Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di eseguire rapidamente lo screening degli autoanticorpi in modo multiplex. Questo metodo può aiutare a identificare le domande chiave nel campo dell'autoimmunità, come ad esempio quali autoanticorpi sono correlati a diversi stati patologici. I principali vantaggi di questa tecnica sono che gli autoanticorpi possono essere sottoposti a screening in modo parallelo, sono necessari solo microlitri di siero e solo microgrammi di antigene.

Per generare microarray di antigeni, iniziare diluendo gli antigeni in PBS a una concentrazione finale di 2 milligrammi per millilitro. Imposta una configurazione di micro arrayer con nove pin per stampare fino a 162 antigeni unici in duplicato. Includere gli antigeni IgG e IgM nella libreria degli antigeni come controlli positivi.

Includi PBS solo come controllo negativo. Aggiungere 20 microlitri di ciascun antigene alla piastra sorgente a 384 pozzetti in gruppi che rispecchiano la configurazione della testina di stampa. Usa un foglio per coprire la lastra sorgente e congela la lastra a meno 80 gradi Celsius, fino al momento di stampare gli array.

Pulire i pin del microarray solido incubandoli in un bagno sonico con acqua deionizzata tre volte per un minuto ciascuna. Mettere gli spilli in una griglia ad asciugare. Quindi disporre i pin nella testina di stampa del microarray.

Per nove pin, utilizzare una configurazione tre per tre. Quindi, programmare il microarrayer per la tiratura impostando il numero di pin sulla testina di stampa, il numero di vetrini da stampare, il numero di pad su ciascun vetrino e il numero di punti replicati per ciascun antigene. Inoltre, programmare il microarrayer per sonicare i pin in acqua tra diversi gruppi di antigeni.

Quindi, dopo aver scongelato la piastra sorgente, centrifugarla per un minuto a 100 volte G.Posizionare la piastra sorgente nel punto designato nel microarrayer, quindi rimuovere la sezione di pellicola che copre il primo gruppo di antigeni da stampare. Disporre i vetrini non stampati sulla superficie dell'arrayer ed eseguire il programma di stampa. Stampa i vetrini a temperatura ambiente con l'umidità impostata sull'arrayer dal 55 al 60%Dopo che ogni gruppo di antigeni è stato stampato su tutti i vetrini, mettere in pausa il microarrayer.

Copri gli antigeni che sono stati appena stampati con un foglio per evitare l'evaporazione e scopri il prossimo gruppo di antigeni da stampare. Quindi, continuare il programma di stampa. Dopo che tutti gli antigeni sono stati stampati, coprire la piastra sorgente con un nuovo foglio di alluminio e congelarla a meno 80 gradi Celsius.

Posizionare le diapositive stampate in una scatola per vetrini e sigillarla sottovuoto. Le diapositive possono essere utilizzate il giorno successivo o fino a un mese dopo. Per sondare i microarray con sieri diluiti utilizzando camere di incubazione, posizionare i vetrini nei telai.

Quindi aggiungere 700 microlitri di tampone di blocco su ciascuna superficie dell'array. Posiziona la pellicola adesiva sul telaio e trasferiscila in un contenitore sigillato con un pezzo di tessuto bagnato. Quindi, incubare i vetrini a quattro gradi Celsius su un bilanciere per una notte.

Il giorno seguente, diluire i campioni di siero da uno a 100 in tampone bloccante. Quindi aspirare la soluzione bloccante dagli array e aggiungere 500 microlitri di campione diluito su ciascuna superficie dell'array. Quindi, coprire gli array con pellicola adesiva e incubare a quattro gradi Celsius, con dondolo per un'ora.

Quindi, aspirare i campioni di siero dagli array e utilizzare il tampone di risciacquo per risciacquare le superfici dell'array quattro volte, versando il tampone sui vetrini e scorrendolo rapidamente. Utilizzare 700 microlitri di tampone bloccante per lavare ciascuna superficie dell'array e incubare 10 minuti a temperatura ambiente con oscillazione. Quindi, aggiungere 500 microlitri di anticorpo secondario diluito su ciascuna superficie del vetrino e utilizzare una pellicola adesiva per coprirla.

Incubare i vetrini a quattro gradi Celsius con dondolo per 45 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare la miscela di anticorpi secondari dai vetrini e risciacquare quattro volte, come appena dimostrato. Quindi, lavare i vetrini con 700 microlitri di tampone di diluizione bloccante, tre volte per 10 minuti ciascuna.

Rimuovere le diapositive dai telai, quindi posizionarle in una rastrelliera metallica per diapositive e immergerle nel PBS. Incubare a temperatura ambiente con agitazione orbitale per 20 minuti. Metti una griglia per vetrini in un contenitore di acqua deionizzata per 15 secondi.

Quindi posizionare il rack in un nuovo contenitore d'acqua e incubare per altri 15 secondi. Per asciugare i vetrini, posizionare la griglia per vetrini su un adattatore per piastre ELISA nella centrifuga e centrifugare a 220 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare i vetrini in una scatola a tenuta stagna fino al momento della scansione.

Per scansionare i vetrini, utilizzare uno scanner a microarray in grado di rilevare i segnali fluorescenti SI tre e SI cinque. Determinare le impostazioni ottimali del tubo moltiplicatore, o PMT, eseguendo la scansione preliminare di un vetrino completo della libreria di antigeni che è stato sondato solo con anticorpi secondari. Impostare i valori PMT utilizzati premendo il pulsante hardware in modo che le caratteristiche IgG umane sul canale SI tre e le caratteristiche IGM umane sul canale SI cinque abbiano un'intensità di fluorescenza mediana simile meno il fondo, o MFIB, che è tipicamente 40.000.

Quindi, scansiona i vetrini sperimentali sui due canali premendo il pulsante di scansione. Salvare le immagini dei vetrini in entrambi i canali dopo ogni scansione. Utilizzando il pulsante file, caricare il vetrino da analizzare nel software microarray.

Quindi, utilizzare il pulsante file per caricare l'elenco degli array genetici, o file GAL, che ha il layout dell'array, con le identità delle caratteristiche dell'array. Posizionare il modello di matrice sull'immagine acquisita, in modo che le caratteristiche delle serie corrispondano il più possibile al modello. Premere il pulsante di allineamento per allineare le feature in tutti i blocchi con il modello.

Il software calcola quindi un MFI meno lo sfondo per ciascuno degli antigeni. Infine, utilizzare il pulsante file per esportare i risultati come file di testo e analizzare i dati secondo il protocollo di testo. In questa figura, che mostra i vetrini di controllo positivi e negativi, il vetrino negativo viene sondato solo con anticorpi secondari e il vetrino di controllo positivo viene sondato con il siero di un paziente con lupus eritematoso sistemico.

Come indicato qui, il siero di controllo positivo, con reattività nota al riboP, ha dimostrato di avere anticorpi IgM contro il DNA a singolo filamento e anticorpi IgG contro il riboP. Sono state osservate risposte lineari con IgM su tutte le diluizioni sieriche e con IgG fino a un MFI meno fondo di circa 30.000. In questo esperimento, l'array viene sondato con siero umano di un paziente con vasculite crioglobulinemica, con un fattore reumatoide documentato, che è un anticorpo IgM contro le IgG.

La caratteristica IgG è giallo-verde a causa del legame delle IgM nel siero del paziente alle IgG immobilizzate sull'array. Utilizzando solo gli anticorpi secondari, non si osserva alcuna reattività IgM contro le IgG individuate sull'array. Qui mostrato, le IgM e le IgG di topo individuate sull'array, vengono rilevate solo con anticorpi secondari anti-topo rispettivamente contro IgM e IgG.

Questa figura mostra l'allineamento di una griglia di modelli su un'immagine di array scansionata, utilizzando un software di analisi di microarray. Una volta allineate, le caratteristiche dell'array possono essere analizzate per ottenere l'intensità di fluorescenza mediana meno il fondo per ciascuna caratteristica. Una volta padroneggiato, il sondaggio dei microarray di antigeni può essere eseguito in quattro ore se eseguito correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche come l'ELISA per convalidare i risultati ottenuti dai microarray di antigeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stampare i microarray di antigeni, come sondare i microarray di antigeni con il siero e come scansionare i microarray di antigeni con uno scanner. Non dimenticare che lavorare con il siero umano può essere pericoloso e che è necessario prendere precauzioni universali durante l'esecuzione di questa procedura.