Rilevamento di autoanticorpi anti-MDA5 mediante cellule HeLa e immunocitochimica con microscopia ottica

Lo scopo principale del seguente esperimento è quello di utilizzare l'immunocitochimica per lo screening degli anticorpi anti-MDA5. Questo viene fatto utilizzando le cellule HeLa e quindi trasfettando la cellula HeLa con il costrutto MDA5. In quanto tali, le cellule HeLa produrranno proteine MDA5 che possono essere attaccate dagli anticorpi MDA5.

Dopo aver incluso la cellula HeLa con il costrutto MDA5, il reagente Triton viene utilizzato per permeabilizzare la membrana delle cellule HeLa, consentendo il passaggio degli anticorpi anti-MDA5. Successivamente, viene aggiunto il siero del paziente che contiene gli anticorpi anti-MDA5. Gli anticorpi anti-MDA5 si attaccherebbero quindi alle proteine MDA5 all'interno delle cellule HeLa.

Successivamente, gli anticorpi secondari, a cui è attaccata la perossidasi di rafano, vengono distribuiti nelle cellule, gli anticorpi secondari si attaccherebbero quindi agli anticorpi anti-MDA5. Infine, il cromogeno viene aggiunto alle cellule e ossidato in presenza di anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano, producendo un colore visibile al microscopio ottico. Un risultato positivo in piedi mostrerebbe qualcosa di simile all'immagine sopra.

Nel video dimostrativo di oggi, ci addentriamo in un'area critica della ricerca medica, l'individuazione dell'anticorpo anti-melanoma del gene cinque associato alla differenziazione, chiamato anche anticorpo anti-MDA5. Questi autoanticorpi svolgono un ruolo critico di semplice indicatore diagnostico per i pazienti con malattia polmonare interstiziale, in particolare quelli con malattia polmonare interstiziale rapidamente progressiva. Il significato di questa ricerca risiede nel suo potenziale impatto sugli esiti dei pazienti. La diagnosi precoce e accurata dell'autoanticorpo MDA5 è fondamentale per gestire efficacemente questa grave malattia autoimmune.

Il vantaggio principale del metodo che abbiamo dimostrato rispetto al metodo d'oro dello screening degli autoanticorpi anti-MDA5 è che potrebbe essere fatto più velocemente e risparmiare tempo e fatica rispetto al tradizionale test di immunovisitazione radiomarcato. Questa maggiore efficienza ci consente di elaborare più campioni e generare rapidamente risultati. Inoltre, è fondamentale notare che il nostro metodo non solo offre un'efficienza superiore, ma anche una sicurezza e un rapporto costo-efficacia rispetto al test di immunoprecipitazione di transizione.

Ora, vediamo come si fa. Il mio assistente di ricerca, Teo Kai Fa, guiderà la procedura. Mantenere le cellule HeLa con il Medium Modified Eagle's Medium di Dulbecco, contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antimicotico antibiotico a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.

Passaggio delle celle ogni due o tre giorni, o quando le celle raggiungono il 90-100% di confluenza. Posizionare 70.000 cellule HeLa su ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. 24 ore prima della trasfezione e nettare le cellule, che circa il 90% di confluenza.

Diluire 500 nanogrammi di plasmina e 1,5 microlitri di reagente di trasfezione ciascuno in 25 microlitri di terreno sierico ridotto. Aggiungere il DNA diluito, eseguire il reagente di trasfezione diluito in un rapporto uno a uno. Mescolare bene e incubare per cinque minuti.

Aggiungere la miscela alle cellule posizionate un giorno prima e agitare per mescolare immediatamente il complesso lipidico del DNA. Verificare che le celle siano confluenti all'80-90%. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un emisfero umidificato al 5% di CO2, da 40 a quattro ore, e procedere all'immunocitochimica.

Utilizziamo un fattore disponibile in commercio. Maggiori informazioni sono disponibili nella tabella dei materiali. La loro efficacia di trasfezione è del 50%Il successo della trasfezione e dell'espressione della proteina bersaglio può essere determinato trasfettando le cellule con proteina congelata che esprime plasmide e conducendo il sangue occidentale per visualizzare l'espressione della proteina bersaglio Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere eventuali terreni rimanenti.

Il lavaggio può essere effettuato agitando la piastra o uno scuotitore orbitale. Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide in PBS Caution. La paraformaldeide è tossica.

Utilizzare linee guida per la manipolazione appropriate. Lasciare le celle per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, smaltire il reagente fissativo.

Utilizzare PBS per lavare la cella due volte. Applicare il reagente Triton e poi lasciare riposare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Abbiamo usato Triton X 400 in PBS a una concentrazione dello 0,3%Dopo 10 minuti, smaltire il reagente Triton.

Aggiungere PBS per lavare le celle una volta. Passaggio successivo, eseguire il blocco con il 10% di siero fetale bovino in PBS e lasciare le cellule per un'ora a temperatura ambiente, rimuovere il reagente bloccante. Quindi, aggiungi PBS per lavare le celle una volta.

Aggiungere il plasma diluito del paziente alle cellule. Assicurarsi di diluire il plasma del paziente in un rapporto da una a 5.000 diluizioni in PBS prima dell'uso. Regola la diluizione per migliorare il segnale o ridurre lo sfondo secondo necessità per garantire risultati imparziali.

Il personale ha condotto il test, non era a conoscenza di quali campioni appartenessero ai pazienti e quali provenissero da individui sani. Incubare un campione a quattro gradi Celsius per 12-16 ore. Dopo il periodo di incubazione, prelevare il campione del paziente e lavare le cellule tre volte con PBS.

Trattare le cellule con capra coniugata con perossidasi di rafano diluita, IgG anti-umane in un rapporto da una a 250 diluizioni in PBS. Lasciare le celle per un'ora a temperatura ambiente. Un'ora dopo, smaltire l'anticorpo secondario.

Risciacquare con PBS tre volte. Dopo aver lavato le cellule, colorare le cellule con 300 microlitri di soluzione di lavoro DAB per pozzetto. La soluzione di lavoro DAB viene preparata mancando il concentrato promozionale DAB e il diluente DAB seguendo le istruzioni del produttore.

Dopo aver colorato la cella per cinque minuti, rimuovere il colorante. Dopo aver rimosso il colorante, sciacquare con acqua distillata ionizzata e agitare per cinque minuti. Controcolorare il nucleo cellulare con ematossina diluita.

Usiamo l'emotossina in una piega di diluizione di 10. Attendere cinque minuti per il processo di colorazione. Dopo cinque minuti, smaltire l'emopossina, quindi lavare con l'acqua distillata analizzata due volte per cinque minuti ciascuna.

Passaggio finale, osservare i risultati della colorazione al microscopio ottico. Interpretiamo i risultati del nostro test di immunocitochimica per gli autoanticorpi anti-MDA5. Un risultato positivo.

Un vero positivo mostra una forte colorazione marrone all'interno di HeLa che esprime MDA5. Ciò conferma gli autoanticorpi anti-MDA5 nel campione del paziente. Un risultato negativo.

Un risultato negativo mostra cellule HeLa senza colorazione marrone, indicando l'assenza di autoanticorpi anti-MDA5. Un risultato falso positivo. Criticamente, un falso positivo mostra un'estesa colorazione marrone in tutte le cellule, indipendentemente dall'espressione di MDA5s.

Questa colorazione non specifica osservata nelle condizioni autoimmuni deve essere distinta da un vero positivo per evitare diagnosi errate. Il nostro metodo offre un modo più rapido, sicuro ed economico per rilevare gli anticorpi d'organo anti-MDA5. Ciò ha il potenziale per avere un impatto significativo sugli esiti dei pazienti nella gestione della malattia polmonare interstiziale.

Dopo aver visto questo video, avrai imparato come eseguire la procedura di immunocitochimica e come identificare i risultati clinici rilevanti.