Name: Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Scopri come generare e identificare knockout genici CRISPR/Cas9 in Danio rerio con questo protocollo semplice e robusto. Ideale per ricercatori di ogni livello per studiare funzioni geniche nello sviluppo.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R21CA182197 di J.O.), il Ralph W. e Grace M. Showalter Research Trust e dal Purdue scienze agrarie ed estensione per il programma di sviluppo economico (AgSEED). Dati di sequenziamento Sanger sono stati acquisiti da parte dell'impianto di Purdue Genomics Core supportati da P30 CA023168. Mary Witucki è stata sostenuta dal Purdue University Center per cancro ricerca estate Undergraduate Research programma supportato dalla Carroll County Cancer Association. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo Benjamin Carter, Ellen Denning e Taylor Sabato per fornire un feedback critico sul manoscritto. Ringraziamo il dipartimento di biochimica per il supporto di questo lavoro e il centro di ricerca di Zebrafish presso la Purdue University per la loro dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia di zebrafish. Infine, ringraziamo il Core genomica di Purdue e contributi di Phillip San Miguel per quanto riguarda i servizi NGS.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive la produzione di knockout del gene nel sistema modello vertebrati zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Un numero di protocolli precedentemente è state descritte per intraprendere ingegneria CRISPR-mediata del genoma in zebrafish15,25,26,50,51,52. Questo protocollo si basa su precedenti sforzi combinando una serie di tecniche sperimentali semplici ma riproducibile coerente, in particolare HMA e NGS di più pesci eterozigoti, per creare un semplice, economico e sperimentalmente robusto protocollo per mutagenesi CRISPR-mediata in zebrafish che è adatto per i laboratori con personale con una gamma di esperienza e formazione, nonché a laboratori didattici.
Consigli per la progettazione e sintesi di guida che RNAs sono inclusi in questo protocollo. Una considerazione importante nella Guida di progettazione di RNA è la minimizzazione degli effetti fuori bersaglio. Diversi algoritmi di previsione sono stati sviluppati per consentire CRISPR-agli utenti di accedere agli strumenti di calcolo con facile da usare interfacce grafiche che consentono di stimare sia l'attività della guida sulla destinazione e la possibilità di effetti fuori bersaglio34, 35,36. Un vantaggio specifico del sistema zebrafish è abbassato i tassi di effetti fuori bersaglio perché la Cas9 è iniettato in embrioni e quindi espressione è transitoria, che ha dimostrato nei topi per provocare una riduzione fuori bersaglio effetti53. Tuttavia, sono stati dimostrati effetti fuori bersaglio per accadere in zebrafish54. Un modo per controllo per effetti fuori bersaglio è a fenotipo fondatore zebrafish che sono stati generati da due RNA guida indipendente che utilizzano lo stesso gene, in quanto queste guide sarebbe molto probabile che influiscono su diversi siti fuori bersaglio. Un metodo alternativo per ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio che non è descritto in questo protocollo è l'utilizzo di un mutato Cas9 che genera rotture del singolo filo al bersaglio del DNA, che sono riparate con alta efficienza. Abbinamento del DNA Nick nelle immediate vicinanze di un altro che sono complementari all'opposto strands risultati nella formazione di indel efficace al luogo desiderato e minimizza gli effetti fuori bersaglio55,56.
Oltre ad avere diversi tassi di effetti fuori bersaglio, sgRNAs diversi possono avere diversi tassi di mutagenesi del target desiderato57,58,59. Questo protocollo utilizza HMA per analizzare l'efficienza di mutagenesi di un determinato sgRNA utilizzando dell'eteroduplex band formazione33,40. Bande dell'eteroduplex vengono creati tramite l'ibridazione di filamenti di DNA PCR-generato che contengono disadattamento e può essere facilmente risolto utilizzando l'elettroforesi del gel. A differenza di altri metodi comunemente usati per misurare indel formazione, quali le endonucleasi T7 dosaggio o alta risoluzione sciogliere analisi25,26, HMA non richiede un enzima costoso per tagliare il DNA non corrispondente e non richiede complicate analisi di PCR si fondono le curve. Soprattutto, anche utilizzando HMA per verificare i tassi alti di indel formazione nella popolazione iniettata consente al ricercatore di ridurre al minimo il numero di pesci necessari per la successiva produzione di linee di knock-out, che riduce il costo di identificazione di una mutazione con il caratteristiche desiderate.
La relativa facilità di generazione basato su CRISPR indels consente la creazione di alleli multipli di geni multipli in una sola volta. Software web-based è disponibile per l'analisi delle singole mutazioni eterozigoti pesce utilizzando Sanger sequenziamento di prodotti PCR49. Nel caso in cui sono analizzati tre o più alleli mutati CRISPR, NGS per caratterizzare la natura della indel è probabilmente più efficace in termini di costo per caratterizzare la natura di indel come questo approccio consente un pool di fino a 50 diversi alleli per essere caratterizzato in o NCE (Vedi Tabella materiali)60,61,62. Tale economia di scala probabilmente sarebbe particolarmente utile in un ambiente di laboratorio dello studente non laureato.
In sintesi, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione riproducibile CRISPR-reagenti di alta qualità (in particolare, sgRNA) tale che un minor numero di pesci adulti devono essere creati e analizzati per identificare con successo gli alleli del mutante di interesse, che riduce anche il tempo e il costo di generare le righe desiderate. D'importanza, questo protocollo è stato progettato tali che può essere applicato dai laboratori con risorse limitate per la produzione di zebrafish mutanti in maniera conveniente. Inoltre, abbiamo trovato che questo approccio è adatto per gli studenti universitari e così si espande le opportunità di istruzione e formazione di studenti universitari interessati a un'esperienza pratica in editing basato su CRISPR genomico.

La conservazione di macchine molecolari attraverso eucarioti sottende il potere di utilizzare organismi modello per la ricerca. Molti di questi sistemi modello facilitare l'uso di approcci di genetica inversa come TNA knockouts genica mirata a caratterizzare il contributo di un prodotto del gene di un processo biologico o malattia di interesse. Tecniche di rottura del gene in organismi come zebrafish hanno storicamente invocata Introduzione mirata di mutazioni frameshift che derivano da riparazione imprecisa di DSBs1,2. Quando un DSB è stato introdotto nel genoma, la lesione del DNA è riparata attraverso una delle due vie che sono universalmente presenti in quasi tutti i tipi di cellule e organismi: non-omologo fine unirsi (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR)3,4 . L'imprecisione del macchinario NHEJ produce frequentemente indels di varie lunghezze5,6,7,8,9. Introduzione di mutazioni frameshift nella sequenza di codificazione di un gene in grado di produrre un codone di stop prematuro, che spesso rende il gene non funzionali.
Strategie di ingegneria genoma iniziali in zebrafish per promuovere indels includono meganucleases, nucleasi a dita di zinco e nucleasi di attivatore-come effettore trascrizione, tutti di cui utilizzato interazioni della DNA-proteina per impostare come destinazione una nucleasi a uno specifico genomica destinazione dove ha introdotto un DSB10,11,12,13,14,15. Tuttavia, queste tecnologie sono spesso difficili da applicare a causa la laboriosa e complessa ingegneria necessaria per generare una nucleasi che rivolge la sequenza di DNA di interesse. A differenza delle precedenti strategie, basate su CRISPR gene editing non si basa su interazioni proteina-DNA per il targeting. Invece, l'endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) sono diretto tramite una guida di RNA che utilizza del nucleotide base pairing interazioni di destinare un sito genomico di interesse16,17,18,19 ,20,21. Grazie alla semplicità di progettazione di un RNA guida con la base desiderata interazioni per bersagliandola di accoppiamento è relativamente facile per indirizzare l'endonucleasi di Cas per il luogo desiderato. Il tipo sistema di II CRISPR in particolare è stato ampiamente sviluppato per applicazioni di editing del genoma a causa di diverse caratteristiche vantaggiose, compreso l'uso di una singola nucleasi Cas multidominio (Cas9) che richiede l'interazione con il DNA per stimolare attività endonucleasica e uso di una singola guida RNA (sgRNA) per scegliere come target e le cognate di sequenza di DNA18. I requisiti di sequenza necessari per il targeting del sgRNA cognata sono ben compreso19, e il sgRNA desiderato è facilmente generato da trascrizione in vitro . La semplicità e la robustezza dell'approccio CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificazione genetica mirata in zebrafish e una vasta gamma di altri organismi.
La maggiore capacità di intraprendere l'editing genomico mirato in zebrafish come risultato lo sviluppo di reagenti a base CRISPR ha significativamente aumentato la possibilità di studiare processi emblematici di organismi vertebrati come sviluppo del sistema nervoso centrale sistema. Il genoma di zebrafish contiene ortologhi del 70% dei geni codificanti per proteine trovati il genoma umano, nonché l'84% dei geni associati a malattie in esseri umani22. Zebrafish sviluppo esibisce parecchie qualità chiave che migliorano l'utilizzo in studi di genetica inverso: gli embrioni vengono deposte in grandi frizioni, sviluppano esternamente dalla madre che li rende suscettibili di genetica manipolazione di microiniezione e zebrafish adulto sessualmente maturi entro 3 mesi dell'età, permettendo per propagazione rapida di righe desiderate23.
Sono disponibili numerosi protocolli che descrivono una varietà di approcci per generare e identificare CRISPR-derivato indels in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Tuttavia, molte di queste procedure sono tempo intensivo, richiedono l'accesso all'apparecchiatura costosa e può essere difficile per i laboratori con limitata esperienza in campo. I passaggi descritti nel presente documento forniscono una semplice, robusta ed economica CRISPR/Cas9-strategia per ingegnere zebrafish knockout linee. Questo protocollo descrive l'uso di un kit altamente efficiente per sintetizzare sgRNAs usando i oligonucleotides del DNA (oligos), simile ad altri approcci che sono stati precedentemente descritto32. Il protocollo descritto include due passaggi in particolare che semplificano notevolmente l'analisi delle linee CRISPR-mutato: dettagliata uso della PCR-basata HMA33 determinare facilmente la presenza di modificazioni del genoma e l'analisi di sequenziamento di eterozigote zebrafish rapidamente e facilmente determinare la natura di più indels in modo economico. Inoltre, le istruzioni dettagliate sono incluse per selezione robusto, affidabile produzione e iniezione di guida RNAs. I passaggi descritti qui esemplificano un protocollo robusto, relativamente poco costoso che permette al personale di laboratorio con una gamma di competenze contribuire all'identificazione dei Ko del gene in zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Software di analisi sgRNA CRISPOR</td><td></td><td></td><td>. Software di</td></tr> <tr><td>analisi sgRNA</td>http://crispor.tefor.net/ <td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td>. https://omictools.com/breaking-cas-tool</tr><tr><td>Software di analisi sgRNA</td> <td>ChopChop</td><td></td><td></td>. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr>Tecnica <td></td><td></td><td>senza RNasi</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>acqua priva di RNasi</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Sintesi di RNA guida. Thermo Fisher e Qiagen trasportano entrambi acqua adatta.</td></tr><tr><td>Etanolo privo di RNASI</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>L'etanolo di grado di biologia molecolare è privo di Rnasi. Fischer, VWR vendono etanolo adatto.</td></tr><tr><td>Proteina Cas9</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Proteina Cas9 con segnale di localizzazione nucleare.</td></tr><tr><td>Targeting specifici di oligo</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Sintetizzare RNA guida.</td></tr><tr><td>Primer PCR che fiancheggiano la guida Sito di taglio dell'RNA</td><td>Tecnologie del DNA integrate (IDT)</td><td></td><td>Utilizzo per analisi eteroduplex, prodotto da 100-300 bp.</td></tr><tr><td>Primer PCR che affiancano la guida Sito di taglio dell'RNA</td><td>Tecnologie DNA integrate (IDT)</td><td></td><td>Da utilizzare per il sequenziamento degli alleli CRISPR, prodotto consigliato da 300-600 bp.</td></tr><tr><td>Kit di sintesi EnGen sgRNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>RNA guida per la trascrizione in vitro.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>Tampone privo di RNasi per l'elettroforesi degli acidi nucleici.</td></tr><tr><td>6X Carico Colorante</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Caricamento DNA per elettroferesi.</td></tr><tr><td>5M Acetato di ammonio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Reagente di pulizia per la purificazione degli RNA guida.</td></tr><tr><td>Etanolo (200 proof, senza nucleasi)</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Reagente per la pulizia per la purificazione degli RNA guida. I materiali di grado molecolare sono privi di RNasi.</td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per la sintesi e la purificazione di RNA guida.</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>10328011</td><td>elimina la contaminazione da RNasi da superfici, attrezzature, vetreria.</td></tr><tr><td>Scala del DNA, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Standard di peso molecolare per l'elettroforesi su gel del DNA.</td></tr><tr><td>Scala del DNA, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Standard di peso molecolare per l'elettroforesi su gel del DNA.</td></tr><tr><td>Scala di RNA</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Marcatore di RNA a singolo filamento per verificare che l'intero sgRNA sia stato sintetizzato</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting in gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Fusione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>40% Poliacrilammide (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Fusione di gel di poliacrilammide denaturante.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Fusione di gel di poliacrilammide denaturante.</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Guida di caricamento dell'RNA su gel denaturante per elettroforesi.</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualizzazione degli acidi nucleici.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Metodo alternativo al bromuro di etidio per la rilevazione del dsDNA in gel di agarosio o poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Pulizia dell'RNA, purificazione PCR.</td></tr><tr><td>MyTaq Polimerasi</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Per l'amplificazione del DNA mediante PCR.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Amplificazione PCR</td> <td>di qualsiasi marca</td><td></td>.</tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>NanoDrop o prodotto correlato per quantificare la quantità di DNA/RNA.</td></tr><tr><td>Terreni embrionali</td><td>E3 Terreni realizzati in casa</td><td></td><td>per l'allevamento di embrioni e la produzione di piastre di iniezione. Ricetta: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Metilene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Aggiunto a 1x terreno E3 per prevenire la crescita fungina sugli embrioni.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Conservare gli embrioni, piastra di iniezione fusa.</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Stampo per microineccitazione</td><td>Strumenti di scienza adattiva</td><td>TU-1</td><td>Per creare pozzetti per trattenere gli embrioni durante l'iniezione.</td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Colorante per la visualizzazione dell'iniezione.</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Per calibrare il volume di iniezione dell'ago.</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento Qualsiasi</td><td>marca</td><td></td><td>Moving embryos.</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Taglio dell'ago per iniezione, taglio della coda di pesce adulto.</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Mantenimento degli embrioni a 28,5 oC.</td></tr><tr><td>Estrattore per pipette Verticle</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Geneate aghi per iniezione. Istruzioni aggiuntive per l'estrazione dell'ago: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Geneate aghi per iniezione.</td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Caricare la soluzione negli aghi per iniezione.</td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Iniezione di embrioni.</td></tr><tr><td>Microscopio dissezionatore</td><td>Leica</td><td></td><td>Iniezione di embrioni.</td></tr><tr><td>30% Poliacilammide (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Colata di gel eteroduplex.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Anestetizzare il pesce zebra per il taglio della coda e l'estrazione di gDNA da embrioni. Ricetta: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Piastra di iniezione per colata, gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Scala</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Piastra di iniezione per colata, gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per espellere il liquido dal capillare per l'iniezione di embrioni.</td></tr><tr><td>1.000 &micro; L&nbsp; suggerimenti</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>200 &micro; L tips</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>10 &micro; L tips</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>di qualsiasi marca</td><td></td><td>Per tutti gli aspetti del protocollo.</td></tr><tr><td>Piattaforma di sequenziamento NGS: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Se il tuo istituto non offre questo servizio, visita: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (costo esterno: $ 35).</td></tr><tr><td>Software per l'analisi di sequenze</td><td></td><td></td><td>Per il sequenziamento Sanger di pesci eterozigoti. Visita: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Software per l'analisi</td><td></td><td></td><td>delle sequenze SnapGene Viewer, Sequence Scanner per l'analisi del sequenziamento NGS.</td></tr></tbody></table>

produzione efficiente e identificazione di crispr/cas9-generato gene ko nel sistema modello danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Caratterizzazione dei cluster, regolarmente intervallate, breve, palindromi ripetere (CRISPR) sistema di Streptococcus pyogenes ha consentito lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per generare velocemente le modifiche gene in un'ampia varietà di organismi, tra cui zebrafish. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) ad un target di DNA (gDNA) genomica di interesse, dove l'endonucleasi Cas genera una rotture a doppio filamento (DSB). Riparazione di DSBs di piombo errori meccanismi per inserimenti e/o delezioni (indels). Ciò può causare mutazioni frameshift che spesso introducono un codone di stop prematuro all'interno la sequenza codificante, creando così un allele di proteina da null. Basato su CRISPR genoma ingegneria richiede solo pochi componenti molecolari e facilmente è stato introdotto negli embrioni di zebrafish di microiniezione. Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per generare i reagenti CRISPR per il microinjection di zebrafish e identificare pesce espositrici trasmissione nella linea germinale dei geni CRISPR-modificato. Questi metodi includono trascrizione in vitro di sgRNAs, microiniezione di reagenti CRISPR, identificazione di indels indotto al sito di destinazione utilizzando un metodo basato su PCR chiamato un analisi di mobilità dell'eteroduplex (HMA) e la caratterizzazione dei indels utilizzando sia un basso rendimento e un potente sequenziamento di nuova generazione (NGS)-base di approccio che può analizzare i prodotti di PCR più raccolti da pesci eterozigoti. Questo protocollo è ottimizzato per ridurre al minimo il numero di pesci richiesto sia i tipi di attrezzature necessarie per eseguire le analisi. Inoltre, questo protocollo è progettato per essere favorevole per l'uso da personale di laboratorio di tutti i livelli di esperienza tra cui undergraduates, consentendo di questo potente strumento da impiegare economicamente da qualsiasi gruppo di ricerca interessato a condurre basati su CRISPR modifica genomica in zebrafish.

Gli approcci sperimentali descritti nel presente protocollo consentono una produzione efficiente e conveniente di zebrafish knock-out linee utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. Le figure seguenti sono state incluse in questo articolo per facilitare l'interpretazione e la risoluzione dei problemi dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo. Dopo il successo della produzione e microiniezione di CRISPR-reagenti, gli embrioni di zebrafish possono essere analizzati per fenotipi palesi e per formazione di indel utilizzando HMA. Un controllo utile per visualizzare il successo dell'esperimento della CRISPR è l'uso di sgRNA descritto nel passaggio 1.5 per indirizzare il gene produttrici di pigmento tirosinasi. Formazione di indel indotta da Cas9 a tirosinasi si traduce in perdita di pigmentazione e facilmente è segnato da 48 hpf (Figura 1). Un altro utile controllo affinché la preparazione dei CRISPR-reagenti per iniezione ha avuto successo, è quello di verificare che Full-Length (120 nt) sgRNA è stato sintetizzato utilizzando un gel di poliacrilammide denaturante (Figura 2, Lane 1 e 2). Se il RNA è stato degradato potrebbe apparire come una sbavatura, ad esempio Lane 3 (Figura 2) Mostra RNA degradato che non è adatto per l'iniezione.
Per analizzare la frequenza di formazione di indel di geni presi di mira da CRISPR-Cas9 che non si traducono in fenotipi evidenti quali tirosinasi, HMA analisi è un metodo semplice e affidabile. sgRNA/Cas9 embrioni iniettati analizzati usando HMA risultati nella formazione di bande dell'eteroduplex e riduzione dell'intensità della banda omoduplex (Figura 4). La presenza di bande dell'eteroduplex è ulteriormente utilizzata nel presente protocollo per identificare potenziali fondatore pesce da embrioni iniettati e come adulti (Figura 4 e Figura 5), per analizzare l'efficienza di trasmissione germinale di un fondatore ( Figura 6) e per verificare la presenza di un indel in un pesce di F1 eterozigote (Figura 7). I pesci eterozigoti che contengono un indel sono candidati per NGS per identificare la natura della indel e per determinare se un codone di stop prematuro è presente nella regione codificante del gene target.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Figura 1 : Embrioni di Zebrafish presentano un difetto di pigmento quando iniettato con un sgRNA targeting tirosinasi nella fase uno-cell. Uninjected (A) Wild-type, embrione alle 48 hpf e (B) iniettato embrione alle 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Figura 2 : Trascrizione in vitro di sgRNA utilizzando sintesi kit. I oligos sono stati sintetizzati utilizzando trascrizione in vitro secondo le istruzioni del kit di sintesi sgRNA. 500 ng di RNA è stato eseguito su un gel di urea/pagina come descritto. sgRNA caricato nelle corsie 1 e 2 viene illustrata una fascia corrispondente per l'intera lunghezza, intatto 120 nt RNA. Il sgRNA in vicolo 3 Mostra un campione di RNA degradato che non è adatto per l'iniezione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Figura 3 : Confronto della salute del 24 embrioni iniettati hpf. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, è facilmente distinguibile da un embrione che ha interrotto lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano a (B) o che hanno drasticamente alterato funzioni per (A), come la curvatura spinale o alterato testa e lo sviluppo dell'occhio dovrebbe essere rimosso dal piatto. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Figura 4 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di sgRNA-Cas9 microiniettati embrioni di zebrafish. Piscine di 5 embrioni per esempio sono stati raccolti a 72 hpf e gDNA è stata estratta. L'analisi dell'eteroduplex è stata eseguita come descritto, i campioni sono stati caricati ugualmente con 500 ng di DNA. Corsie: M = 100 bp segnapunti; 1 = controllo uninjected; 2 = iniezione campione 1; 3 = iniezione campione 2. Banda dimensioni attese = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Figura 5 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di gDNA estratta dalla coda di un adulto CRISPR-iniettato zebrafish. Gli embrioni che sono stati iniettati con un sgRNA e Cas9 della proteina sono stati coltivati fino all'età adulta (3 mesi). Pesce B e C presentano bande dell'eteroduplex e successivamente sono stati allevati per identificare indels germline trasmessi; pesce A non è stato usato in analisi successiva perché non presenta una banda positiva dell'eteroduplex. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce A; 3 = pesce B; 4 = pesce C. previsto la taglia = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Figura 6 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di singoli embrioni generati da allevamento un zebrafish CRISPR F0-iniettato ad un pesce selvaggio-tipo per identificare germline trasmessi indels. Zebrafish sono stati accoppiati e sono stati raccolti gli embrioni di F1 coltivati per embrioni singolo h. 72 e l'analisi dell'eteroduplex eseguita come descritto. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2-10 = un singolo embrione di F1 per corsia. Questo gel viene illustrato che 7 su 10 embrioni mostrano una banda positiva dell'eteroduplex, che indica la velocità di trasmissione germinale del 70% la indel. Banda dimensioni attese = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Figura 7 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di videoclip per adulti F1 zebrafish coda. Pesci adulti di F1 sono stati segnati da HMA per identificare indels. Pesce che ha esibito una banda positiva dell'eteroduplex erano PCR amplificato e sottoposti ad analisi di sequenziamento ampia per determinare la natura della mutazione. Corsie (A): 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce (4 bp delezione, 1 mancata corrispondenza di bp). (B) questi F1 pesce sono stati identificati dal fondatore stesso e ancora mostrare differenti dell'eteroduplex patterning, che indica la trasmissione nella linea germinale di alleli multipli modificati da un singolo fondatore. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce B (mancata corrispondenza di bp 7, 4 bp inserimento), 3 = pesce C (omissione di bp 4, 4 bp mancata corrispondenza). Ciascuno di questi indels creato un codone di stop prematuro nella sequenza di codificazione del gene dell'obiettivo, come determinato da NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire l'editing mirato del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 nel pesce zebra per ingegnerizzare i knockout genici in modo robusto ed economico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo biologico di un gene nel contesto di un sistema modello di vertebrati, come ad esempio il modo in cui un gene contribuisce ai processi di sviluppo negli eucarioti di ordine superiore. Con queste semplici e robuste procedure, il personale di laboratorio di tutti i livelli di esperienza, compresi gli studenti universitari, può eseguire modifiche genomiche mirate nel pesce zebra.Gli individui che non conoscono questo metodo dovrebbero essere in grado di seguire le istruzioni passo dopo passo per identificare i bersagli genomici ottimali per la mutagenesi CRISPR, eseguire la microiniezione di embrioni di zebrafish e identificare gli alleli modificati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto questo metodo è destinato agli studenti universitari che potrebbero non avere familiarità con una o più delle tecniche necessarie. Le linee guida per la progettazione di oligo specifici per la produzione di RNA guida sono fornite nel protocollo di testo.Per iniziare, sospendere la proteina Cas9 nel tampone per generare una soluzione di un milligrammo per millilitro. Conservare questa soluzione in aliquote pronte per l'iniezione a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. Quindi sintetizzare l'sgRNA con un kit di trascrizione in vitro come quello suggerito nei materiali di questo articolo secondo le istruzioni del produttore.Purificare l'sgRNA sintetizzato utilizzando una precipitazione di acetato di ammonio privo di RNAsi. Aggiungere 25 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari all'RNA sintetizzato e mescolare la soluzione mediante vortex. Quindi, aggiungere al campione 150 microlitri di etanolo privo di nucleasi 200 proof.E metti la reazione in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Successivamente, centrifugare i campioni alla massima velocità. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet di RNA.Quindi aggiungere un millilitro di etanolo al 70% e capovolgere il tubo più volte per lavare il sale residuo dal tubo. Centrifugare nuovamente alla massima velocità a quattro gradi Celsius per sette minuti. Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere la maggior parte della soluzione.Quindi, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere la maggior parte della soluzione rimanente senza disturbare il pellet. Facendo attenzione a evitare la contaminazione da RNAsi, asciugare il pellet in un luogo pulito fino a quando non ci sono gocce di liquido visibili nel tubo. Risospendere il pellet in 30 microlitri di acqua priva di RNAsi e quantificare il prodotto con uno spettrofotometro.Aliquot la soluzione per la conservazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius. Quindi mescolare da 300 a 500 nanogrammi di sgRNA con un volume uguale di colorante caricante su gel di RNA 2X. Quindi, utilizzando una pipetta P1000, ripulire più volte ciascuno dei pozzetti di gel di agarosio dai detriti con il tampone di scorrimento.Caricare le soluzioni nei pozzetti del gel di agarosio e far scorrere il gel a 10 volt per centimetro per un tempo sufficiente a separare le bande di RNA sul gel. Il tempo può variare a seconda dell'apparecchio per elettroforesi. In generale, il fronte del colorante dovrebbe essere fatto scorrere a 2/3 della lunghezza del gel.Quindi usa una macchia di acido nucleico per visualizzare le bande. L'RNA intatto appare come una singola banda, come nelle corsie uno e due mostrate qui. L'RNA degradato viene eseguito come uno striscio, come nella corsia tre.Per prima cosa, preparare i soggetti zebrafish per la riproduzione la notte prima di eseguire le iniezioni come descritto nel protocollo di testo. Quindi combina la proteina Cas9 e l'sgRNA in un rapporto di due a uno. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti mentre il Cas9 e l'sgRNA formano un complesso ribonucleoproteico.Quindi aggiungere 0,5 microlitri di soluzioni di rosso fenolo al 2,5% in una quantità sufficiente di acqua priva di RNAsi per ottenere un volume finale di cinque microlitri. Per preparare l'ago per iniezione, utilizzare un estrattore per micropipette per estrarre un capillare di vetro da un millimetro. Quindi tagliare la punta dell'ago di vetro risultante con una lama di rasoio per ottenere un'apertura angolata.Posizionare l'ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore. Utilizzando un microscopio ottico, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago non inietta costantemente un nanometro di soluzione nella capsula di Petri. Prima di eseguire la microiniezione di embrioni, esercitati a preparare gli aghi e a iniettare gli embrioni di controllo utilizzando una soluzione di solo colorante e registra la sopravvivenza dopo 24 ore dallo sviluppo.Dovrebbe essere in grado di ottenere una sopravvivenza superiore al 90% rispetto a un controllo non iniettato. Successivamente, seleziona da 10 a 15 embrioni come popolazione di controllo e mettili in una capsula di Petri etichettata separata. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare con cura gli embrioni rimanenti su una piastra per iniezione a temperatura ambiente.Sotto un microscopio da dissezione, iniettare un nanolitro di soluzione nel sacco vitellino di ciascun embrione. Quindi rimetti gli embrioni iniettati in una capsula di Petri etichettata e coprili con terreno 1X E3 con blu di metilene. Metti gli embrioni iniettati in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per 24 ore.Quindi ispezionare gli embrioni iniettati per rimuovere gli individui morti o in sviluppo anomalo. Per prima cosa, raccogli due serie di cinque embrioni di 72 ore dalle piastre contenenti embrioni iniettati e una serie di cinque embrioni di 72 ore dal gruppo di controllo non iniettato nelle provette della microcentrifuga. Pipettare delicatamente il terreno da ogni set di embrioni e anestetizzarli.Rimuovere l'anestetico dopo due minuti e aggiungere 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari. Quindi incubare i campioni a 95 gradi per 10 minuti. Quindi, rimuovere i campioni dall'incubatore e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.Aggiungere cinque microlitri di tris cloridrato a pH molare e agitare vigorosamente i campioni. Quindi centrifugare la soluzione alla massima velocità a temperatura ambiente per tre minuti. Trasferire il surnatante che contiene il DNA genomico in una nuova provetta marcata e conservare il gDNA a meno 20 gradi Celsius.Utilizzare i primer progettati per amplificare intorno alla regione target dell'sgRNA come descritto nel testo per amplificare un frammento PCR per l'analisi eteroduplex. Utilizzare un kit di pulizia PCR per purificare i prodotti della reazione PCR. Diluire i campioni in 30 microlitri di acqua e utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA.Collocare le provette contenenti gli ampliconi per PCR in una rastrelliera galleggiante a bagnomaria bollente. Successivamente, preparare un gel TBE di poliacrilammide al 15% utilizzando il 30% di poliacrilammide. Dopo che il gel si è solidificato, inserirlo in un apparecchio per elettroforesi con tampone di corsa in TBE.Quindi caricare 500 nanogrammi di prodotti PCR ricotti e caricare un controllo accanto a ciascun set di campioni di sgRNA. Far funzionare il gel a 150 volt per due ore e mezza o fino a quando il fronte del colorante non si trova sul fondo del gel. Crescere embrioni di pesce zebra iniettati fino all'età adulta che mostrano bande eteroduplex nell'HMA.Per interpretare l'HMA, confrontare l'intensità della banda omoduplex dalla PCR del controllo non iniettato wild type con i corrispondenti campioni iniettati. Se si è verificato un numero sufficiente di tagli, l'intensità della banda del pesce iniettato deve essere inferiore di circa il 50% rispetto al controllo di tipo selvatico. Per confermare la presenza di indels nei potenziali pesci genitori fondatori, anestetizzare il pesce in tricaina allo 0,004% e utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere da 1/2 a 3/4 della pinna caudale.Quindi, posizionare la coda in 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari. Rimettere il pesce in una vasca di recupero ed eseguire l'estrazione del gDNA come descritto in precedenza. Successivamente, eseguire un HMA sul gDNA della clip della coda per determinare se l'individuo è stato modificato con successo dall'iniezione di CRISPR.Quindi allevare gli adulti che mostrano bande eteroduplex nel DNA della coda in pesci di tipo selvatico. Seleziona il pesce fondatore per generare il pesce F1 in base all'analisi HMA dei pool. Infine, sequenziare il gDNA del pesce di interesse per caratterizzare la natura dell'indel.Dopo il successo della produzione e della microiniezione di reagenti CRISPR, gli embrioni di zebrafish sono stati analizzati per fenotipi evidenti e formazione di indel utilizzando HMA. La formazione di indel indotta da Cas9 alla tirosinasi provoca la perdita di pigmentazione ed è facilmente valutabile entro 48 ore dalla fecondazione. L'identificazione degli alleli modificati con CRISPR che non determinano fenotipi di sviluppo evidenti viene eseguita utilizzando HMA.Il successo del targeting del gene di interesse provoca la formazione di bande eteroduplex e la riduzione dell'intensità della banda omoduplex, come nelle corsie tre e quattro. Non dimenticate che lavorare con un organismo vertebrato comporta responsabilità etiche. Questo protocollo descrive strategie che riducono al minimo il numero di zebrafish necessari per ottenere un knockout, un obiettivo che dovrebbe essere preso in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per generare e identificare rapidamente il pesce zebra che trasporta alleli modificati CRISPR che verranno trasmessi nella linea germinale con elevata efficienza. È importante sottolineare che questa tecnica è stata ottimizzata per essere un approccio a basso costo adatto a studenti universitari e altri con poca esperienza precedente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e implementare facilmente un approccio di knockout genico basato su CRISPR utilizzando zebrafish.

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