Un test di elettrochemiluminescenza 7-plex ad alta produttività che esegue simultaneamente lo screening per il diabete di tipo 1 e le malattie autoimmuni multiple

Modelliamo un semplice test ECL multiplex che combina 7 saggi di autoanticorpi insieme. Il test è in grado di eseguire lo screening per il T1D e molte altre malattie autoimmuni, contemporaneamente, tra cui la celiachia, la malattia autoimmune della tiroide e la sindrome polighiandolare autoimmune 1.

Il test di elettrochemiluminescenza può eseguire contemporaneamente lo screening del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni rilevanti, tra cui la criomalattia autoimmune, la celiachia e la sindrome polighiandolare autoimmune-1. Il test ECR, molto complesso, combina fino a 10 test anticorpali multipli in un unico pozzetto, ottenendo un'elevata produttività, meno librerie e un test meno costoso che richiede un volume meno ampio. A dimostrare la procedura sarà Xiaofan Jia, un post del mio laboratorio.

Per preparare una soluzione mista di antigene accoppiato a linker, selezionare innanzitutto la concentrazione ottimale per ciascun antigene, in base al test a scacchiera, e diluire l'antigene marcato con biotina e rutenio alla concentrazione di lavoro razionale. Per legare diversi linker a ciascuno degli antigeni biotinilati in modo univoco, per un saggio a 96 pozzetti, ho mescolato 240 microlitri di un appropriato linker coniugato con STREPTAVIDIN con 4 microlitri delle proteine biotinilate di interesse. Quindi aggiungere 156 microlitri di 1% BSA per provetta e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 160 microlitri di soluzione di arresto a ciascuna provetta e incubare le provette a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere 400 microlitri di antigene accoppiato al linker da ciascuna provetta e tirare tutte e sette le sospensioni dell'antigene in un'unica provetta. Quindi, aggiungere alla miscela 1,2 millilitri di soluzione di arresto e 4 microlitri di GAD65, TPO, tTg, ThG, interferone-alfa proinsulina e antigene IA-2 marcati con Ru sulfo-NHS.

Prima di incubare i campioni di siero con la miscela di antigene marcata, aggiungere 15 microlitri di siero per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e mescolare 18 microlitri di acido acido molare 0,5 con ciascun pozzetto di siero per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, aggiungere 35 microlitri di antigene e 13 microlitri di un tampone Tris molare per pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Al termine dell'incubazione, trasferire immediatamente 25 microlitri di siero trattato con acido in ciascun pozzetto della piastra antigenica.

Coprire la piastra con un foglio di plastica per soffitto e posizionare la piastra su uno shaker a bassa velocità a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra a 4 gradi Celsius per 18-24 ore. Togliete il piatto dal frigorifero e lasciatelo raggiungere la temperatura ambiente.

Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone A bloccante al 3% in ogni pozzetto. Quando tutti i pozzetti sono stati trattati, coprire la piastra con un foglio di alluminio per soffitto e mettere la piastra in un frigorifero a 4 gradi Celsius per una notte. La mattina seguente, capovolgere la piastra e lavare i campioni tre volte con 150 microlitri di PBS-T per pozzetto, per lavaggio.

Picchiettare la piastra fino a quando non rimane alcun tampone in nessuno dei pozzetti. Aggiungere 30 microlitri di antigene sierico incubato in ciascun pozzetto. Quando tutti i covari sono stati aggiunti, coprire la piastra con un foglio di alluminio e posizionare la piastra su uno shaker a bassa velocità per un'ora, a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, rimuovere gli incubati sbattendo e lavare i pozzetti tre volte con 150 microlitri di PBS-T per pozzetto, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura a ciascun pozzetto e leggere la piastra su un lettore di piastre, in conteggi al secondo. In questa analisi di un'ampia coorte di campioni provenienti da 1026 pazienti con diabete di tipo 1 di nuova diagnosi, i livelli di autoanticorpi provenienti da un test di elettroluminescenza di oltre sette sono stati confrontati con i livelli di ciascun test di elettroluminescenza singolo stabilito e da ciascun corrispondente test di legame radio standard ed ELISA.

Le specificità del test erano identiche al 99° percentile per tutti i test di autoanticorpi, ad eccezione degli autoanticorpi tiroidei, per i quali è stato utilizzato il 95° percentile. Un piccolo numero di campioni discordanti per ciascuno dei sette autoanticorpi è stato trovato intorno alla linea di confine dei cutoff per ogni test. Qui si possono osservare i dati corrispondenti per 1022 controlli sani per ogni test.

La cosa più importante da ricordare è trovare un linker diverso per ciascuno degli antigeni biotinilati in modo univoco e mescolare ogni antigene con le proprietà per fornire un linker coniugato. Questa tecnica di analisi consentirà ai ricercatori di pianificare lo screening di più malattie autoimmuni contemporaneamente in popolazioni su larga scala e consentirà alle cliniche di esaminare facilmente più malattie rilevanti con diabete di tipo 1.