Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare una piccola cassetta pronta all'uso che può essere applicata per il rilevamento visivo di più acidi nucleici in un unico test facile da usare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rilevazione multiplex di acidi nucleici, come gli organismi geneticamente modificati o la rilevazione di OGM. Per pulire i capillari, indossare un'uniforme da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti di protezione chimica.

Posizionare i capillari in un becher. Pulisci i capillari con 30 millilitri di acetone per cinque minuti per rimuovere la materia organica. E poi, lavare i capillari con acqua deionizzata.

Successivamente, prepara la soluzione di piranha versando una decina di millilitri di perossido di idrogeno nel becher. Quindi, aggiungere 30 millilitri di acido solforico nel perossido di idrogeno agitando lentamente per evitare il surriscaldamento. Assicurarsi che la soluzione copra completamente i capillari per almeno 30 minuti.

Quindi, lava via la soluzione di piranha con una grande quantità di acqua. Lavare i capillari con etanolo e acqua deionizzata per cinque minuti ciascuno. Asciugare i capillari in un forno di essiccazione.

Quindi, pesare i reagenti di base e di ingranaggi PDMS con un rapporto di uno a uno in una provetta da 50 millilitri. In genere, mescolare cinque grammi di base elastomerica con cinque grammi di agente indurente elastomerico. Mescolate bene il composto per circa cinque minuti con una bacchetta di vetro.

Mettere il becher con il PDMS in una campana sottovuoto per trenta minuti per il degasaggio. Quindi, versare lentamente il PDMS nel cilindro dello stampo in acciaio inossidabile. Lasciare indurire il PDMS per tre ore in un forno di essiccazione a 60 gradi Celsius.

Dopo l'indurimento del PDMS, rimuovere lo stampo estraendo lo stampo con il cilindar. Rimuovere il PDMS dal cilindro tagliando il margine dello stampo con un bisturi. Lavare il PDMS tre volte con etanolo e acqua deionizzata.

Quindi, asciugare il supporto PDMS con azoto. Trattare la superficie inferiore del supporto PDMS in modo che sia idrofobica immergendo il supporto PDMS in un rivestimento super idrofobico per un secondo. Quindi, asciugalo per dieci minuti a temperatura ambiente.

Quindi, inserire i capillari puliti da quattro millimetri nei fori del supporto PDMS, lasciando zero virgola cinque millimetri dei capillari al di fuori della superficie superiore del supporto PDMS. Assicurati che le estremità dei capillari siano allo stesso livello. Per trattare la superficie esterna dei capillari e la superficie superiore del supporto PDMS per essere idrofobica, aggiungere 15 microlitri del rivestimento super idrofobico sopra la superficie del supporto PDMS.

Asciugare all'aria l'array capillare modificato super idrofobico. Quindi, aggiungere un virgola sei microlitri della miscela di fissaggio del primer di una serie di primer per riempire un capillare corrispondente della matrice capillare secondo un ordine prestabilito. Ancorare l'array in un pozzetto trasparente di una piastra standard a fondo piatto da 96 pozzetti e asciugare l'array a 60 gradi Celsius per almeno due ore.

Per assemblare la cassetta, posizionare un adattatore di caricamento sulla parte superiore dell'array ancorato. Assicurati che la discarica dell'adattatore copra solo le parti esposte di tutti e dieci i capillari. Per preparare la miscela di reazione LAMP, aggiungere i reagenti alla miscela secondo il protocollo di testo e agitare la miscela di reazione per cinque secondi dopo aver aggiunto la calcina.

Capovolgere delicatamente la provetta venti volte dopo l'aggiunta della Bst polimerasi. Le tracce di DNA presenti nell'ambiente possono essere eliminate pulendo preventivamente con una mole per litro di acido cloridrico prima di passare la miscela LAMP. Aspirare 20 microlitri della miscela di reazione LAMP con una punta standard da 100 microlitri.

Inserire la punta nell'ingresso dell'adattatore di caricamento per bloccarla. Iniettare delicatamente la miscela di reazione nella piastra dell'adattatore. La miscela di reazione riempirà rapidamente il piatto, quindi caricherà automaticamente i capillari attraverso la forza capillare.

Rimuovere l'adattatore con la punta di blocco e sigillare il pozzetto con una pellicola sigillante trasparente compatibile con la PCR. Quindi, incubare l'array capillare in un incubatore a 63 gradi Celsius per un'ora. Per acquisire immagini dell'emissione di fluorescenza, utilizzare una torcia UV per eccitare la calcina dissociata per emettere fluorescenza.

Acquisisci immagini dalla parte superiore dell'array capillare con una fotocamera digitale o uno smartphone. Quando si scatta un'immagine, assicurarsi che la fotocamera sia ingrandita il più possibile sull'area dei capillari per ottenere immagini chiare e di alta qualità. Quindi, apri l'immagine tramite il software di analisi delle immagini.

E poi selezionare immagine, stampo, scala di grigi, sì e immagine, stampo, 16 bit, sì. Seleziona file, salva con nome, formatta, TIFF, per convertire l'immagine in formato TIFF a 16 bit. Per estrarre il valore dell'intensità della fluorescenza, aprire il software di analisi dei microarray.

Trascinare l'immagine in formato TIFF a 16 bit nell'interfaccia del software, quindi selezionare la lunghezza d'onda di 532 nanometri e un colore verde per visualizzare l'immagine. Quindi, crea un nuovo blocco per individuare il segnale di fluorescenza dai capillari. Seleziona gli strumenti, i nuovi blocchi, quindi inserisci il numero di colonne e righe come uno a uno e da due a cinque nelle interfacce dei blocchi e delle funzioni separatamente.

Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il modello di funzionalità. Quindi, regolare la posizione e il diametro per adattarli all'area di fluorescenza dei capillari. Selezionare Analizza per estrarre il valore dell'intensità della fluorescenza.

Infine, seleziona file, salva le impostazioni con nome, per salvare i documenti del blocco. Quindi, selezionare, archiviare, salvare i risultati con nome per salvare i risultati dell'intensità della fluorescenza. Qui è mostrato il layout dell'array capillare.

Capillari da uno a otto, preceduti da set di primer LAMP. I capillari nove e dieci rappresentano due, nessun controllo di innesco. Qui è mostrata la fotografia fluorescente per la rilevazione del mais geneticamente modificato, MON863, dove il colore verde rappresenta l'amplificazione positiva della LAMP.

Amplificazione riuscita, presentata solo nei capillari uno, sei, sette e otto previsti, senza contaminazione tra i capillari vuoti. Questa fotografia fluorescente serve per la rilevazione della miscela OGM. Il colore verde presentava l'amplificazione positiva della LAMPADA.

L'amplificazione di successo si è presentata solo nei capillari attesi uno, quattro, cinque, sei, sette e otto senza contaminazione tra i capillari bianchi. La fotografia fluorescente qui mostrata è per la rilevazione di mais non geneticamente modificato, con il colore verde che presenta l'amplificazione positiva LAMP. L'amplificazione di successo si è presentata solo negli otto capillari previsti e senza contaminazione tra i capillari vuoti.

Una volta padroneggiata, questa procedura di rilevamento può essere eseguita in un punto cinque ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare una cassetta basata su capillari per eseguire il rilevamento di più acidi nucleici.