Name: Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri l'analisi dei profili di espressione genica in C. elegans utilizzando microarray e PCR in tempo reale. Questo metodo computazionale consente di identificare e validare geni candidati coinvolti in fenomeni biologici specifici.

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Questo lavoro è stato eseguito da studenti universitari a sud-ovest Oklahoma State University, OK Weatherford. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT e OCAST HR09-137S. L&#39;(ok1468) vsm1 mutante è stato isolato dal Consorzio Knockout Gene Oklahoma. Gli autori ringraziano Dan Stefanovic e Tanner Wheeler per il loro aiuto prezioso durante l&#39;esecuzione del progetto.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo studio abbiamo sviluppato un semplice protocollo facile da usare che può essere usato per determinare profili di espressione genica di base vari fenomeni biologici. In questo protocollo, l&#39;RNA totale è stato isolato e trattato con DNasi I. Il nostro metodo di isolamento dell&#39;RNA è stata notevolmente semplificata dall&#39;eliminazione fenolo e l&#39;utilizzo di resine affinità per ripulire 5,6. In breve, C. elegans cuticule membrane cellulari e sono state incrinate, aperto da nematodi congelamento con azoto liquido e rettifica con resina molecolare. Successivamente, l&#39;RNA estratto è stato trattato con DNasi I prima sintesi del DNA. Il passaggio successivo è stato aggiunto a minimizzare ibridazioni aspecifiche; campioni di RNA contaminato da DNA genomico potrebbe introdurre interferenze e producono molti falsi positivi. Poi, tipo selvatico e VSM-1 (ok1468) cDNA mutanti sono stati taggati con Cy3 e Cy5 sequenze di acquisizione e ibridato su C. microarray elegans ottenuti tramite il programma GCAT. Questo sistema è più sensibile rispetto a prodotti simili, e il suo sofisticato disegno bicolore diminuisce il numero di array necessari, con conseguente maggiore efficienza dei costi di tempo e 7,8. Inoltre, questo sistema non richiede attrezzature specializzate di altri sistemi simili, quindi, questa procedura potrebbe essere realizzato in qualsiasi ambiente standard di laboratorio 7. In terzo luogo, le immagini fluorescenti serie ibridata sono stati analizzati utilizzando il software a sorgente aperto MAGICTool, e profili di espressione genica sono stati creati. MAGICTool è un programma di facile uso che può essere facilmente utilizzato da individui di ogni livello di esperienza, dalla laurea al post-dottorato. Tuttavia, la performance ottimale richiede grande disponibilità di memoria. Infine, geni candidati ottenuti con l&#39;analisi microarray sono state validate con PCR in tempo reale. Anche se l&#39;approccio genomico è un metodo efficace per studiare fenomeni biologici, ci sono alcune limitazioni si dovrebbe prendere in considerazione. In primo luogo, nonostante la specificità di questo protocollo microarray, trascrizioni all&#39;interno di una famiglia sono indistinguibili l&#39;uno dall&#39;altro se il oligonucleotide stampata è tratto da sequenze conservate. PCR in tempo reale compensa somiglianze all&#39;interno di una famiglia di geni e può anche distinguere tra isoforme specifiche dello stesso gene. Tuttavia, con PCR in tempo reale è una sfida per trovare controlli vero che sono espressi allo stesso modo per tutta la durata della vita di un organismo. A causa di questo, i risultati saranno relativi. Un approccio proteomico è una alternativa alla nostra tecnica. Singole proteine ​​possono essere isolate mediante gel elettroforesi 2D e identificati con la spettrometria di massa. I nostri studi mostrano in particolare che molti membri delle principali proteine ​​dello sperma (MSP) famiglia sono indotti a VSM-1 nematodi mutante con una maggiore densità sinaptica. MSP sono unici a C. elegans e sono responsabili della maturazione dell&#39;ovocita e l&#39;ovulazione. Chai 1 ha dimostrato che la regolamentazione del numero Bouton presinaptica e la dimensione a livello della giunzione neuromuscolare nei moscerini della frutta è probabile controllato da molecole contenenti principali domini delle proteine ​​dello sperma. Studi di Tsuda e colleghi hanno dimostrato due principali domini di proteine ​​dello sperma possono servire come leganti per i recettori Ephrine, innescando cascate della tirosin-chinasi del recettore di segnalazione. Inoltre, l&#39;analisi real time PCR convalidato e ristretto i risultati dei microarray a un membro della famiglia msp, msp-32. Nel loro insieme, il lavoro qui presentato rappresenta un genoma analisi di un dilemma centrale neuroscienze così come la potenza di ricerca universitari nello sforzo scientifico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Catalogo </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Più tardi dell&#39;RNA </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molecolare resina Rettifica </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNasi-free Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / Running Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Gliossale campione colorante di caricamento </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNasi set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT enzimi e tampone di reazione 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Tranciati Salmone DNA dello sperma </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS Soluzione </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript Kit di sintesi del DNA </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determinare profili di espressione genetica in c. elegans utilizzo microarray e real-time pcr

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Sinapsi sono composti da una zona presinaptica attivo nella segnalazione cellulare e un terminale postsinaptici nella cella di destinazione. Nel caso di sinapsi chimiche, i messaggi vengono trasportati da neurotrasmettitori rilasciati dai terminali presinaptici e ricevuti dai recettori sulle cellule postsinaptici. Le nostre ricerche precedenti in Caenorhabditis elegans ha dimostrato che VSM-1 regola negativamente esocitosi. Inoltre, l&#39;analisi di sinapsi in VSM-1 mutanti hanno mostrato che gli animali privi di una connettività completamente funzionale VSM-1 sono aumentati sinaptica. Sulla base di questi risultati preliminari, abbiamo ipotizzato che C. elegans VSM-1 può giocare un ruolo cruciale nella sinaptogenesi. Per verificare questa ipotesi, a doppio etichettati analisi microarray è stata eseguita, e profili di espressione genica sono stati determinati. In primo luogo, l&#39;RNA totale è stato isolato, inversamente trascritto in cDNA, e ibridato al DNA microarray. Poi, in silico-analisi di ibridazione sonda fluorescente rivelato induzione significativo di molti geni che codificano per i membri della famiglia principali proteine ​​dello sperma (MSP) in mutanti con sinaptogenesi migliorata. MSP è il principale componente di sperma in C. elegans e sembrano segnale maturazione degli ovociti nematodi e l&#39;ovulazione. Nel moscerino della frutta, Chai e colleghi hanno dimostrato che 1 MSP-come le molecole regolano il numero e la dimensione bouton presinaptica a livello della giunzione neuromuscolare. Inoltre, l&#39;analisi eseguita da Tsuda e collaboratori due suggerito che MSP può agire come leganti per i recettori Ef e innescare tirosin-chinasi del recettore cascate di segnalazione. Infine, l&#39;analisi PCR in tempo reale corroborata che il gene che codifica per MSP-32 è indotta a VSM-1 (ok1468) mutanti. Nel loro insieme, la ricerca effettuata dal nostro laboratorio ha dimostrato che VSM-1 mutanti hanno un significativo aumento della densità sinaptica, che potrebbe essere mediata da MSP-32 di segnalazione.

Analisi microarray è stato condotto per determinare profili di espressione genetica<em&gt; C. elegans</em&gt;, E real-time PCR è stato utilizzato per convalidare e quantificare i dati di microarray.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Le sinapsi sono composte da una zona attiva presinaptica nella cellula segnalatrice e da un terminale postsinaptico nella cellula bersaglio. Nel caso delle sinapsi chimiche, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i profili di espressione genica alla base di numerose fenotipi o vie metaboliche. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto l'mRNA da due ceppi di nematodi contrastanti. Il secondo passaggio della procedura consiste nella sintesi di CD NA contenente sequenze di cattura S SI tre o SFI e nell'ibridazione a un microarray.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'ibridare il microarray con sequenze anti-cattura contenenti S SI tre e SCIFI fluoro quattro. L'ultimo passaggio della procedura è scansionare il microarray e analizzare i dati utilizzando strumenti bioinformatici come il software magic tool. In definitiva, i geni candidati che mediano il fenomeno biologico sotto indagine vengono identificati e possono essere convalidati e quantificati mediante tecniche alternative come la PCR in tempo reale.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché i nucleotidi marcati non sono visibili all'utente, rendendo difficile sovrapporre in modo omogeneo la miscela di ibridazione ai più di 23.000 nucleotidi stampati in modo univoco. Iniziare raccogliendo l'RNA da nematodi sani e sincronizzati. Prima, vengono lavati e risospesi in provette da 15 millilitri e i pellet di vermi ottenuti vengono risospesi in sette millilitri di cloruro di sodio 0,1 molare e sette millilitri di saccarosio al 60% peso/volume, freddo di ghiaccio.Dopo un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio, i vermi vengono centrifugati nuovamente. A questo punto, i vermi privi di batteri risalgono in sospensione, vengono raccolti, lavati in acqua priva di RNAsi e centrifugati. Ancora una volta, il pellet pulito e leggermente compatto viene trasferito in una provetta da microcentrifuga e centrifugato alla velocità massima per 30 secondi.Aspirare e conservare in 10 volumi di RNA later a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Per preparare i campioni di RNA totale, centrifugare i pellet preparati alla velocità massima, eliminare il soprannatante e aggiungere una piccola quantità di resina per macinazione molecolare al pellet. Successivamente, congelare la miscela utilizzando azoto liquido e un pestello.Macinare la sospensione di vermi congelati in una polvere fine, aggiungendo azoto liquido secondo necessità per mantenere fredda la polvere dopo la macinazione. Mettere l'estratto sul ghiaccio per cinque minuti. Dopo cinque minuti, mescolare l'estratto con 700 microlitri di R-L-T-B-M-E e 472 microlitri di etanolo al 100% in totale.L'RNA può ora essere isolato utilizzando un kit disponibile in commercio fino a un volume finale di 60 microlitri di RNA isolato per campione biologico. Prima di procedere, rimuovere la possibile contaminazione da DNA genomico trattando con DNAS one, seguito dall'uso di un kit di purificazione dell'RNA disponibile in commercio. Completare il kit facendo riferimento a un volume di 60 microlitri.Infine, determinare la concentrazione di RNA e valutare l'integrità dell'RNA mediante trattamento con carico del campione di glicole, colorante e analisi su gel prima dell'ibridazione con microarray. L'RNA purificato con metodi convenzionali viene trascritto a ritroso in DNA complementare, che viene purificato dallo stampo degradato utilizzando un kit disponibile in commercio e portato a un volume di 60 microlitri. Iniziare l'ibridazione con microarray bloccando l'eleganza del mare. Vetrini per microarray con DNA di sperma di salmone sonificato. Dopo un'ora, immergere i vetrini bloccati in acqua doppio distillata e centrifugare.Asciugare i vetrini in provette coniche da 50 millilitri foderate con un fazzoletto di carta kim. Preparare ora un buffer di ibridazione a base di formammide 2x. Riscaldarlo prima a 55 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente i cristalli.Quindi centrifugare per un minuto a 10.000 ×g. Successivamente, mescolare 25 microlitri di CD NA con 25 microlitri di buffer di ibridazione e agitare delicatamente la miscela. Eseguire ora una breve centrifugazione della miscela e incubarla a 80 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo l'incubazione, pipettare con attenzione l'intero campione di cDNA sul vetrino per microarray senza toccare il vetrino. Per distribuire uniformemente il campione sul vetrino per microarray, abbassare delicatamente un coprioggetto sul vetrino utilizzando un ago di siringa; prima che il coprioggetto sia completamente abbassato, sollevarlo nuovamente e abbassarlo ancora con l'ago, permettendo al coprioggetto di posizionarsi delicatamente.Questa tecnica minimizza la formazione di bolle d'aria. Posizionare ora il vetrino in posizione orizzontale in un tubo conico da 50 millilitri, posizionando al di sotto del vetrino 50 microlitri di acqua doppio distillata, e lasciare incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, viene eseguita brevemente una seconda ibridazione dopo aver lavato il vetrino.Più volte nel SSC, il secondo buffer, che contiene reagenti di cattura sensibili alla luce e un reagente Antifa, viene applicato utilizzando la stessa tecnica, seguito da una breve incubazione, ulteriori lavaggi e asciugatura. Il vetrino può quindi essere scansionato. Le immagini possono essere analizzate utilizzando il software gratuito con lo strumento open source magic.Brevemente, sotto la scheda progetto, creare e salvare un nuovo progetto nella scheda crea profilo di espressione, selezionare carica coppia di immagini e scegliere il file immagine rosso come rosso e il file immagine verde come verde. Quindi selezionare la scheda crea profilo di espressione. Scegliere carica lista geni per caricare un file di lista genica di C. elegans ottenuto dal sito web GCAT al fine di allineare e grigliare l'immagine del microarray.Selezionare la scheda profilo di espressione del chip e l'opzione crea modifica griglia. Modificare ora la griglia. Impostare la finestra di dialogo inserendo 48 come numero di griglie, 22 righe e 22 colonne per ciascuna griglia e scegliendo di numerare i punti da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.Aumentare la percentuale di modifica del contrasto e ingrandire la griglia fino a quando i singoli punti sono facilmente distinguibili. Creare le griglie selezionando il punto in alto a sinistra nel pannello sinistro e quindi facendo clic sul centro del punto in alto a sinistra, seguito dal punto in alto a destra e dalla riga inferiore sulla griglia uno. Ripetere questa procedura di grigliatura per ciascuna delle 48 griglie procedendo da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.Quindi salvare selezionando la scheda file e salvando la griglia corrente. Selezionare la scheda completata per eliminare eventuali spot non pertinenti dall'analisi. Aprire la scheda crea profilo di espressione e, nell'opzione di grigliatura per indirizzamento, selezionare la marcatura degli spot.Ora contrassegna eventuali tracce o fluorescenza di fondo e salva selezionando "salva contrassegni attuali". Come nella scheda file, i file contrassegnati devono essere segmentati. Infine, analizza i geni indotti o repressi da un fattore specifico selezionando "esplora" nella scheda espressione.Nella finestra di dialogo di esplorazione, impostare i criteri di corrispondenza per i geni specifici. Il numero di aumenti o diminuzioni del doppio nell'espressione. L'intensità è indicata con x e il valore di X rappresenta il criterio per il cambiamento di espressione.X viene inserito con un valore massimo maggiore di X per i geni indotti e un valore minimo minore di x per i geni repressi. In questo esperimento, viene eseguito un controllo con scambio di colorante: due isolamenti indipendenti di RNA totale da larve allo stadio tre e allo stadio quattro vengono ibridati come mutante verde versus selvatico rosso e come mutante rosso versus selvatico verde, per confermare le variazioni nell'espressione genica. Effettuare tre isolamenti indipendenti di RNA totale utilizzando la stessa procedura, sintetizzare il cDNA con un kit commercialmente disponibile e, per ogni campione di cDNA, eseguire una PCR in tempo reale in triplicato utilizzando tre geni di controllo costitutivi. A scopo dimostrativo, i seguenti risultati esaminano l'espressione genica indotta in VSM uno.I mutanti AK 1468 sono una ceppa di nematodi caratterizzata da un potenziamento sinaptico; prima di eseguire l'analisi con microarray, la qualità dell'RNA estratto viene verificata mediante elettroforesi su gel. La presenza di due subunità ribosomiali integre prima e dopo il trattamento con una nucleasi è indicativa di un buon campione di RNA nell'analisi con microarray. Il cDNA del ceppo selvatico è marcato in rosso e il cDNA del mutante VSM uno è marcato in verde. In questo esempio, uno dei 48 griglie analizzati per ogni microarray, ogni piccolo quadrato rappresenta un singolo oligonucleotide stampato; in ogni array, ogni oligonucleotide unico è rappresentato.Una volta che l'analisi con microarray dei trascritti isolati da larve allo stadio quattro mostra che i geni che codificano per le proteine spermatiche maggiori, o MSP, sono indotti nei mutanti VSM uno, l'analisi con microarray di larve allo stadio tre rivela anche cambiamenti nell'espressione all'interno della stessa famiglia genica nel mutante. Il test delle previsioni ottenute con il microarray mediante analisi PCR in tempo reale rivela che un membro della famiglia genica M s P, M s P 32, è indotto nei mutanti VSM uno. I dati rappresentano la media di tre replicati di PCR in tempo reale effettuati a partire dalla stessa raccolta di RNA.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare strumenti bioinformatici per l'analisi su scala genomica, soprattutto considerando che molti programmi bioinformatici open source sono disponibili per la comunità scientifica.

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