Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati
19 marzo 2018
Questo protocollo descrive una tecnica migliore per la raccolta abbondante di liquido cerebrospinale (CSF) senza contaminazione da sangue. Con una maggiore raccolta di campioni e purezza, altre analisi possono essere eseguite utilizzando CSF per avanzare la nostra comprensione delle malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.
L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la raccolta del liquido cerebrospinale dai topi senza contaminazione da sangue. Questo metodo fornisce un modo semplice e affidabile per raccogliere il liquido cerebrospinale per monitorare i biomarcatori delle malattie neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'aggiunta con il micromanipolatore per aiutare nella raccolta del liquido cerebrospinale dai topi riduce la contaminazione del sangue durante la raccolta.
Inizia posizionando un capillare di vetro tirato in un supporto capillare che è saldamente montato su un micromanipolatore. Successivamente, durante la visualizzazione attraverso un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza diritta per rompere la punta del capillare affilato in modo che il diametro interno della punta rotta sia di circa 10-20 micron. Quindi collegare un tubo sottile e una siringa all'altra estremità del supporto del capillare, collegare il tubo sottile e la siringa con una valvola a tre vie e spostare la valvola a tre vie per aprirla.
Quindi immergere la siringa per espellere eventuali contaminanti e creare una pressione positiva nel tubo capillare. Ripetere l'operazione alcune volte scollegando e ricollegando la siringa alla valvola a tre vie. Quindi aspirare l'aria da 100 a 200 microlitri prima del ricollegamento finale della siringa con la valvola a tre vie.
Spostare il micromanipolatore con il capillare in vetro lateralmente per evitare danni durante la procedura chirurgica. Prima di iniziare l'intervento, assicurarsi che il topo sia stato completamente anestetizzato pizzicando tutti e quattro gli arti e osservando l'assenza di reazione. Quindi usa le forbici da dissezione per tagliare e rifinire i peli nella parte posteriore della testa del topo da sopra gli occhi tra le orecchie fino alla parte inferiore del collo.
Fissare la testa del mouse utilizzando un adattatore per mouse con cornice stereotassica. Assicurarsi che la testina non possa muoversi e sia fissata saldamente nell'adattatore spingendo delicatamente verso il basso sulla testa del mouse. Usa le forbici e le pinze curve per tagliare la pelle del topo attraverso la parte posteriore del collo e poi lungo il centro del cranio tra le orecchie e gli occhi del topo.
Separare la pelle e il tessuto dall'area sopra la cisterna magna. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, sezionare con cura gli ultimi strati sottili di muscolo sulla base del cranio utilizzando una pinza e spostare questi strati di muscolo lateralmente e fuori dall'area di interesse. Una volta che la dura madre sopra la cisterna magna è esposta, utilizzare un batuffolo di cotone bagnato per pulire la membrana e quindi utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per asciugare l'area.
La cisterna magna appare triangolare con uno o due grandi vasi sanguigni che attraversano l'area. Entrambi i lati o tra i vasi sanguigni sono ottimali per l'inserimento capillare e la raccolta del liquido cerebrospinale. Una volta che la cisterna magna è esposta, utilizzare il micromanipolatore per allineare il capillare di vetro alla parte posteriore della testa del topo in modo che la punta affilata si trovi appena dietro la membrana con un angolo di 30-45 gradi.
Quindi, immergere la siringa una o più volte e poi spostare lo stantuffo indietro da 100 a 200 microlitri per assicurarsi che non ci siano contaminanti e che ci sia una pressione negativa nel capillare di vetro. Quindi avvicinare la punta del capillare alla membrana fino a quando non si nota resistenza, ma senza perforare la membrana. Toccare i comandi del micromanipolatore per picchiettare delicatamente il tubo capillare attraverso la membrana.
Il liquido cerebrospinale deve essere aspirato automaticamente nel tubo capillare una volta che l'apertura è stata perforata. Lasciare il capillare in posizione per raccogliere lentamente il liquido cerebrospinale. Se il liquido cerebrospinale ha smesso di fluire, aspirare lentamente la siringa verso l'alto di circa 50 microlitri per creare una maggiore pressione negativa nel capillare.
Da dieci a 15 microlitri di liquido cerebrospinale vengono raccolti in 10-30 minuti. Una volta raccolto il volume desiderato di liquido cerebrospinale, chiudere il tubo spostando la valvola a tre vie per chiudere e rimuovere la siringa collegata al tubo. Aprire e quindi chiudere il tubo per creare una pressione equalizzata nel capillare, nel tubo e nell'area esterna al capillare.
Quindi ricollegare la siringa prima di rimuovere delicatamente il capillare di vetro dal mouse utilizzando il micromanipolatore. Quindi, posizionare la provetta di raccolta contenente un microlitro di inibitore della proteasi 20X sotto la punta affilata del capillare di vetro. Aprire il tubo e immergere delicatamente la siringa.
Il liquido cerebrospinale deve fluire fuori dal capillare e nel tubo di raccolta. Dopo la raccolta, centrifugare a impulsi il liquido cerebrospinale per miscelare il campione con l'inibitore della proteasi sul fondo della provetta di raccolta. I campioni di liquido cerebrospinale possono essere aliquotati e quindi conservati per ulteriori analisi a meno 80 gradi Celsius.
Il liquido cerebrospinale raccolto da topi APP/PS1 ha dimostrato un aumento significativo dei livelli di A beta 42 umano a 12 mesi di età. Nei topi wild type, non è stato rilevato alcun A beta 42 umano. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare i vasi sanguigni durante l'inserimento del capillare e di apportare solo piccole regolazioni con il micromanipolatore durante la raccolta del liquido cerebrospinale per evitare la contaminazione con il sangue.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo migliorato per la raccolta del liquido cerebrospinale (LCS) da topi con minima contaminazione sanguigna. Utilizzando un micromanipolatore, questa tecnica migliora la purezza e il volume del campione, consentendo una migliore analisi dei biomarcatori nelle malattie neurali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Analisi del liquido cerebrospinale
- Ricerca sulle malattie neurologiche
Sfondo
- Il LCS è fondamentale per comprendere le malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.
- La contaminazione da sangue durante la raccolta può compromettere i risultati della ricerca.
- Metodi di raccolta migliorati possono migliorare l'integrità del campione per l'analisi dei biomarcatori.
- Questa tecnica mira a facilitare lo studio delle condizioni neurodegenerative.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la raccolta del LCS dai topi.
- Minimizzare la contaminazione sanguigna durante il processo di raccolta.
- Consentire un monitoraggio più accurato dei biomarcatori delle malattie neurali.
Metodi utilizzati
- Il metodo utilizza un micromanipolatore con un capillare di vetro per una raccolta precisa del LCS dalla cisterna magna.
- I topi vengono adeguatamente anestetizzati e vengono impiegate tecniche chirurgiche per esporre la cisterna magna per l'inserimento del capillare.
- Non sono riferiti flussi di lavoro multiomics; l'attenzione è sulla raccolta del LCS.
- La procedura può essere completata in circa un'ora con pratica.
- Il LCS viene miscelato con un inibitore della proteasi dopo la raccolta per la conservazione.
Risultati principali
- La tecnica permette la raccolta di 10-15 microlitri di LCS entro 10-30 minuti.
- Il LCS raccolto dai topi APP/PS1 ha mostrato un significativo aumento dei livelli di A beta 42 umano a 12 mesi.
- Nessun A beta 42 è stato rilevato nei campioni di topi wild-type.
- L'efficienza della procedura e la capacità di evitare la contaminazione sanguigna sono state dimostrate con successo.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo efficace per ottenere LCS dai topi minimizzando la contaminazione.
- La purezza e il volume migliorati del LCS raccolto possono migliorare l'analisi dei biomarcatori nella ricerca sulle malattie neurali.
- Contribuisce a una migliore comprensione della dinamica del liquido cerebrospinale nei disturbi neurologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through biomarker analysis in a disease-relevant system with reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides reproducible access to CSF for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-based go/no-go decisions by improving confidence in target-related molecular changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified CSF samples suitable for quantitative biomarker assays, enhancing screening reliability.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, reducing variability in downstream analytical workflows.
- Scalability: Enables consistent CSF collection across cohorts, supporting assay validation and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment from discovery through preclinical validation using disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of target biomarkers like human A beta 42 in APP/PS1 mice, strengthening predictive confidence.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven progression decisions based on detectable biomarker changes in neural disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through biomarker measurement in CSF.
- Screening: Enables assay-ready sample generation with consistent volume and purity for compound evaluation.
- Analytics: Yields quantitative biomarker readouts (e.g., human A beta 42) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects CSF biomarker dynamics to preclinical disease progression in genetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable capability for CSF collection across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through cleaner, higher-volume biomarker data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of CSF collection across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed experiments due to contaminated or insufficient samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable biomarker fluctuations in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and micromanipulator operation for precise capillary positioning.
- Dependent on dissection microscopy, stereotaxic framing, and fluid handling instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of surgical and collection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation to other models may require anatomical adjustments due to variations in cisterna magna accessibility.
- Practical limitations include dependence on operator skill and potential physiological variability in CSF yield.
