Name: Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri la modellazione di ligandi in mappe criomicroscopia elettronica usando tecniche computazionali. Questo metodo facilita la scoperta di farmaci attraverso strutture ad alta risoluzione di proteine di membrana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ è un destinatario della borsa di dottorato DAE-TIFR e il finanziamento è riconosciuto. KRV riconosce la sovvenzione DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 e il supporto del Dipartimento dell'Energia Atomica, Governo dell'India, nell'ambito dell'identificazione del progetto n. RTI4006.

Modellazione di ligandi di piccole molecole in mappe CryoEM di macromolecole

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I miglioramenti nell'hardware e nel software del microscopio hanno portato a un aumento del numero di strutture cryoEM negli ultimi anni. Sebbene la risoluzione più alta raggiunta al momento nella crioEM a singola particella sia 1,2 Å 57,58,59, la maggior parte delle strutture viene determinata intorno alla risoluzione di 3-4 Å. La modellazione di ligandi in mappe a media e bassa risoluzione può essere complicata e spesso piena di ambiguità. Dato l'uso diffuso della crioEM sia nel mondo accademico che nell'industria farmaceutica per la ricerca traslazionale e la scoperta di farmaci, è essenziale garantire che i ligandi siano modellati correttamente e senza ambiguità. Pertanto, è prudente quantificare la risolvibilità degli atomi di ligando calcolando i Q-score60, che è ora disponibile nell'EMDB come metrica per valutare la qualità delle mappe e l'adattamento del modello, nonché in Chimera.
Nel primo esempio, ChimeraX è stato utilizzato per calcolare la mappa delle differenze nello spazio reale tra l'apo e le mappe legate al ligando nell'enzima enolasi M. tuberculosis. La densità aggiuntiva ad una soglia elevata suggerisce la presenza del ligando, fosfoenolpiruvato, nel sito attivo e, Mg2+ legato al ligando. È importante notare che, in questo caso, la mappa è di media risoluzione (3,2 Å) e le molecole d'acqua non possono essere modellate con sicurezza (Figura 1). Il limite associato a questo metodo è che può essere applicato solo quando il legame del ligando non induce cambiamenti conformazionali significativi nella proteina. In questo caso la normalizzazione della mappa non è stata eseguita poiché sia i set di dati apo che quelli legati al ligando sono stati acquisiti con la stessa dimensione di pixel ed elaborati con parametri identici in Relion. Tuttavia, vale la pena notare che quando si confrontano mappe generate da diversi programmi di ricostruzione, come Relion46,47 e CryoSparc61, o con qualità diverse, la normalizzazione delle mappe diventa essenziale prima di poter effettuare confronti significativi.
L'esempio successivo è mGlu5, che subisce una grande riorganizzazione molecolare dopo il legame con l'agonista, come evidente dalle strutture cryoEM51,62 (Figura 2). In questo scenario, non è possibile calcolare una semplice mappa di differenza tra i recettori non legati (apo) e legati al ligando a causa delle differenze sostanziali tra le mappe. Qui, è stato utilizzato Servalcat, che utilizza semimappe non nitide e non ponderate come input per il raffinamento nello spazio reciproco e successivamente calcola una mappa di differenza tra la mappa sperimentale e la mappa derivata dal modello. A una soglia elevata, è possibile visualizzare le differenze e fungere da guida per la correzione e il miglioramento del modello. Diversi blob non modellati nel dominio extracellulare e vicino al dominio transmembrana di mGlu5 sono stati osservati e utilizzati come guida per modellare i ligandi (Figura 2).
Il terzo esempio mostra come la risoluzione (2,3 Å) giochi un ruolo cruciale nell'interpretazione della mappa e nella modellazione di un inibitore delle dimensioni di un frammento nella β-galattosidasi. In questo caso, la sfida consisteva nell'identificare un ligando molto piccolo (<200 Da) nella mappa delle differenze di Servalcat in mezzo al rumore intrinseco nei dati e modellarlo accuratamente. Oltre all'elevata risoluzione globale determinata utilizzando la correlazione a guscio di Fourier (FSC), anche la risoluzione locale specifica del ligando era sufficientemente alta da garantire un posizionamento accurato dei centri chirali dei ligandi (Figura 3). La densità per le molecole di solvente è stata osservata nella mappa delle differenze in tutto l'enzima e in particolare intorno al ligando. È stato anche dimostrato l'effetto della risoluzione sui ligandi di modellazione e sugli atomi di solvente (Figura 4). È importante prestare attenzione quando si modellano molecole di acqua o solvente perché, a volte, il rumore a una soglia bassa può assomigliare a molecole di acqua o solvente, portando a potenziali interpretazioni errate.
Un'altra considerazione importante è che le mappe cryoEM da sole potrebbero non essere sufficienti per identificare con precisione uno ione metallico da solo. Ulteriori metodi biofisici come l'Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) o la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) sono spesso necessari per confermare la presenza e l'identità dello ione metallico. Sia nell'enzima enolasi che in quello β-galattosidasi, Mg2+ è stato modellato a causa della ricchezza di informazioni già disponibili su queste proteine, confermando l'identità dello ione metallico. Inoltre, la coordinazione degli ioni metallici in questi casi, esemplificata dalla classica geometria ottaedrica e dalle distanze di coordinazione quasi ideali di Mg2+, ha fornito una prova sostanziale della loro identità.
In generale, è necessario tenere conto di alcune considerazioni importanti durante la modellazione dei ligandi nelle mappe cryoEM. Per cominciare, è importante scegliere la mappa corretta per l'identificazione e la modellazione dei ligandi. In tutti i casi, è consigliabile una mappa o una mezza mappa non nitida e non ponderata rispetto a una mappa nitida e ponderata per visualizzare la densità del ligando, poiché la nitidezza e la ponderazione potrebbero comportare regioni poco nitide o eccessivamente nitide (rumore dovuto alla terminazione della serie) nella mappa. Ciò può comportare una densità del ligando non ottimale e l'uso di una diversa affilatura del fattore B può essere impiegato per valutare la densità durante la costruzione del modello in Coot. Sebbene vi sia un rischio nell'utilizzare la mappa nitida per identificare i ligandi in una mappa cryoEM, la mappa non nitida potrebbe non mostrare tutti i dettagli della densità del ligando, ma può essere utilizzata a scopo dimostrativo, come mostrato nella Figura 1B, C.
La posa del ligando modellato deve essere convalidata, soprattutto nei casi in cui i dati sono deboli. Come mostrato qui per mGlu5, la risoluzione locale varia in tutta la mappa cryoEM e la modellazione imparziale del ligando può essere impegnativa. Servalcat può essere utilizzato come strumento prezioso per rilevare potenziali imprecisioni nella modellazione di proteine e ligandi22.
L'eterogeneità composizionale può essere presente in un complesso proteina-ligando in cui solo una popolazione specifica può avere il ligando presente (se il ligando è di basso peso molecolare, la fase di classificazione potrebbe non rimuovere l'eterogeneità). Tuttavia, è importante eseguire la classificazione 3D63 in modo iterativo durante l'elaborazione delle immagini prima della modellazione del ligando e verificare se la densità del ligando migliora. Se sono presenti più copie di proteine, è necessario prestare attenzione quando si applica la simmetria sulla mappa durante la generazione e il perfezionamento iniziale del modello, poiché ciò potrebbe mediare la densità del ligando in tutte le molecole correlate alla simmetria. La simmetria dovrebbe essere imposta solo dopo che la mappa è stata accuratamente ispezionata per confermare la presenza di densità del ligando in tutte le catene proteiche.
A seconda dello stato (cristallo o soluzione) e della posizione (sepolto o superficie), gli atomi possono essere dinamici e, nel raffinamento del modello, questo viene indicato come parametro di spostamento atomico (ADP). Insieme alla mappa delle differenze, che fornisce indizi visivi su possibili imprecisioni nel modello, i valori ADP possono essere utilizzati per valutare l'accuratezza dei ligandi dopo l'affinamento 64,65,66,67. Tipicamente, il ligando dovrebbe avere valori di ADP simili a quelli dei residui circostanti, cioè se sono legati stabilmente e modellati accuratamente. Tuttavia, i ligandi alla periferia o gli atomi di un ligando (come i lipidi) che sono lontani dalle macromolecole possono avere valori di ADP più elevati. Oltre ad affinare le coordinate, sia Refmac33,34 che Phenix permettono di affinare i valori ADP 28,68. In Refmac, l'approssimazione di Mott-Bethe viene utilizzata per calcolare il fattore di scattering elettronico dei singoli atomi durante il calcolo della mappa. Nella recente versione di Phenix, è stato introdotto il raffinamento individuale del fattore B, simile alla cristallografia, per tenere conto del disordine atomico. Molto spesso, nei modelli raffinati derivati dalla crioEM, si osserva un'ampia gamma di valori ADP (a volte valori vicini allo zero), e anche il Q-score che viene utilizzato nell'EMDB per valutare l'adattamento del modello con la mappa dipende dalla mappa primaria depositata e dalla natura dell'affinamento del fattore B60. Nella costruzione di modelli crioEM, vengono spesso utilizzate più mappe e, quindi, le mappe utilizzate nella modellazione e nel perfezionamento dovrebbero essere chiaramente menzionate nei metodi, poiché a causa della risoluzione anisotropa in molte macromolecole, una singola mappa potrebbe non essere sufficiente per spiegare tutti i dettagli. 
Nella modellazione dei ligandi nelle macromolecole, uno dei principali limiti delle mappe cryoEM (come in cristallografia) è che se il sito di legame del ligando è di bassa risoluzione o se il ligando legato è dinamico, allora accertare la corretta conformazione può rivelarsi difficile. Inoltre, la maggior parte delle strutture crioEM ha risoluzioni inferiori a 3 Å e la rappresentazione delle molecole d'acqua nelle mappe è limitata, rendendo difficile valutare il ruolo dell'idratazione nel legame del ligando o del farmaco (come mostrato qui con gli esempi di enolasi e mGluR). I metodi computazionali possono essere utilizzati in combinazione con i dati cryoEM per affrontare queste limitazioni69. A differenza della cristallografia, solo il modello viene perfezionato, non la mappa. Attualmente, l'unico metodo per indicare la presenza di un ligando o garantire una modellazione accurata è la generazione di mappe di omissione (utilizzando strumenti come Servalcat). Pertanto, ci sono una serie di strumenti per aiutare i ricercatori a costruire e valutare il modello, ma ci sono diverse aree nel perfezionamento del modello in cui ci si può aspettare nuovi approcci o modifiche degli approcci attuali nel prossimo futuro.
In questo articolo, ci siamo concentrati sugli attuali approcci per la modellazione dei ligandi, che includono l'ispezione manuale della densità del ligando, la generazione del file di geometria del ligando, seguita dalla modellazione del ligando nella mappa cryoEM. Questo è un periodo entusiasmante per la biologia strutturale e la scoperta di farmaci, poiché i rivelatori diretti di elettroni con frame rate più elevati e l'uso di un'acquisizione dati più velocehanno portato all'ottenimento di mappe ad alta risoluzione (<2,8 Å) di diverse macromolecole spesso legate con ligandi di piccole molecole in un tempo relativamente breve. La recente introduzione di strumenti automatizzati per la modellazione dei ligandi come GEMspot69 nella suite Schrodinger e EMERALD17 nella suite Rosetta, che tenta di trovare la posa legata più probabile del ligando tenendo conto dei dati sperimentali cryoEM, promette di semplificare e automatizzare questo processo. Analogamente alla cristallografia a raggi X, si prevede che l'identificazione delle modalità di legame dei ligandi a piccole molecole mediante cryoEM, forse due o più in un solo giorno, diventerà una possibilità realistica.

Le cellule svolgono le loro funzioni eseguendo innumerevoli reazioni chimiche simultaneamente e in modo indipendente, ciascuna meticolosamente regolata per garantire la loro sopravvivenza e adattabilità in risposta a stimoli ambientali. Ciò si ottiene mediante il riconoscimento molecolare, che consente alle biomolecole, in particolare alle proteine, di formare complessi transitori o stabili con altre macromolecole e con piccole molecole o ligandi1. Pertanto, le interazioni proteina-ligando sono fondamentali per tutti i processi in biologia, che includono la regolazione dell'espressione e dell'attività proteica, il riconoscimento di substrati e cofattori da parte degli enzimi, nonché il modo in cui le cellule percepiscono e trasmettono i segnali 1,2. Una migliore comprensione delle proprietà cinetiche, termodinamiche e strutturali del complesso proteina-ligando rivela le basi molecolari dell'interazione tra ligando e facilita anche la progettazione razionale di farmaci ottimizzando l'interazione e la specificità dei farmaci. Un approccio economico e più veloce allo studio dell'interazione proteina-ligando consiste nell'utilizzare il docking molecolare, che è un metodo computazionale che esamina virtualmente una vasta gamma di piccole molecole e prevede la modalità di legame e l'affinità di questi ligandi per le proteine bersaglio3. Tuttavia, le prove sperimentali provenienti da strutture ad alta risoluzione determinate dalla diffrazione a raggi X (XRD), dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) o dalla criomicroscopia elettronica (cryoEM) forniscono la prova essenziale per tali previsioni e aiutano nello sviluppo di attivatori o inibitori più nuovi e più efficaci per un determinato bersaglio. Questo articolo utilizza l'abbreviazione "cryoEM" come viene comunemente chiamata la tecnica. Tuttavia, c'è un dibattito in corso sulla scelta della nomenclatura corretta e, recentemente, il termine criogenico-campione Electron Microscopia (cryoEM) è stato proposto per indicare che il campione è a temperatura criogenica e visualizzato con elettroni4. Allo stesso modo, le mappe derivate dalla cryoEM sono state chiamate potenziale elettronico, potenziale elettrostatico o potenziale di Coulomb e, per semplicità, qui usiamo le mappe cryoEM 5,6,7,8,9,10.
Sebbene l'XRD sia stata la tecnica gold standard nella determinazione della struttura ad alta risoluzione dei complessi proteina-ligando, la cryoEM post-rivoluzione11 ha guadagnato slancio, come indicato dall'ondata di mappe di potenziale di Coulomb o mappe crioEM depositate nel database di microscopia elettronica (EMDB)12,13 negli ultimi anni14. A causa dei progressi nella preparazione dei campioni, nell'imaging e nei metodi di elaborazione dei dati, il numero di deposizioni di Protein Data Bank (PDB)14 che utilizzano cryoEM è aumentato dallo 0,7% al 17% tra il 2010 e il 2020, con circa il 50% delle strutture riportate nel 2020 determinate con una risoluzione di 3,5 Å o miglioredi 15,16. La CryoEM è stata rapidamente adottata dalla comunità della biologia strutturale, compresa l'industria farmaceutica, in quanto consente lo studio di macromolecole biologiche flessibili e non cristalline, in particolare proteine di membrana e complessi multiproteici, a risoluzione quasi atomica, superando il processo di cristallizzazione e ottenendo cristalli ben diffranti necessari per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante XRD.
Una modellazione accurata del ligando nella mappa cryoEM è fondamentale, in quanto funge da modello del complesso proteina-ligando a livello molecolare. Esistono diversi strumenti automatizzati per la costruzione di ligandi utilizzati nella cristallografia a raggi X che dipendono dalla forma e dalla topologia della densità del ligando al fine di adattare o costruire il ligando nella densità elettronica 17,18,19,20. Tuttavia, se la risoluzione è inferiore a 3 Å, questi approcci tendono a produrre risultati meno desiderabili perché le caratteristiche topologiche da cui dipendono per il riconoscimento e la costruzione diventano meno definite. In molti casi, questi metodi si sono dimostrati inefficaci nel modellare accuratamente i ligandi in mappe cryoEM, poiché queste mappe sono state determinate nell'intervallo di risoluzione medio-bassa, tipicamente tra 3,5 Å-5 Å17.
Il primo passo nella determinazione della struttura 3D di un complesso proteina-ligando mediante cryoEM prevede la co-purificazione del ligando con la proteina (quando il ligando ha un'elevata affinità di legame con la proteina) o l'incubazione della soluzione proteica con il ligando per un periodo specifico prima della preparazione della griglia. Successivamente, un piccolo volume di campione viene posizionato su una griglia TEM forata pulita al plasma, seguito dal congelamento rapido in etano liquido e infine dall'imaging con un crio-TEM. Le immagini di proiezione 2D da centinaia di migliaia a milioni di singole particelle vengono mediate per ricostruire una mappa del potenziale di Coulomb tridimensionale (3D) della macromolecola. L'identificazione e la modellazione di ligandi e molecole di solvente in queste mappe pone sfide significative in molti casi a causa della risoluzione anisotropa in tutta la mappa (cioè, la risoluzione non è uniforme in tutta la macromolecola), della flessibilità nella regione in cui il ligando è legato e del rumore nei dati. Molti degli strumenti di modellazione, perfezionamento e visualizzazione che sono stati sviluppati per XRD vengono ora adattati per l'uso in cryoEM per gli stessi scopi 18,19,20,21. In questo articolo viene presentata una panoramica dei vari metodi e software attualmente utilizzati per identificare i ligandi, costruire modelli e perfezionare le coordinate derivate dalla crioEM. È stato fornito un protocollo passo-passo per illustrare i processi coinvolti nella modellazione dei ligandi utilizzando specifici complessi proteina-ligando con risoluzione e complessità variabili.
Il primo passo nella modellazione dei ligandi nelle mappe cryoEM include l'identificazione della densità del ligando (non proteico) nella mappa. Se il legame del ligando non induce alcun cambiamento conformazionale nella proteina, allora il calcolo di una semplice mappa di differenza tra il complesso proteina-ligando e l'apo-proteina evidenzia essenzialmente le regioni di densità extra, suggerendo la presenza del ligando. Tali differenze possono essere osservate immediatamente, poiché sono necessarie solo due mappe, e anche mappe intermedie durante il processo di affinamento 3D possono essere utilizzate per verificare se il ligando è presente. Inoltre, se la risoluzione è sufficientemente alta (<3,0 Å), la mappa delle differenze può anche fornire informazioni sulla posizione delle molecole d'acqua e degli ioni che interagiscono con il ligando e i residui proteici.
In assenza della mappa apo-proteica, è ora possibile utilizzare Servalcat22, che è disponibile come strumento autonomo ed è stato anche integrato nella suite software CCP-EM 23,24 come parte del perfezionamento di Refmac e nella versione25,26 di CCP4 8.0. Servalcat consente il calcolo di una mappa di differenza ponderata FSC (Fo-Fc) utilizzando come input le semimappe non nitide e il modello dell'apoproteina. La mappa di omissione Fo-Fc rappresenta la disparità tra la mappa sperimentale (Fo) e la mappa derivata dal modello (Fc). In assenza di un ligando nel modello, una densità positiva in una mappa Fo-Fc che si sovrappone alla mappa EM sperimentale suggerisce tipicamente la presenza del ligando. L'ipotesi qui è che la catena proteica sia ben adattata nella mappa e la densità positiva rimanente indichi la posizione del ligando. Tuttavia, è importante esaminare meticolosamente se la densità positiva deriva da imprecisioni di modellazione, come il rotamero sbagliato di una catena laterale proteica.
Il secondo passo consiste nell'ottenere o creare un file di coordinate cartesiane del legante con una geometria ben definita dalle informazioni chimiche disponibili. I ligandi standard (ad esempio, ATP e NADP+) già disponibili nella libreria di monomeri CCP4 possono essere utilizzati per il raffinamento recuperando i file di coordinate e geometrie tramite il loro codice di accesso ai monomeri. Tuttavia, per i ligandi sconosciuti o non standard, sono disponibili vari strumenti per creare i file di geometria. Alcuni degli esempi includono l'eLBOW27 - (generatore di ligandi elettronici e banco di ottimizzazione) in Phenix28, Lidia - uno strumento integrato in Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-un modulo di Glide all'interno della suite Schrodinger. Il file di coordinate del ligando viene quindi inserito nella densità, guidato sia dalla mappa sperimentale cryoEM che dalla mappa delle differenze in Coot. Questo è seguito dal raffinamento nello spazio reale in Phenix28 o dal raffinamento reciproco in Refmac33. È necessaria una workstation Linux o un laptop dotato di una buona scheda grafica e del software sopra menzionato. La maggior parte di questi programmi sono inclusi in varie suite. CCP-EM24 e Phenix28 sono disponibili gratuitamente per gli utenti accademici e includono una varietà di strumenti utilizzati in questo articolo, tra cui Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, ecc. Allo stesso modo, Chimera37 e ChimeraX38 forniscono licenze gratuite agli utenti accademici.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Consorzio di diversi istituti</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>gratuito per gli utenti accademici e include Coot e l'elenco degli strumenti sviluppati per la cristallografia a raggi X</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>Consorzio di diversi istituti</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>gratuito per gli utenti accademici e include Coot, Relion e molti altri</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Software generale per la costruzione di modelli, ma disponibile anche con altre suite sopra descritte</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Consorzio di diversi istituti</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Software all'interno della suite Phenix per l'aggancio del modello nelle mappe cryoEM</td></tr> Banca <tr><td>dati di microscopia elettronica...</td><td>Consorzio di diversi istituti</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Repository Pubblico per Mappe di Microscopia Elettronica</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific"</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercial, fotocamera di Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp;</td><td>Consorzio di diversi istituti</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>gratuito per utenti accademici e comprende Coot</td></tr><tr><td>Protein Data</td><td>Bank Consorzio di diversi istituti</td><td>https://rcsb.org</td><td>Database pubblico di strutture macromolecolari</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Strumento di viusalizzazione molecolare. La versione educativa è gratuita ma ha delle limitazioni. La versione completa può essere ottenuta con una piccola tassa.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td> https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html <td>Software per l'elaborazione delle immagini cryoEM, disponibile anche con CCP-EM</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific.</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Commerciale, crioTEM da Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software generico per la visualizzazione, l'analisi e altro ancora</td></tr></tbody></table>

modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Decifrare le interazioni proteina-ligando in un complesso macromolecolare è fondamentale per comprendere il meccanismo molecolare, i processi biologici sottostanti e lo sviluppo di farmaci. Negli ultimi anni, la microscopia elettronica criogenica su campione (cryoEM) è emersa come una potente tecnica per determinare le strutture delle macromolecole e per studiare la modalità di legame del ligando a risoluzione quasi atomica. L'identificazione e la modellazione di molecole non proteiche nelle mappe cryoEM è spesso impegnativa a causa della risoluzione anisotropa attraverso la molecola di interesse e del rumore intrinseco nei dati. In questo articolo, i lettori vengono introdotti a vari software e metodi attualmente utilizzati per l'identificazione dei ligandi, la costruzione di modelli e il perfezionamento delle coordinate atomiche utilizzando macromolecole selezionate. Uno dei modi più semplici per identificare la presenza di un ligando, come illustrato con l'enzima enolasi, è quello di sottrarre le due mappe ottenute con e senza il ligando. È probabile che la densità extra del ligando risalti nella mappa delle differenze anche a una soglia più alta. Ci sono casi, come mostrato nel caso del recettore metabotropico del glutammato mGlu5, in cui tali semplici mappe di differenza non possono essere generate. Il metodo recentemente introdotto per derivare la mappa di omissione Fo-Fc può servire come strumento per convalidare e dimostrare la presenza del ligando. Infine, utilizzando come esempio la ben studiata β-galattosidasi, viene analizzato l'effetto della risoluzione sulla modellazione dei ligandi e delle molecole di solvente nelle mappe cryoEM e viene presentata una prospettiva su come la cryoEM può essere utilizzata nella scoperta di farmaci.

Questo protocollo introduce gli strumenti disponibili per la modellazione di ligandi a piccole molecole nelle mappe cryoEM di macromolecole.

Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Siamo interessati a comprendere i processi fisiologici che avvengono in tutta la cellula, in particolare all'interfaccia della membrana. Utilizziamo la Cryo-EM come tecnica principale e lavoriamo su vari problemi biologici interessanti e stimolanti studiando più complessi macromolecolari. Determinare le strutture delle proteine di membrana e di altri complessi labili era difficile un paio di decenni fa.Tuttavia, i progressi tecnici in Cryo-EM, un nuovo detergente e mimetico lipidico e dotato di dotazioni, hanno aperto la strada alla rapida determinazione della struttura di questi complessi. Queste strutture possono ora essere ottenute ad alta risoluzione e potenzialmente utilizzate nella scoperta di farmaci. Nella Cryo-EM a singola particella, le sfide includono l'acquisizione di un campione stabile e omogeneo, l'inclusione del campione in orientamento casuale nel ghiaccio sottile, l'elaborazione di un gran numero di immagini con un basso rapporto segnale/rumore e la determinazione accurata dell'orientamento angolare e della classificazione durante la ricostruzione 3D.L'identificazione e la modellazione di piccole molecole nelle mappe crio-EM dei complessi proteici del ligando è impegnativa a causa del rumore intrinseco nei dati e della bassa risoluzione isotropa e della mappa, dell'eterogeneità del campione e della flessibilità del ligando. Questo protocollo è una guida passo passo per l'identificazione e la modellazione di ligandi e molecole di solvente in Cryo-EM a bassa e media risoluzione.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

L'analisi a singola particella in microscopia crioelettronica è una delle principali tecniche utilizzate per determinare la struttura degli insiemi biologici ad alta risoluzione. Scipion fornisce gli strumenti per creare l'intera pipeline per elaborare le informazioni acquisite dal microscopio e ottenere una ricostruzione 3D del campione biologico.

Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Un'abilità chiave nella modellazione biomolecolare è la visualizzazione e l'annotazione di siti attivi nelle proteine. Questa tecnica è dimostrata utilizzando quattro popolari programmi gratuiti per la visualizzazione macromolecolare: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX.

Modellazione di un sito attivo enzimatico utilizzando Molecular Visualization Freeware

Questo documento presenta un protocollo per l'elaborazione di immagini cryo-EM utilizzando la suite software SPHIRE. Il presente protocollo può essere applicato per quasi tutti i progetti di singoli particelle EM che mirano ad una risoluzione quasi atomica.

Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta dei reagenti di affinità del peptide, un'alternativa affidabile agli anticorpi. Il metodo di ordinamento semi-automatizzato nel presente documento ha razionalizzato biopanning per ridurre l'occorrenza di falsi positivi. Qui illustriamo il processo di pensiero e tecniche applicate nella valutazione dei candidati e minimizzazione dell'analisi a valle.

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l'effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.

Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

Questo protocollo descrive la rimozione dei lipidi endogeni dagli allergeni e la loro sostituzione con ligandi specificati dall'utente attraverso HPLC in fase inversa accoppiato con ricottura termica. 31 di cui: La commissione per la P-NMR e dicroismo circolare consentono la rapida conferma della rimozione/caricamento del ligando e il recupero della struttura allergenica nativa.

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).

Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

Scopri la modellazione di ligandi in mappe criomicroscopia elettronica usando tecniche computazionali. Questo metodo facilita la scoperta di farmaci attraverso strutture ad alta risoluzione di proteine di membrana.

Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

Esplora altri video