CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Questa tecnica è utile per introdurre mutazioni precise in C.elegans mediante l'editing del genoma CRISPR/Cas9 in un breve lasso di tempo. Questa tecnica fornisce un modo efficiente e semplificato per modificare il genoma di C.elegans, poiché l'uso di un marcatore Co-CRISPR migliora notevolmente la probabilità di identificare i vermi modificati positivamente. Assicurati di esercitarti nell'esecuzione delle microiniezioni e di iniettare entrambi i bracci delle gonadi del maggior numero possibile di vermi per aumentare le possibilità di ottenere le modifiche desiderate.

A dimostrare la procedura saranno Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith e Carter Dierlam, tutti studenti universitari del mio laboratorio. Per preparare giovani vermi adulti per l'iniezione, prelevare C.elegans di stadio L2, L3 su un prato batterico fresco su una piastra MYOB e incubare la piastra a 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, preparare la miscela per iniezione come indicato nella tabella in provette sterili prive di nucleasi e miscelare mediante pipettaggio.

Incubare la miscela per iniezione a 37 gradi Celsius per 15 minuti per assemblare i complessi ribonucleoproteici prima di centrifugare la miscela. Successivamente, utilizzare un microscopio da dissezione per selezionare circa 30 giovani vermi adulti con meno di 10 embrioni nell'utero e iniettare entrambi i bracci delle gonadi di ciascun verme con alcuni picolitri di miscela per iniezione per braccio. Dopo la microiniezione, utilizzare un apparecchio di recupero per pipettare delicatamente con la bocca i vermi iniettati dal tampone di iniezione su una piastra MYOB da 60 millimetri seminata con OP50 E.coli.

Lasciare che i vermi iniettati si riprendano per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine del periodo di recupero, utilizzare un plettro di filo di platino per trasferire ogni verme iniettato su una singola piastra di agar MYOB da 35 millimetri e lasciare che i vermi depongano le uova a 20 gradi Celsius. Dopo 24 ore, trasferire i vermi iniettati su nuove piastre individuali da 35 millimetri.

Per tre o quattro giorni dopo l'iniezione, utilizzare un microscopio da dissezione per identificare le piastre che hanno progenie F1 che mostrano fenotipi a rulli, come indicato dal corpo dell'animale che ruota attorno al suo asse lungo mentre gli animali si muovono in uno schema circolare, e fenotipi tozzetti, come evidenziato da una fisiologia più corta e più robusta rispetto agli animali di controllo allo stesso stadio di sviluppo. Trasferisci da 50 a 100 vermi rulli F1 nelle loro piastre individuali e lascia che i vermi depongano le uova per uno o due giorni. Dopo uno o due giorni di produzione di vermi F2, trasferire ogni singola madre rullo F1 da una piastra numerata nella provetta PCR numerata corrispondente contenente 2,5 microlitri di tampone di lisi integrato con una diluizione 1:100 di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K.Congelare le provette a meno 30 gradi Celsius per 20 minuti prima di lisare i vermi in un termociclatore, come indicato.

Alla fine del ciclo, aggiungere 12,5 microlitri di miscela 2X PCR contenente deossinucleosidi trifosfati, DNA polimerasi, cloruro di magnesio e colorante di caricamento, un microlitro di primer diretto da 10 micromolari, un microlitro di primer inverso da 10 micromolari e abbastanza acqua sterile per portare la miscela di reazione a 25 microlitri per ogni campione di verme lisato. Quindi eseguire i campioni sul termociclatore come indicato. Per verificare la presenza di modifiche di lunghezza inferiore a 50 paia di basi, trasferire 10 microlitri di ciascuna reazione PCR in una nuova provetta e aggiungere cinque microlitri della miscela master per digestione di restrizione a ciascuna provetta.

Incubare le reazioni di digestione a 37 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione, riscaldare e attivare le digestioni con un'incubazione di 10-15 minuti a 65 gradi Celsius. Quindi caricare l'intera reazione da ciascuna provetta in un singolo pozzetto di un gel di agarosio dall'1% al 2% e far scorrere il gel a 110 milliampere fino a raggiungere la corretta separazione delle bande.

Alla fine della corsa, visualizza i gel di agarosio sotto la luce UV per rilevare le dimensioni della banda di DNA. I vermi modificati positivamente mostreranno una banda extra di DNA alla dimensione prevista a causa dell'editing utilizzando il modello di riparazione, portando il sito di restrizione nel locus desiderato all'interno del genoma del verme. Scegliete da otto a 12 vermi F2 dall'aspetto selvatico e non rotolanti dalle rispettive piastre di vermi rulli F1 modificate positivamente e lasciate che i vermi depongano le uova e producano progenie per uno o due giorni.

Quindi identificare le linee omozigoti del verme come dimostrato per i vermi modificati positivamente e analizzare i risultati del sequenziamento utilizzando il software di analisi della sequenza per confermare la presenza della modifica secondo i protocolli standard. Qui si possono osservare il DNA genomico e l'RNA CRISPR progettato e il modello di riparazione per il gene rbm-3.2 di C.elegans. In questa analisi rappresentativa, sette dei 73 worm F1 sono risultati positivi per la modifica.

I vermi non modificati hanno mostrato il singolo frammento di DNA di 445 paia di basi alla digestione EcoRI, mentre i vermi portatori di un codone di stop prematuro nel gene rbm-3.2 hanno mostrato due frammenti a 265 e 166 paia di basi alla digestione EcoRI. I vermi eterozigoti modificati mostravano tre frammenti dopo la digestione di EcoRI. Sei dei 12 vermi F2 degli eterozigoti F1 positivi identificati sono risultati omozigoti per la modifica di interesse.

Il DNA genomico di una linea di verme omozigote modificata identificata potrebbe quindi essere utilizzato per impostare una reazione di sequenziamento del DNA, che ha confermato la presenza della modifica nel suo stato omozigote. Assicurarsi che i reagenti di editing e i primer di screening siano progettati correttamente e che la miscela per iniezione sia preparata correttamente. Anche una microiniezione accurata è fondamentale.

Seguendo questa procedura, può essere eseguita la convalida fenotipica dell'edit, se applicabile, e l'analisi dell'espressione genica e proteica per verificare l'accuratezza dell'editing genomico.