eseguire l'analisi dei microarray, la qualità dell'RNA estratto viene controllata mediante elettroforesi su gel. La presenza di due subunità ribosomiali intatte prima e dopo il trattamento con dase one è indicativa di un buon campione di RNA nel microarray wild type CDNA è marcato in rosso e VSM one mutant CD NA è etichettato in verde. In questa delle 48 griglie analizzate per microarray, ogni piccolo quadrato rappresenta un singolo oligonucleotide stampato in ogni array, ogni singolo oligonucleotide è rappresentato.
Una volta che l'analisi microarray dei trascritti isolati dalle larve al quarto stadio mostra che i geni che codificano per le principali proteine spermatiche o MSP sono indotti nei mutanti VSM uno, l'analisi microarray delle larve al terzo stadio rivela anche cambiamenti di espressione all'interno della stessa famiglia genica nel mutante. Collaudo. Le previsioni del microarray mediante analisi PCR in tempo reale rivelano che un membro della famiglia del gene M ms P, MS P 32, è indotto nei mutanti VSM one. I dati rappresentano la media di tre repliche di PCR in tempo reale dalla stessa raccolta di RNA.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire gli strumenti bioinformatici per l'analisi dell'intero genoma, soprattutto considerando che ci sono molti programmi software bioinformatici open source disponibili per la comunità scientifica.
Panoramica
Questo studio investiga i profili di espressione genica in C. elegans utilizzando l'analisi del microarray e la PCR in tempo reale per la validazione. La metodologia prevede l'isolamento dell'mRNA da diverse linee di nematodi per comprendere i fenomeni biologici sottostanti.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Tecnologia dei microarray
Contesto
- C. elegans serve come organismo modello per studiare l'espressione genica.
- L'analisi del microarray permette l'esame di migliaia di geni simultaneamente.
- La PCR in tempo reale viene utilizzata per confermare i risultati del microarray.
- Comprendere l'espressione genica può chiarire le vie metaboliche e i fenotipi.
Obiettivo dello studio
- Identificare i geni candidati coinvolti in specifici processi biologici.
- Validare i dati del microarray tramite PCR in tempo reale.
- Migliorare la comprensione dell'espressione genetica nei nematodi.
Metodi utilizzati
- Isolamento dell'mRNA da linee di nematodi contrastanti.
- Sintesi di cDNA e ibridazione sui microarray.
- Utilizzo di strumenti bioinformatici per l'analisi dei dati.
- Validazione dei risultati tramite PCR in tempo reale.
Risultati principali
- Identificazione di geni candidati che mediano fenomeni biologici.
- Validazione con successo dei dati del microarray con PCR in tempo reale.
- Approfondimenti sui profili di espressione genica tra diverse linee.
- Utilizzo di strumenti bioinformatici per un'analisi completa dei dati.
Conclusioni
- Lo studio fornisce una struttura per analizzare l'espressione genica in C. elegans.
- La PCR in tempo reale serve come metodo di validazione efficace per i risultati del microarray.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi genetici nei nematodi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to profile gene expression changes in model organisms, supporting target validation by identifying differentially expressed genes linked to phenotypic outcomes. By combining microarray screening with real-time PCR confirmation, it provides a scalable approach for mechanistic de-risking in early discovery, helping prioritize targets with stronger predictive confidence before lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing gene expression shifts associated with enhanced synaptic connectivity in mutant models.
- Operational Value: Enables pathway clarification through systematic screening of thousands of genes to pinpoint candidates like MSP-32 for further functional study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming gene induction via orthogonal real-time PCR validation.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through dye-swap controls and triplicate measurements, reducing false positives in target identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking synaptic phenotypes to MSP signaling pathways, which have conserved roles in neuromuscular junction regulation across species.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker exploration by identifying secreted signaling molecules like MSPs that may serve as measurable indicators of pathway activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, where expression profiling informs target selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by connecting genetic perturbations to molecular phenotypes through expression profiling.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via microarray intensity measurements and real-time PCR quantification, enabling condition comparisons.
- Analytics: Highlights bioinformatic-driven readouts such as fold-change thresholds and statistical significance, aiding in hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying evolutionarily conserved signaling families (e.g., MSP/Eph) with relevance to human synaptic biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic responses across diverse phenotypes, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by validating microarray hits with real-time PCR, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through standardized RNA isolation, labeling, and hybridization protocols applicable across strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-modal evidence (transcriptomic + qPCR) for target prioritization, lowering late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by distinguishing robust expression changes from noise, supporting data-driven resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques to ensure sample integrity and data quality.
- Dependent on access to microarray scanners, bioinformatic software (e.g., Magic Tool), and real-time PCR instrumentation for end-to-end execution.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for RNA isolation, labeling, and data analysis to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or tissue types due to variability in RNA yield and hybridization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for technical skill in grid alignment and spot flagging during microarray analysis, which can affect data accuracy if not performed correctly.
