Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

L'obiettivo generale della funzionalizzazione chimica della superficie delle nanoparticelle di HEV è quello di fornire un approccio ripetibile e coerente per la coniugazione di molecole immunogeniche, terapeutiche e diagnostiche mirate alla superficie delle nanoparticelle di HEV per scopi di diagnosi e trattamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nanomedicina, come ad esempio come è possibile monitorare il targeting potenziato del cancro e la distribuzione di nanoterapie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile, efficiente e molto più facile da ottenere rispetto alla generazione di ingegneria genetica.

A dimostrare le procedure saranno Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, assistenti di ricerca del nostro laboratorio. Inizia questo protocollo con la produzione e la purificazione di nanoparticelle del virus dell'epatite E come descritto nel protocollo di testo. Diluire i campioni di nanoparticelle HEV tra 0,5 e due milligrammi per millilitro con MES da 10 millimolari, pH 6,2 per un imaging TEM.

Ionizzare le griglie rivestite di carbonio con una scarica luminosa da 40 milliampere per 30 secondi per produrre una superficie di carbonio idrofila. La superficie idrofila in carbonio delle griglie può durare solo per 30 minuti dopo il trattamento di scarica del bagliore. Dopo la ionizzazione, tenere la griglia e le pinzette e aggiungere due microlitri del campione di nanoparticelle HEV alla griglia.

Dopo 15-30 secondi, tamponare la griglia con carta da filtro. Quindi lavare immediatamente la griglia con acqua distillata doppia e tamponare nuovamente con carta da filtro. Aggiungere immediatamente due microlitri di acetato di uranile al due percento alla griglia.

Dopo 15 secondi, tamponare la griglia con carta da filtro. Asciugare le griglie dei campioni mettendole in un armadio a secco per deumidificatore elettronico durante la notte. A seconda del campione, la microscopia elettronica criogenica o la crio-EM possono essere necessarie per la visualizzazione e la caratterizzazione della struttura.

Trasferisci la griglia in un TEM e crea un'immagine con un ingrandimento da 10 a 80 K. Le nanoparticelle di HEV appaiono nelle TEM come proteine icosaedriche vuote di circa 27 nanometri di diametro a causa dell'assenza di RNA virale. Per eseguire la coniugazione in un'unica fase delle nanoparticelle di HEV e della biotina legata alla maleimmide, applicare prima le nanoparticelle di HEV alle mini unità di dialisi.

Dializzare le nanoparticelle contro 0,01 molari PBS pH 7,4 a temperatura ambiente per un'ora secondo il protocollo del produttore. Dopo la dialisi, trasferire le nanoparticelle di HEV in provette da 1,5 millilitri e misurare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Mescolare le nanoparticelle a un milligrammo per millilitro con una quantità uguale di 100 micromolari di maleimmide biotina e 0,01 molari di PBS pH 7,4 per ottenere un rapporto da uno a cinque molari.

Dopo aver reagito per una notte a quattro gradi Celsius, rimuovere la biotina maleimmide non legata con una procedura di colonna di desalinizzazione a rotazione secondo il protocollo del produttore. Analizzare i campioni tramite una pagina SDS di riduzione standard. Utilizzando le procedure standard, preparare un Western blot chemiluminescente utilizzando streptavidina legata all'HRP e catturare il segnale chemiluminescente mediante pellicola a raggi X.

Per eseguire la coniugazione in due fasi del ligando specifico per le cellule del cancro al seno, LXY30, per far emergere la cisteina sulle nanoparticelle HEV, applicare prima le nanoparticelle alle mini unità di dialisi e dializzare contro 0,01 molari PBS pH 7,4 a temperatura ambiente per un'ora. Quindi trasferire le nanoparticelle di HEV in provette da 1,5 millilitri e misurare la concentrazione di proteine a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente, combinare 650 micromolari di maleimmide azide e 650 micromolari di alchino LXY30 con 200 micromolari di solfato di rame e un millimolare di acido ascorbico.

Questo forma LXY 30 legato alla maleimmide a 650 micromolari. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, mescolare le nanoparticelle di HEV a un milligrammo per millilitro con circa il 10% del volume di LXY 30 legato alla maleimmide per ottenere un rapporto molare da uno a tre.

Reagisci durante la notte a quattro gradi Celsius. A causa della concentrazione relativamente alta di maleimmide LXY 30, le concentrazioni finali dei reagenti come il solfato di rame vengono ridotte circa 10 volte dopo la miscelazione. Per evitare il loro danno alle nanoparticelle del virus dell'epatite E, un'altra opzione è il metodo a contribuzione libera dal rame.

Rimuovere la maleimmide non legata fare clic LXY 30 con una colonna di desalinizzazione rotante secondo il protocollo del produttore. Mantieni le nanoparticelle HEV legate a LXY 30 a quattro gradi Celsius. Per eseguire la coniugazione in un solo passaggio delle nanoparticelle LXY 30 HEV e del tag fluorescente Cy5.5, mescolare prima le nanoparticelle legate a LXY 30 a un milligrammo per millilitro con un volume uguale di tag fluorescente Cy5.5 per ottenere un rapporto molare da uno a cinque.

Dopo aver fatto reagire la miscela per una notte a quattro gradi Celsius, rimuovere il Cy5.5 NHS non legato con una procedura di colonna di desalinizzazione a rotazione secondo il protocollo del produttore. Mantenere le nanoparticelle HEV legate a LXY 30 Cy5.5 a quattro gradi Celsius. Sono stati tentati due metodi per la funzionalizzazione LXY 30 di nanoparticelle HEV per il targeting delle cellule tumorali.

Quando le nanoparticelle di HEV 573C sono state legate prima all'azide di maleimmide, seguita da una reazione chimica a scatto all'alchino LXY 30, le nanoparticelle di HEV 573C sembravano disassemblarsi sotto osservazione TEM. Tuttavia, una reazione chimica iniziale tra l'alchino LXY 30 e l'azide maleimmidica per formare LXY 30 legato alla maleimmide, seguita dalla coniugazione per assistere le nanoparticelle HEV modificate, non ha influenzato la sua struttura e le nanoparticelle HEV 573C sono rimaste intatte. Le nanoparticelle di HEV legate a LXY 30 e Cy5.5 sono state applicate a cellule di cancro al seno in coltura e osservate mediante microscopia confocale.

Le immagini a fluorescenza nel vicino infrarosso mediante microscopia confocale indicano che le nanoparticelle HEV legate a LXY 30 Cy5.5 avevano una maggiore affinità di legame per una maggiore internalizzazione nelle cellule di cancro al seno MDA MB 231 rispetto alle nanoparticelle HEV legate a Cy5.5. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'esame del targeting multimodale e delle molecole terapeutiche che consentono un targeting e una diagnosi accurati del tumore senza causare danni alle cellule normali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul cancro e sul targeting del tumore attraverso la modulazione chimica della superficie, può essere applicato alla diagnosi precoce del cancro, allo screening e al trattamento guidato dall'imaging.