Un metodo efficace per l'isolamento di RNA altamente purificato da semi per l'utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre l'RNA ad alta purezza dai semi delle piante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei cereali, come la comprensione dei profili genetici, contenenti le trascrizioni originali nei semi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori sono in grado di preparare RNA altamente purificato con lievi modifiche al metodo basato sulla colonna di spin

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'elevata quantità di oli, proteine, carboidrati e polifenoli nel setaccio anteriore rende difficile isolare l'RNA altamente purificato; A dimostrare la procedura sarà Kazumi Hikino, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare l'esperimento, aggiungere l'uno per cento in peso per volume di PVP di grado di biologia molecolare al tampone di lisi cellulare per l'estrazione dell'RNA e agitare vigorosamente la miscela. Incubare il PVP per 20 minuti a 25 gradi Celsius per scioglierlo completamente.

Dopo 20 minuti di incubazione, mescolare delicatamente il tampone capovolgendo la provetta per evitare la formazione di bolle. Raccogli i frutti dalle piante di Arabidopsis thaliana e mettili in due tubi di polipropilene da 1,5 millimetri su ghiaccio, quindi posiziona i frutti su piastre di alluminio mantenute a quattro gradi Celsius e isola i semi dai frutti sotto uno stereomicroscopio. Successivamente, metti circa 200 semi isolati in tubi di polipropilene da 1,5 millilitri che sono stati precedentemente conservati in una griglia di alluminio sul ghiaccio e metti immediatamente i tubi in azoto liquido.

Togliete i tubi dall'azoto liquido e rimetteteli sulla griglia di alluminio con ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri di tampone PVP all'uno per cento a ciascuna provetta e centrifugare le provette per un minuto a 1000 volte G, a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, omogeneizzare il campione con un pestello in acciaio inox utilizzando un trituratore a motore per 60 secondi mantenendo la provetta nella rastrelliera di alluminio sul ghiaccio; quindi, aggiungere 550 microlitri di tampone 100%PVP e capovolgere delicatamente la provetta per miscelare e incubare la provetta.

Dopo l'incubazione, centrifugare la soluzione, quindi trasferire 550 microlitri di surnatante in una nuova provetta di polipropilene da 1,5 millimetri e centrifugare il surnatante. Trasferire 450 microlitri di surnatante in un nuovo tubo di polipropilene da 1,5 millimetri. Utilizzare il surnatante come lisato cellulare per l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit disponibile in commercio.

Preparare una griglia di alluminio con ghiaccio e scongelare la miscela di RNA totale picchiettando delicatamente, quindi posizionare la provetta sulla griglia. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Quindi diluire l'RNA totale in acqua priva di RNasi.

Scongelare l'RNA totale e i set di tamponi dal kit commerciale, mantenere gli enzimi del kit sul ghiaccio dopo una delicata picchiettatura. Preparare provette sterilizzate in polipropilene da 0,2 millilitri prive di nucleasi per le successive analisi. Sul ghiaccio, combinare cinque microlitri di RNA totale, un microlitro o 50 micromolari di primer oligo DT e un microlitro, o 50 micromolari casuali six-mer nel tubo di polipropilene da 0,2 millilitri.

Incubare la miscela per 15 minuti a 37 gradi Celsius, quindi posizionare la provetta sul ghiaccio. Regolare le concentrazioni di plasmidi per i modelli di DNA per le curve standard. Successivamente, diluire le soluzioni di CDNA da uno a 100 con acqua distillata, quindi aggiungere due microlitri delle soluzioni di CDNA diluite e i plasmidi precedentemente preparati per le curve standard alla miscela master dal kit di PCR quantitativa in tempo reale.

Infine, imposta la PCR in tempo reale e inserisci i campioni. L'RNA totale è stato isolato da circa 1.000 semi utilizzando concentrazioni variabili di tampone di lisi cellulare, PVP. Le quantità e la purezza degli RNA isolati dimostrano che l'1,0% di PVP è la concentrazione più efficace per isolare grandi quantità di RNA purificato dai semi.

Le concentrazioni, i rapporti A260 e A280 e i rapporti A260 A230 dell'RNA isolato da 200 semi hanno dimostrato che questo metodo era il migliore per isolare l'RNA altamente purificato da otto e 12 giorni dopo la fioritura, o semi DAF. Sebbene le quantità di trascritti rugosi e zucchero-dipendenti siano relativamente basse nei semi in via di sviluppo, è stato possibile rilevare i cambiamenti di espressione tra i semi in diversi stadi di sviluppo tramite PCR in tempo reale; Questo metodo è adatto anche per altri semi oleosi, come dimostrato in questa tabella. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia vegetale per esplorare i profili di espressione genica in alta concentrazione di riserve immagazzinate, come semi e frutti.