Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la raccolta del liquido cerebrospinale dai topi senza contaminazione da sangue. Questo metodo fornisce un modo semplice e affidabile per raccogliere il liquido cerebrospinale per monitorare i biomarcatori delle malattie neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'aggiunta con il micromanipolatore per aiutare nella raccolta del liquido cerebrospinale dai topi riduce la contaminazione del sangue durante la raccolta.

Inizia posizionando un capillare di vetro tirato in un supporto capillare che è saldamente montato su un micromanipolatore. Successivamente, durante la visualizzazione attraverso un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza diritta per rompere la punta del capillare affilato in modo che il diametro interno della punta rotta sia di circa 10-20 micron. Quindi collegare un tubo sottile e una siringa all'altra estremità del supporto del capillare, collegare il tubo sottile e la siringa con una valvola a tre vie e spostare la valvola a tre vie per aprirla.

Quindi immergere la siringa per espellere eventuali contaminanti e creare una pressione positiva nel tubo capillare. Ripetere l'operazione alcune volte scollegando e ricollegando la siringa alla valvola a tre vie. Quindi aspirare l'aria da 100 a 200 microlitri prima del ricollegamento finale della siringa con la valvola a tre vie.

Spostare il micromanipolatore con il capillare in vetro lateralmente per evitare danni durante la procedura chirurgica. Prima di iniziare l'intervento, assicurarsi che il topo sia stato completamente anestetizzato pizzicando tutti e quattro gli arti e osservando l'assenza di reazione. Quindi usa le forbici da dissezione per tagliare e rifinire i peli nella parte posteriore della testa del topo da sopra gli occhi tra le orecchie fino alla parte inferiore del collo.

Fissare la testa del mouse utilizzando un adattatore per mouse con cornice stereotassica. Assicurarsi che la testina non possa muoversi e sia fissata saldamente nell'adattatore spingendo delicatamente verso il basso sulla testa del mouse. Usa le forbici e le pinze curve per tagliare la pelle del topo attraverso la parte posteriore del collo e poi lungo il centro del cranio tra le orecchie e gli occhi del topo.

Separare la pelle e il tessuto dall'area sopra la cisterna magna. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, sezionare con cura gli ultimi strati sottili di muscolo sulla base del cranio utilizzando una pinza e spostare questi strati di muscolo lateralmente e fuori dall'area di interesse. Una volta che la dura madre sopra la cisterna magna è esposta, utilizzare un batuffolo di cotone bagnato per pulire la membrana e quindi utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per asciugare l'area.

La cisterna magna appare triangolare con uno o due grandi vasi sanguigni che attraversano l'area. Entrambi i lati o tra i vasi sanguigni sono ottimali per l'inserimento capillare e la raccolta del liquido cerebrospinale. Una volta che la cisterna magna è esposta, utilizzare il micromanipolatore per allineare il capillare di vetro alla parte posteriore della testa del topo in modo che la punta affilata si trovi appena dietro la membrana con un angolo di 30-45 gradi.

Quindi, immergere la siringa una o più volte e poi spostare lo stantuffo indietro da 100 a 200 microlitri per assicurarsi che non ci siano contaminanti e che ci sia una pressione negativa nel capillare di vetro. Quindi avvicinare la punta del capillare alla membrana fino a quando non si nota resistenza, ma senza perforare la membrana. Toccare i comandi del micromanipolatore per picchiettare delicatamente il tubo capillare attraverso la membrana.

Il liquido cerebrospinale deve essere aspirato automaticamente nel tubo capillare una volta che l'apertura è stata perforata. Lasciare il capillare in posizione per raccogliere lentamente il liquido cerebrospinale. Se il liquido cerebrospinale ha smesso di fluire, aspirare lentamente la siringa verso l'alto di circa 50 microlitri per creare una maggiore pressione negativa nel capillare.

Da dieci a 15 microlitri di liquido cerebrospinale vengono raccolti in 10-30 minuti. Una volta raccolto il volume desiderato di liquido cerebrospinale, chiudere il tubo spostando la valvola a tre vie per chiudere e rimuovere la siringa collegata al tubo. Aprire e quindi chiudere il tubo per creare una pressione equalizzata nel capillare, nel tubo e nell'area esterna al capillare.

Quindi ricollegare la siringa prima di rimuovere delicatamente il capillare di vetro dal mouse utilizzando il micromanipolatore. Quindi, posizionare la provetta di raccolta contenente un microlitro di inibitore della proteasi 20X sotto la punta affilata del capillare di vetro. Aprire il tubo e immergere delicatamente la siringa.

Il liquido cerebrospinale deve fluire fuori dal capillare e nel tubo di raccolta. Dopo la raccolta, centrifugare a impulsi il liquido cerebrospinale per miscelare il campione con l'inibitore della proteasi sul fondo della provetta di raccolta. I campioni di liquido cerebrospinale possono essere aliquotati e quindi conservati per ulteriori analisi a meno 80 gradi Celsius.

Il liquido cerebrospinale raccolto da topi APP/PS1 ha dimostrato un aumento significativo dei livelli di A beta 42 umano a 12 mesi di età. Nei topi wild type, non è stato rilevato alcun A beta 42 umano. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare i vasi sanguigni durante l'inserimento del capillare e di apportare solo piccole regolazioni con il micromanipolatore durante la raccolta del liquido cerebrospinale per evitare la contaminazione con il sangue.