Distinzione simultanea di monospecifici e modelli misti DFS70 durante lo Screening di ANA con un substrato romanzo HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un test di immunofluorescenza indiretto migliorato che utilizza un nuovo substrato HEp-2, denso a macchie fini 70 knockout per lo screening degli autoanticorpi antinucleari e contemporaneamente la conferma di pattern monospecifici e misti a macchie fini dense. Il nuovo substrato HEp-2 utilizza una procedura standard di immunofluorescenza indiretta e criteri di interpretazione per lo screening di anticorpi antinucleari clinicamente rilevanti, noti anche come ANA. Il vantaggio principale è la capacità di distinguere il pattern denso e finemente speckled 70 dai pattern associati alla malattia, omogenei o misti impegnativi nella fase di screening.

A dimostrare la procedura sarà Sofia Badanin, un tecnico del nostro laboratorio di controllo qualità. Per i vetrini del substrato, utilizzare vetrini con 12 pozzetti su ciascun vetrino, contenenti le celle HEp-2 convenzionali o una miscela di celle HEp-2 HEp-2 convenzionali e dense a macchie fini. Lasciare che le buste contenenti i vetrini del substrato si equilibrino a temperatura ambiente per ottenere prestazioni ottimali e prevenire la condensazione dell'umidità sulla superficie del vetrino prima dell'aggiunta del campione.

Questo dovrebbe richiedere tra i 10 e i 15 minuti. Una volta bilanciato a temperatura ambiente, rimuovere con cura i vetrini del substrato utilizzando le dita, evitando il contatto tra i vetrini e i lati della busta. Etichettare i vetrini e metterli in una camera di incubazione rivestita con carta assorbente inumidita per evitare l'essiccazione dei vetrini durante l'incubazione del campione e coniugato.

Erogare circa 50 microlitri dei controlli negativi e positivi, nonché i sieri diluiti del paziente su pozzetti di vetrini individuali prima di posizionare i vetrini nella camera di incubazione. Il test ANA è il primo passo nello screening di una malattia autoimmune. È fondamentale evitare la contaminazione incrociata dei campioni dei pazienti sul vetrino per ridurre al minimo i risultati falsi positivi o falsi negativi.

Per evitare la contaminazione incrociata dei pozzi, evitare di riempire eccessivamente i pozzi. Posizionare il coperchio sulla camera di incubazione e incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Se c'è dell'ANA presente nel siero del paziente, si legherà alle cellule presenti in ogni volontà durante questo periodo.

Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera di incubazione. Tenere il vetrino all'estremità della linguetta e risciacquare delicatamente per 10-15 secondi con circa 10 millilitri di tampone di lavaggio salino tamponato con fosfato ricostituito. Trasferire immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin con tampone di lavaggio PBS e immergerlo per 10 minuti.

Ripetere il processo con tutte le diapositive rimanenti. Rimuovere solo un vetrino alla volta dal barattolo Coplin. Per rimuovere il tampone di lavaggio PBS in eccesso dal vetrino, picchiettare delicatamente o tamponare il vetrino su un tovagliolo di carta.

Su ogni pozzetto, applicare delicatamente una goccia di isotiocianato di fluoresceina, coniugato fluorescente IgG anti-umano. Quindi, incubare i vetrini nella camera di incubazione di colorazione chiusa per 30 minuti. Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera di incubazione.

Tenere il vetrino all'estremità della linguetta e risciacquare delicatamente come prima, con circa 10 millilitri di tampone di lavaggio PBS. Trasferire immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin con tampone di lavaggio PBS e immergerlo per 10 minuti. Posizionare i vetrini coprioggetto forniti nel kit su un tovagliolo di carta asciutto.

Sul bordo inferiore del vetrino coprioggetto, applicare in linea tra 3 e 4 gocce di supporto di montaggio. Quindi, estrarre un vetrino alla volta dal barattolo Coplin contenente il tampone di lavaggio. Per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso, picchiettare delicatamente o tamponare il vetrino sul tovagliolo di carta.

Evitare di lasciare una quantità eccessiva di tampone di lavaggio sul vetrino, di esercitare troppa pressione sul vetrino coprioggetti o di introdurre bolle d'aria. Tutti questi fattori possono influire sulla morfologia cellulare, sui modelli fluorescenti risultanti e sull'intensità delle reazioni. Abbassare delicatamente il vetrino sul vetrino coprioggetti, posizionando il bordo inferiore del vetrino sul bordo del vetrino coprioggetti.

Ciò consente al supporto di montaggio presente sul vetrino coprioggetto di fluire verso il bordo superiore del vetrino e riduce al minimo la formazione di bolle d'aria, che possono interferire con la lettura di ciascun pozzetto. Visualizza i vetrini con un microscopio a fluorescenza, utilizzando un set di filtri isotiocianato di fluoresceina situato in una camera oscura. Esaminare il campione per verificare la presenza di una specifica fluorescenza verde brillante al microscopio con un ingrandimento di 200 volte o superiore per effettuare l'interpretazione finale in merito alla positività e al modello.

Osservare i controlli positivi e negativi. Il controllo positivo mostrerà una fluorescenza verde brillante nel nucleo. Il controllo negativo non mostrerà alcuna fluorescenza verde specifica al microscopio a fluorescenza.

Registrare il risultato positivo o negativo per ogni pozzetto e includere il modello ANA per i casi positivi. Il substrato HEp-2 denso e finemente speckled 70 knockout preserva tutti i principali pattern nucleari e citoplasmatici. Il modello denso e finemente maculato è caratterizzato dalla presenza di colorazione maculata uniformemente distribuita in tutto il nucleo dell'interfase e dalla cromatina nella fase mitotica.

La presenza sia di cellule HEp-2 convenzionali che esprimono l'antigene 70 denso e finemente speckled sia di cellule HEp-2 ingegnerizzate prive dell'antigene facilita la distinzione accurata del pattern denso fine, pur mantenendo tutti i vantaggi dei substrati HEp-2 convenzionali. I sieri positivi per i principali pattern ANA associati alla malattia sono stati miscelati con un siero denso e finemente speckled 70 positivo in proporzioni uguali e testati sia su HEp-2 convenzionale che su HEp-2 denso finemente speckled 70 substrati knockout. Qui, le frecce rosse indicano le cellule in fase mitotica.

Le frecce gialle indicano i nuclei HEp-2 convenzionali e le frecce blu indicano i nuclei HEp-2 ingegnerizzati. Per tutte le combinazioni di reazioni raffigurate, il substrato denso e finemente macchiato 70 knockout mostra una chiara differenza di intensità tra le celle non modificate e le celle ingegnerizzate sullo stesso campo visivo. Ciò aiuta a distinguere le reazioni monospecifiche e miste dense a macchie fini 70

Gli autoanticorpi contro gli antigeni nucleari e citoplasmatici sono altamente prevalenti nelle malattie autoimmuni sistemiche. È stato riportato che il pattern denso e finemente macchiato derivante da autoanticorpi contro DFS70, noto anche come proteina PSIP1, è altamente prevalente nelle popolazioni sane. Inoltre, questi autoanticorpi DFS70 si verificano sia in isolamento che con altri ANA associati alla malattia.

Ciò rende fondamentale per i laboratori clinici distinguere accuratamente questo modello da altri modelli associati alla malattia. Ad esempio, nel pattern maculato omogeneo misto, che è associato al Lupus, potrebbe essere interpretato erroneamente come pattern DFS70 che richiede più test di conferma. Il metodo di immunofluorescenza indiretta che utilizza substrati HEp-2 è considerato il metodo di screening gold standard per gli ANA.

Tuttavia, l'accuratezza dipende fortemente dall'abilità del tecnico, dall'attenta esecuzione dei singoli passaggi e dall'interpretazione accurata dei modelli risultanti. Al contrario, la valutazione comparativa dei substrati knockout convenzionali HEp-2 e DFS70 dimostra l'utilità di questo nuovo substrato nel distinguere il pattern DFS70 con elevata sicurezza, durante lo screening per gli ANA. Un'ulteriore interpretazione dei modelli DFS70 sia monopositivi che misti è stata relativamente semplificata utilizzando questo substrato HEp-2 migliorato.

Il nuovo substrato utilizza un protocollo standard di immunofluorescenza indiretta e criteri di interpretazione stabiliti per tutti i pattern ANA clinicamente rilevanti.