Un test di elettrochemiluminescenza 7-plex ad alta produttività che esegue simultaneamente lo screening per il diabete di tipo 1 e le malattie autoimmuni multiple
29 maggio 2020
Modelliamo un semplice test ECL multiplex che combina 7 saggi di autoanticorpi insieme. Il test è in grado di eseguire lo screening per il T1D e molte altre malattie autoimmuni, contemporaneamente, tra cui la celiachia, la malattia autoimmune della tiroide e la sindrome polighiandolare autoimmune 1.
Il test di elettrochemiluminescenza può eseguire contemporaneamente lo screening del diabete di tipo 1 e di altre malattie autoimmuni rilevanti, tra cui la criomalattia autoimmune, la celiachia e la sindrome polighiandolare autoimmune-1. Il test ECR, molto complesso, combina fino a 10 test anticorpali multipli in un unico pozzetto, ottenendo un'elevata produttività, meno librerie e un test meno costoso che richiede un volume meno ampio. A dimostrare la procedura sarà Xiaofan Jia, un post del mio laboratorio.
Per preparare una soluzione mista di antigene accoppiato a linker, selezionare innanzitutto la concentrazione ottimale per ciascun antigene, in base al test a scacchiera, e diluire l'antigene marcato con biotina e rutenio alla concentrazione di lavoro razionale. Per legare diversi linker a ciascuno degli antigeni biotinilati in modo univoco, per un saggio a 96 pozzetti, ho mescolato 240 microlitri di un appropriato linker coniugato con STREPTAVIDIN con 4 microlitri delle proteine biotinilate di interesse. Quindi aggiungere 156 microlitri di 1% BSA per provetta e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 160 microlitri di soluzione di arresto a ciascuna provetta e incubare le provette a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere 400 microlitri di antigene accoppiato al linker da ciascuna provetta e tirare tutte e sette le sospensioni dell'antigene in un'unica provetta. Quindi, aggiungere alla miscela 1,2 millilitri di soluzione di arresto e 4 microlitri di GAD65, TPO, tTg, ThG, interferone-alfa proinsulina e antigene IA-2 marcati con Ru sulfo-NHS.
Prima di incubare i campioni di siero con la miscela di antigene marcata, aggiungere 15 microlitri di siero per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e mescolare 18 microlitri di acido acido molare 0,5 con ciascun pozzetto di siero per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, aggiungere 35 microlitri di antigene e 13 microlitri di un tampone Tris molare per pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Al termine dell'incubazione, trasferire immediatamente 25 microlitri di siero trattato con acido in ciascun pozzetto della piastra antigenica.
Coprire la piastra con un foglio di plastica per soffitto e posizionare la piastra su uno shaker a bassa velocità a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra a 4 gradi Celsius per 18-24 ore. Togliete il piatto dal frigorifero e lasciatelo raggiungere la temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone A bloccante al 3% in ogni pozzetto. Quando tutti i pozzetti sono stati trattati, coprire la piastra con un foglio di alluminio per soffitto e mettere la piastra in un frigorifero a 4 gradi Celsius per una notte. La mattina seguente, capovolgere la piastra e lavare i campioni tre volte con 150 microlitri di PBS-T per pozzetto, per lavaggio.
Picchiettare la piastra fino a quando non rimane alcun tampone in nessuno dei pozzetti. Aggiungere 30 microlitri di antigene sierico incubato in ciascun pozzetto. Quando tutti i covari sono stati aggiunti, coprire la piastra con un foglio di alluminio e posizionare la piastra su uno shaker a bassa velocità per un'ora, a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, rimuovere gli incubati sbattendo e lavare i pozzetti tre volte con 150 microlitri di PBS-T per pozzetto, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura a ciascun pozzetto e leggere la piastra su un lettore di piastre, in conteggi al secondo. In questa analisi di un'ampia coorte di campioni provenienti da 1026 pazienti con diabete di tipo 1 di nuova diagnosi, i livelli di autoanticorpi provenienti da un test di elettroluminescenza di oltre sette sono stati confrontati con i livelli di ciascun test di elettroluminescenza singolo stabilito e da ciascun corrispondente test di legame radio standard ed ELISA.
Le specificità del test erano identiche al 99° percentile per tutti i test di autoanticorpi, ad eccezione degli autoanticorpi tiroidei, per i quali è stato utilizzato il 95° percentile. Un piccolo numero di campioni discordanti per ciascuno dei sette autoanticorpi è stato trovato intorno alla linea di confine dei cutoff per ogni test. Qui si possono osservare i dati corrispondenti per 1022 controlli sani per ogni test.
La cosa più importante da ricordare è trovare un linker diverso per ciascuno degli antigeni biotinilati in modo univoco e mescolare ogni antigene con le proprietà per fornire un linker coniugato. Questa tecnica di analisi consentirà ai ricercatori di pianificare lo screening di più malattie autoimmuni contemporaneamente in popolazioni su larga scala e consentirà alle cliniche di esaminare facilmente più malattie rilevanti con diabete di tipo 1.
Panoramica
Questo studio presenta un saggio elettrochemiluminescente (ECL) multiplex che consente lo screening simultaneo del diabete di tipo 1 e di diverse malattie autoimmuni. Il saggio combina più test per autoanticorpi in un'unica pozzetta, aumentando l'efficienza e riducendo i costi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Autoimmunità
- Diagnostica
- Saggi di elettrochemiluminescenza
Sfondo
- Il diabete di tipo 1 (T1D) è spesso associato ad altre malattie autoimmuni.
- I saggi tradizionali possono richiedere più test, aumentando i tempi e i costi.
- I saggi multiplex possono semplificare il processo diagnostico.
- L'elettrochemiluminescenza offre un'elevata sensibilità e specificità.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio ECL multiplex per lo screening del diabete di tipo 1 e delle malattie autoimmuni correlate.
- Confrontare le prestazioni del saggio multiplex con quelle dei saggi singoli consolidati.
- Facilitare lo screening su larga scala in ambito clinico.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni di antigeni accoppiati a linker misti.
- Incubazione dei campioni di siero con antigeni marcati.
- Utilizzo di un formato a piastra da 96 pozzetti per lo screening ad alto rendimento.
- Confronto dei livelli di autoanticorpi in pazienti con diabete di tipo 1 e controlli sani.
Risultati principali
- L'analisi multiplex ha dimostrato una specificità paragonabile a quella delle analisi singole.
- Individuato un piccolo numero di campioni discordanti vicino alle soglie di cutoff.
- Fornito dati per una vasta coorte di pazienti appena diagnosticati con diabete di tipo 1.
- Consentito uno screening efficiente per numerose malattie autoimmuni.
Conclusioni
- Il saggio ECL multiplex è uno strumento valido per lo screening simultaneo.
- Questo metodo può migliorare l'efficienza diagnostica nella pratica clinica.
- È consigliata una ulteriore validazione in popolazioni più ampie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento simultaneo di autoanticorpi multipli in un singolo pozzetto affronta un collo di bottiglia critico nello screening su larga scala delle malattie autoimmuni, riducendo la complessità del saggio e il consumo di risorse. Questo approccio elettrochemiluminescente multiplex aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione precoce della malattia fornendo letture correlate di biomarcatori in diverse condizioni autoimmuni, tra cui il diabete di tipo 1 e le patologie autoimmuni comorbide. Il saggio supporta la selezione di portafoglio e la riduzione del rischio meccanicistico nello sviluppo di immunoterapie, consentendo una stratificazione efficiente dei pazienti basata su profili multipli di autoanticorpi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche correlando i cluster di autoanticorpi con gli endotipi della malattia in modelli preclinici.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale delle risposte immunitarie specifiche per l'antigene in sistemi rilevanti per la malattia.
- Valore predittivo: Migliora la fiducia nella selezione degli obiettivi identificando sottogruppi di pazienti con firme convergenti di autoanticorpi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara pannelli standardizzati e quantitativi di biomarcatori per campagne di screening successive che richiedono elevata riproducibilità.
- Valore operativo: Garantisce la prontezza del saggio mediante complessi antigene-legame immobilizzati che assicurano un legame costante in fase fluida tra diverse pozzette.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma per lo screening fino a 10 autoanticorpi per pozzetta, aumentando la produttività senza necessità di riformattazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia rilevando autoanticorpi associati alla progressione clinica nel diabete di tipo 1 e in disturbi autoimmuni concomitanti.
- Avanzamento aggiustato per il rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione identificando pazienti con profili di autoanticorpi ad alta penetranza predittivi di autoimmunità multiorgano.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nell'interpretazione dei meccanismi immunitari mediante la misurazione contemporanea di autoanticorpi diretti contro le isole pancreatiche, la tiroide, l'intestino e le vie dell'interferone.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio funge da ponte tra scoperta e applicazione traslazionale, consentendo un fenotipaggio immunitario precoce che informa le fasi di identificazione del composto promettente e di validazione preclinica attraverso un profilo multiplex di autoanticorpi.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando i modelli di co-espressione degli autoanticorpi ai percorsi patogenetici nella patogenesi autoimmune.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili che consentono il confronto delle risposte immunitarie tra diverse condizioni di trattamento o contesti genetici.
- Analisi: Fornisce letture di conteggi normalizzati al secondo che permettono il confronto statistico dei livelli di autoanticorpi tra coorti di pazienti e controlli.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica validando pannelli di biomarcatori in campioni umani che rispecchiano la disregolazione immunitaria associata alla malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di immunoanalisi riutilizzabile, adattabile ad altri pannelli per malattie autoimmuni o infiammatorie oltre alla configurazione iniziale a 7 elementi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi negativi mediante la misurazione simultanea di autoanticorpi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità eliminando la variabilità tra pozzetti grazie alla presentazione dell'antigene immobilizzato.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consolidando sette test diagnostici in un unico passaggio del flusso di lavoro.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati terapeutici aggiustata per il rischio, basata su popolazioni di pazienti definite da biomarcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di saggi immunologici e nella chimica dei leganti per l'immobilizzazione dell'antigene.
- Richiede un lettore di piastre in grado di rilevare l'elettrochemiluminescenza in formato a 96 pozzetti.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di bloccaggio e lavaggio tra diversi siti per studi multicentrici.
- Richiede l'adattamento delle concentrazioni di antigene quando si estende ad altri autoanticorpi oltre ai sette originali.
- Limitato dalla necessità di coppie legante-antigene ottimizzate per prevenire la cross-reattività in formato multiplex.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Mixed Linker-Coupled Antigen Solution
2:26
Serum Sample Incubation with Labeled Antigen
3:30
Multiplex Plate Preparation
3:57
Serum/Antigen Incubate Transfer
4:58
Results: Representative Autoantibody Level Evaluation
6:03
Conclusion
