Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

Il metodo dei cerotti giganti combinati con microelettrodi iono-selettivi è un metodo versatile utilizzato per rilevare e quantificare i flussi ionici. Nello specifico, viene utilizzato per misurare i flussi di protoni generati dall'attività del trasportatore di ioni elettroneutri, lo scambiatore sodio-idrogeno o NHE, che è espresso sulla membrana cellulare. Lo scambiatore sodio-idrogeno genera un gradiente di protoni in prossimità della membrana plasmatica, qui indicato come un anello arancione.

Questo gradiente di protoni attraverso la membrana cellulare viene misurato mediante registrazione del patch clamp dell'intera cellula combinata con una tecnica che utilizza un microelettrodo selettivo per i protoni. Il microelettrodo selettivo per i protoni viene spostato vicino alla superficie della cella, dove registra il flusso di protoni che escono dalle celle, mostrato qui in posizione A.E lontano dalla superficie della cella, dove registra la concentrazione di protoni liberi presenti nella soluzione indicata dalla posizione B.E poi, di nuovo in posizione A, vicino alla membrana cellulare, in un movimento ripetitivo e oscillatorio. La differenza di tensione da A a B viene registrata e dipende dal rappresentante dell'attività NHE.

Gli ioni trasportatori come i protoni attraverso la membrana cellulare influenzano il processo essenziale per la vita. Pertanto, le variazioni di pH sono strettamente regolate da una serie di molecole, tra cui lo scambiatore sodio-protone, un sistema di esclusione protonica della membrana plasmatica. Il microelettrodo oscillante per pH, combinato con il patch clamping dell'intera cellula, è un nuovo approccio per studiare il flusso di protoni mediato dall'attività dello scambiatore sodio-protone.

L'applicazione di questi metodi supera alcune delle principali limitazioni delle tecniche tipicamente utilizzate per misurare l'attività dello scambiatore sodio-protone, come la sensibilità moderata e la risoluzione temporale e un altro buon controllo dell'ambiente intracellulare. Darò una dimostrazione dei metodi insieme al mio collaboratore, il dottor Victor Babich. Il dottor Matthew Henry sarà il narratore.

Dimostreremo un'applicazione di questo metodo misurando l'attività dell'isoforma tre dello scambiatore sodio-protone, che è un importante regolatore dell'assorbimento del sale in acqua attraverso l'intestino e l'epitilo renale. I microelettrodi selettivi per i protoni per la misurazione della concentrazione di protoni sono realizzati con tubi di vetro borosilicato standard. Gli elettrodi in vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,2 millimetri e senza filamento vengono tirati con un estrattore verticale, utilizzando un protocollo convenzionale a doppia trazione.

Si ottiene una punta per pipetta di due o tre micrometri di diametro. Le pipette vengono inserite in un portabarattolo con la punta della pipetta rivolta verso l'alto. Successivamente, viene preparata una miscela per siliconare le pipette.

Viene versato in un barattolo e il coperchio è chiuso ermeticamente. Le pipette vengono incubate con la miscela di siliconatura per 24-48 ore. Prestare attenzione, assicurarsi di preparare la miscela e siliconare le pipette a temperatura ambiente in una cappa chimica ben ventilata.

Riempire nuovamente la pipetta con la resina iono-selettiva appropriata e posizionarla con cura verticalmente in un portabarattolo con la punta della pipetta rivolta verso il basso. Per prepararsi al bloccaggio dei patch, iniziare estraendo le pipette di bloccaggio dei patch da un vetro borosilicato a parete sottile con un diametro esterno di due millimetri e un diametro interno di 1,4 millimetri in un estrattore verticale utilizzando il protocollo convenzionale a doppia trazione. Utilizzare una microforgia montata su un tavolino di un microscopio invertito per realizzare una punta di pipetta larga.

Posizionare la pipetta vicino allo spesso filo di platino della microforgia. Accendere il riscaldamento utilizzando un interruttore a pedale che controlla l'accensione e lo spegnimento della corrente. Riscaldare il vetro a basso punto di fusione che copre il centro dello spesso filo di platino della microforgia, quindi spostare la punta della pipetta vicino al vetro morbido fuso.

Il riscaldamento sposta leggermente il filo di platino verso il centro. Il filo di platino ritorna nella posizione iniziale e il puntale della pipetta si rompe. Ripetere la procedura fino ad ottenere il diametro della punta desiderato e infine, applicare il calore per lisciare la punta.

I puntali delle pipette hanno un diametro di 10 micrometri dopo la lucidatura con la microforgia. L'uso del filo di platino spesso è un vantaggio in quanto c'è poca espansione dopo l'accensione dell'elettricità e meno possibilità di surriscaldare il filo e la pipetta con una corrente eccessiva. Dopo che le cellule sono state dissociate utilizzando la tripsina e la tripsinizzazione è stata bloccata, le cellule vengono mantenute su uno shaker con oscillazione per prevenire la formazione di grumi.

Questo viene fatto per un massimo di due ore dopo la tripsinizzazione. L'impianto di elettrofisiologia consiste in un regolatore di temperatura per regolare la temperatura della soluzione nel sistema di perfusione. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti a circa 37 gradi Celsius.

E un commutatore di filtri ottici per controllare la ruota portafiltri per l'imaging a fluorescenza. Un controller per valvole del sistema di perfusione per regolare l'apertura e la chiusura delle valvole del sistema di perfusione. E il regolatore di temperatura per regolare la temperatura della camera di registrazione.

Un oscilloscopio per osservare le forme d'onda e un amplificatore patch clamp. Un computer che esegue questo software Capmeter. E un elettrometro per registrare il segnale dei microelettrodi iono-selettivi.

E un amplificatore differenziale per amplificare il segnale dell'elettrometro. L'impianto di elettrofisiologia è dotato anche di un microscopio invertito con controller di scena, due micro-manipolatori con controller posizionati sui siti sinistro e destro del microscopio, il sistema di perfusione con riscaldatore di soluzione in linea. Dopo che la pipetta per microelettrodi iono-selettivi è stata montata sul micromanipolatore, riempire nuovamente la pipetta di bloccaggio del patch con la soluzione intracellulare.

Assicurarsi che la soluzione raggiunga la punta della pipetta. Potrebbe essere necessario effettuare diversi tocchi delicati per eliminare le bolle nella punta della pipetta. Quindi montare la pipetta di bloccaggio del cerotto sullo stadio superiore della configurazione di elettrofisiologia.

Trasferire delicatamente le cellule dall'aspetto sano nella camera di registrazione riempita con un volume definito di soluzione per il bagno. È importante mantenere lo stadio della testa a un angolo di 45 gradi rispetto all'asse orizzontale. Ciò garantisce un angolo di ingresso della pipetta adatto alla formazione di una tenuta altamente resistente.

Mentre la pipetta patch clamp è abbassata nella soluzione del bagno, applicare una piccola quantità di pressione positiva sulla pipetta per ridurre la possibilità di bloccare il puntale. Seleziona una cella e avvicinati ad essa con una piccola quantità di pressione positiva. Interrompere lo spostamento della pipetta patch clamp una volta che il puntale è vicino alla cellula.

Abbassare il microelettrodo iono-selettivo nella soluzione del bagno fino a raggiungere lo stesso piano focale della punta della pipetta con pinza patch. Quando la pipetta è posizionata centralmente sopra la cellula, avviare la sigillatura applicando una piccola quantità di pressione negativa. Una tenuta mega-ohm si ottiene in pochi secondi.

Assicurarsi che il potenziale di mantenimento sia mantenuto dall'amplificatore a zero millivolt. Infine, rompere la membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione e avviare la registrazione. Utilizzando il metodo di registrazione a patch giganti, è possibile perfondere rapidamente le soluzioni nella pipetta di vetro tramite un sistema di perfusione intrapipettato per modificare il contenuto intracellulare di ioni, lipidi e proteine.

Posizionare la pipetta per microelettrodi iono-selettivi vicino alla cella tenuta dalla pipetta patch clamp e avviare l'oscillazione della pipetta per microelettrodi iono-selettivi spostandola da e verso la cella. L'applicazione di questa tecnica permette di studiare la regolazione molecolare dello scambiatore sodio-idrogeno. Sfruttando il metodo dei cerotti giganti, la composizione intracellulare di ATP e lipidi è stata modificata da un sistema di perfusione intrapipetta.

La perfusione intracellulare dell'apirasi, che idrolizza l'ATP intracellulare e diminuisce il contenuto di fosfoinositidi, ha causato una diminuzione del 50% dell'attività dell'isoforma tre dell'NHE. L'effetto dell'apirasi sull'attività di NHE3 non è stato invertito dalla perfusione intracellulare del fosfoinositide, PIP2. Tuttavia, è stato invertito dalla perfusione intracellulare del fofoinositide, PIP3.

La misurazione dell'attività NHE si avvale della combinazione del microelettrodo selettivo del protone e dei metodi di bloccaggio del patch. Ciò consente lo studio delle basi molecolari alla base della regolazione differenziale dell'NHE da parte dei fosfoinositidi e delle cascate di segnali a valle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come misurare l'attività dello scambiatore sodio-protone utilizzando un microelettrodo di pH oscillante combinato con il clamping di tutti i patch cellulari.

E un esempio di possibile applicazione dei metodi.