Distinzione simultanea di monospecifici e modelli misti DFS70 durante lo Screening di ANA con un substrato romanzo HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout
17 gennaio 2018
Gli autoanticorpi DFS70 imitano modelli comuni di malattia-collegati di anticorpo antinucleare rendendo interpretazione accurata impegnativo quando si utilizzano substrati convenzionali di HEp-2. Il protocollo descrive vantaggi di substrato di HEp-2 derivati dal romanzo su convenzionale HEp-2 a ANA screening e distinguere modelli DFS70 con elevata fiducia sia monospecifici e misti casi positivi di ANA.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un test di immunofluorescenza indiretto migliorato che utilizza un nuovo substrato HEp-2, denso a macchie fini 70 knockout per lo screening degli autoanticorpi antinucleari e contemporaneamente la conferma di pattern monospecifici e misti a macchie fini dense. Il nuovo substrato HEp-2 utilizza una procedura standard di immunofluorescenza indiretta e criteri di interpretazione per lo screening di anticorpi antinucleari clinicamente rilevanti, noti anche come ANA. Il vantaggio principale è la capacità di distinguere il pattern denso e finemente speckled 70 dai pattern associati alla malattia, omogenei o misti impegnativi nella fase di screening.
A dimostrare la procedura sarà Sofia Badanin, un tecnico del nostro laboratorio di controllo qualità. Per i vetrini del substrato, utilizzare vetrini con 12 pozzetti su ciascun vetrino, contenenti le celle HEp-2 convenzionali o una miscela di celle HEp-2 HEp-2 convenzionali e dense a macchie fini. Lasciare che le buste contenenti i vetrini del substrato si equilibrino a temperatura ambiente per ottenere prestazioni ottimali e prevenire la condensazione dell'umidità sulla superficie del vetrino prima dell'aggiunta del campione.
Questo dovrebbe richiedere tra i 10 e i 15 minuti. Una volta bilanciato a temperatura ambiente, rimuovere con cura i vetrini del substrato utilizzando le dita, evitando il contatto tra i vetrini e i lati della busta. Etichettare i vetrini e metterli in una camera di incubazione rivestita con carta assorbente inumidita per evitare l'essiccazione dei vetrini durante l'incubazione del campione e coniugato.
Erogare circa 50 microlitri dei controlli negativi e positivi, nonché i sieri diluiti del paziente su pozzetti di vetrini individuali prima di posizionare i vetrini nella camera di incubazione. Il test ANA è il primo passo nello screening di una malattia autoimmune. È fondamentale evitare la contaminazione incrociata dei campioni dei pazienti sul vetrino per ridurre al minimo i risultati falsi positivi o falsi negativi.
Per evitare la contaminazione incrociata dei pozzi, evitare di riempire eccessivamente i pozzi. Posizionare il coperchio sulla camera di incubazione e incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Se c'è dell'ANA presente nel siero del paziente, si legherà alle cellule presenti in ogni volontà durante questo periodo.
Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera di incubazione. Tenere il vetrino all'estremità della linguetta e risciacquare delicatamente per 10-15 secondi con circa 10 millilitri di tampone di lavaggio salino tamponato con fosfato ricostituito. Trasferire immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin con tampone di lavaggio PBS e immergerlo per 10 minuti.
Ripetere il processo con tutte le diapositive rimanenti. Rimuovere solo un vetrino alla volta dal barattolo Coplin. Per rimuovere il tampone di lavaggio PBS in eccesso dal vetrino, picchiettare delicatamente o tamponare il vetrino su un tovagliolo di carta.
Su ogni pozzetto, applicare delicatamente una goccia di isotiocianato di fluoresceina, coniugato fluorescente IgG anti-umano. Quindi, incubare i vetrini nella camera di incubazione di colorazione chiusa per 30 minuti. Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera di incubazione.
Tenere il vetrino all'estremità della linguetta e risciacquare delicatamente come prima, con circa 10 millilitri di tampone di lavaggio PBS. Trasferire immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin con tampone di lavaggio PBS e immergerlo per 10 minuti. Posizionare i vetrini coprioggetto forniti nel kit su un tovagliolo di carta asciutto.
Sul bordo inferiore del vetrino coprioggetto, applicare in linea tra 3 e 4 gocce di supporto di montaggio. Quindi, estrarre un vetrino alla volta dal barattolo Coplin contenente il tampone di lavaggio. Per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso, picchiettare delicatamente o tamponare il vetrino sul tovagliolo di carta.
Evitare di lasciare una quantità eccessiva di tampone di lavaggio sul vetrino, di esercitare troppa pressione sul vetrino coprioggetti o di introdurre bolle d'aria. Tutti questi fattori possono influire sulla morfologia cellulare, sui modelli fluorescenti risultanti e sull'intensità delle reazioni. Abbassare delicatamente il vetrino sul vetrino coprioggetti, posizionando il bordo inferiore del vetrino sul bordo del vetrino coprioggetti.
Ciò consente al supporto di montaggio presente sul vetrino coprioggetto di fluire verso il bordo superiore del vetrino e riduce al minimo la formazione di bolle d'aria, che possono interferire con la lettura di ciascun pozzetto. Visualizza i vetrini con un microscopio a fluorescenza, utilizzando un set di filtri isotiocianato di fluoresceina situato in una camera oscura. Esaminare il campione per verificare la presenza di una specifica fluorescenza verde brillante al microscopio con un ingrandimento di 200 volte o superiore per effettuare l'interpretazione finale in merito alla positività e al modello.
Osservare i controlli positivi e negativi. Il controllo positivo mostrerà una fluorescenza verde brillante nel nucleo. Il controllo negativo non mostrerà alcuna fluorescenza verde specifica al microscopio a fluorescenza.
Registrare il risultato positivo o negativo per ogni pozzetto e includere il modello ANA per i casi positivi. Il substrato HEp-2 denso e finemente speckled 70 knockout preserva tutti i principali pattern nucleari e citoplasmatici. Il modello denso e finemente maculato è caratterizzato dalla presenza di colorazione maculata uniformemente distribuita in tutto il nucleo dell'interfase e dalla cromatina nella fase mitotica.
La presenza sia di cellule HEp-2 convenzionali che esprimono l'antigene 70 denso e finemente speckled sia di cellule HEp-2 ingegnerizzate prive dell'antigene facilita la distinzione accurata del pattern denso fine, pur mantenendo tutti i vantaggi dei substrati HEp-2 convenzionali. I sieri positivi per i principali pattern ANA associati alla malattia sono stati miscelati con un siero denso e finemente speckled 70 positivo in proporzioni uguali e testati sia su HEp-2 convenzionale che su HEp-2 denso finemente speckled 70 substrati knockout. Qui, le frecce rosse indicano le cellule in fase mitotica.
Le frecce gialle indicano i nuclei HEp-2 convenzionali e le frecce blu indicano i nuclei HEp-2 ingegnerizzati. Per tutte le combinazioni di reazioni raffigurate, il substrato denso e finemente macchiato 70 knockout mostra una chiara differenza di intensità tra le celle non modificate e le celle ingegnerizzate sullo stesso campo visivo. Ciò aiuta a distinguere le reazioni monospecifiche e miste dense a macchie fini 70
.Gli autoanticorpi contro gli antigeni nucleari e citoplasmatici sono altamente prevalenti nelle malattie autoimmuni sistemiche. È stato riportato che il pattern denso e finemente macchiato derivante da autoanticorpi contro DFS70, noto anche come proteina PSIP1, è altamente prevalente nelle popolazioni sane. Inoltre, questi autoanticorpi DFS70 si verificano sia in isolamento che con altri ANA associati alla malattia.
Ciò rende fondamentale per i laboratori clinici distinguere accuratamente questo modello da altri modelli associati alla malattia. Ad esempio, nel pattern maculato omogeneo misto, che è associato al Lupus, potrebbe essere interpretato erroneamente come pattern DFS70 che richiede più test di conferma. Il metodo di immunofluorescenza indiretta che utilizza substrati HEp-2 è considerato il metodo di screening gold standard per gli ANA.
Tuttavia, l'accuratezza dipende fortemente dall'abilità del tecnico, dall'attenta esecuzione dei singoli passaggi e dall'interpretazione accurata dei modelli risultanti. Al contrario, la valutazione comparativa dei substrati knockout convenzionali HEp-2 e DFS70 dimostra l'utilità di questo nuovo substrato nel distinguere il pattern DFS70 con elevata sicurezza, durante lo screening per gli ANA. Un'ulteriore interpretazione dei modelli DFS70 sia monopositivi che misti è stata relativamente semplificata utilizzando questo substrato HEp-2 migliorato.
Il nuovo substrato utilizza un protocollo standard di immunofluorescenza indiretta e criteri di interpretazione stabiliti per tutti i pattern ANA clinicamente rilevanti.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo saggio immunofluorescente indiretto che utilizza un substrato HEp-2 knockout DFS70 (dense fine speckled 70) per lo screening degli autoanticorpi antinucleari (ANAs). Il metodo migliorato aumenta la capacità di distinguere i pattern DFS70 da altri pattern ANA associati a malattie, fornendo un'elevata affidabilità nei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Autoimmunità
- Tecniche diagnostiche
Sfondo
- Gli autoanticorpi anti-DFS70 possono imitare i comuni profili di ANA.
- I substrati convenzionali HEp-2 possono portare a interpretazioni errate.
- I nuovi substrati migliorano l'accuratezza diagnostica.
- Comprendere i profili di ANA è fondamentale per la diagnosi delle malattie autoimmuni.
Scopo dello studio
- Dimostrare un nuovo saggio per lo screening degli ANA.
- Migliorare la distinzione dei pattern DFS70.
- Potenziare la sicurezza diagnostica nei casi di ANA monospecifici e misti.
Metodi Utilizzati
- Immunofluorescenza indiretta mediante l'uso di substrati HEp-2 ingegnerizzati.
- Incubazione dei sieri dei pazienti con vetrini porta-substrato.
- Microscopia a fluorescenza per l'interpretazione dei pattern.
- Confronto dei risultati tra substrati convenzionali e nuovi substrati.
Risultati principali
- Il nuovo substrato consente una chiara distinzione dei modelli DFS70.
- Maggiore accuratezza nell'identificazione dei modelli ANA misti.
- I controlli positivi e negativi convalidano il saggio.
- I risultati dimostrano differenze significative nell'intensità di fluorescenza.
Conclusioni
- Il nuovo saggio migliora l'affidabilità dello screening degli ANA.
- Fornisce un metodo solido per distinguere i pattern complessi degli ANA.
- Questo progresso potrebbe portare a risultati diagnostici migliori per le malattie autoimmuni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
La differenziazione accurata dei pattern DFS70 dai pattern ANA associati a malattie rimane una sfida critica nella diagnostica autoimmune, influenzando la sicurezza diagnostica e le decisioni successive. Il nuovo substrato HEp-2 privo di DFS70 consente la rilevazione simultanea e la distinzione di pattern monospecifici e misti di DFS70, mantenendo al contempo la sensibilità dei substrati HEp-2 convenzionali. Questo progresso favorisce una migliore validazione degli antigeni bersaglio e riduce l'ambiguità meccanicistica nei flussi di lavoro di scoperta precoce, chiarificando la specificità degli autoanticorpi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche distinguendo la reattività di DFS70 dai segnali di autoanticorpi associati a malattia.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante una chiara visualizzazione del legame specifico per DFS70 in cellule HEp-2 knock-out rispetto a quelle wild-type.
- Valore predittivo: Aumenta la sicurezza sul bersaglio isolando i pattern di DFS70 da sfondi omogenei o macchiati confondenti in campioni misti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Fornisce un sistema biologico standardizzato per lo screening successivo di ANA, con controlli interni integrati per la discriminazione dei pattern.
- Output quantitativo: Consente il confronto basato sull'intensità tra cellule HEp-2 convenzionali e knockout per confermare la presenza di DFS70.
- Riutilizzo della piattaforma: Mantiene la compatibilità con i flussi di lavoro IIF esistenti, permettendo un'integrazione senza interruzioni nei protocolli consolidati di screening degli autoanticorpi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori rivelando pattern di ANA associati alla malattia precedentemente oscurati dalla reattività verso DFS70.
- Continuità preclinica: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio migliorando la specificità nel profilo degli autoanticorpi nei modelli di malattia.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'interpretazione falsamente positiva nei modelli di lupus e di altri disturbi del tessuto connettivo risolvendo l'interferenza da DFS70.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto guida, in cui la specificità degli autoanticorpi orienta la selezione del bersaglio e la validazione del percorso.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo una chiara discriminazione tra reattività verso DFS70 e quelle verso antigeni nucleari associati a malattia.
- Screening: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante confronto affiancato di substrati HEp-2 wild-type e knockout sullo stesso vetrino.
- Analisi: Produce letture quantitative dell'intensità di fluorescenza che permettono una differenziazione oggettiva tra profili mono-specifici e misti di DFS70.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica migliorando l'accuratezza nel profilo degli autoanticorpi e riducendo il rumore nella scoperta di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come modulo di screening riutilizzabile piuttosto che come tecnica monouso, adattabile a diverse campagne di scoperta di autoanticorpi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli antigeni grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'interpretazione dei profili di ANA.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante controlli interni del substrato, che eliminano la variabilità tra pozzetti.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, migliorando la specificità nel rilevamento precoce degli autoanticorpi e riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio grazie a una chiara distinzione tra reattività benigna verso DFS70 e profili patogeni di autoanticorpi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'esecuzione del saggio di immunofluorescenza indiretta e nel riconoscimento dei pattern fluorescenti.
- È dipendente dalla microscopia a fluorescenza con filtro per FITC e da protocolli standardizzati di incubazione e lavaggio.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team per la manipolazione dei vetrini, l'aggiunta dei campioni e le procedure di acquisizione delle immagini, al fine di garantire risultati coerenti.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la validazione su diverse matrici sieriche e su titoli di autoanticorpi differenti, quando utilizzato in scenari con pattern misti.
- Le limitazioni pratiche comprendono la necessità di personale qualificato per interpretare le sottili differenze di intensità tra le popolazioni cellulari all'interno dello stesso campo visivo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Sample and Substrate Preparation
2:04
Addition of Controls and Samples
3:37
Addition of Fluorescent Conjugate and Analysis of Results
6:32
Results: Classic Disease Associated ANA and DFS70 Patterns on Conventional Hep-2 and Novel Hep-2 DFS70 Knockout Substrates
8:20
Conclusion
