Endoreduplicazione tramite flusso Cytometry di tubero isolato protoplasti di misura

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare i livelli di endoreduplicazione all'interno dei tuberi di patata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla morfologia del tubero di patata, come la fase di sviluppo in cui i tessuti del tubero subiscono l'endoreduplicazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce risultati molto più chiari rispetto alle tipiche preparazioni di citometria a flusso.

A dimostrare la procedura sarà Parker Laimbeer. Uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver preparato le soluzioni e i tamponi secondo il protocollo di testo, sterilizzare in superficie i tuberi di patata immergendoli in etanolo al 71% per almeno cinque minuti.

Rimuovi i materiali vegetali dall'etanolo e lasciali asciugare all'aria. Preparare ed etichettare provette coniche sterili da 50 millilitri per ogni campione e aliquotare 15 millilitri di soluzione di incubazione per plasmolisi sterilizzata con filtro o PIS, in ciascuna. Utilizzando un bisturi sterilizzato o un foro di sughero, campione di circa un centimetro cubo del desiderio di sterilizzare il tessuto.

Usa il bisturi sterilizzante per tagliare grossolanamente il fazzoletto in pezzi di circa tre millimetri cubi. E trasferire il tessuto in una provetta conica contenente PIS. Quindi incubare il tessuto a quattro gradi Celsius durante la notte.

Per generare protoplasti di patata, iniziare preparando e filtrando una quantità appropriata di soluzione enzimatica o ES con 0,71 molari di mannitolo, tre millimolari di cloruro di calcio, un millimolare di fosfato monopotassico. Un millimolare di cloruro di magnesio, 4% Onozuka R-10 cellulasi, 0,8% Macerozyme R-10, 1% emicellulasi e 10 millimolare tampone MES, pH 5,8. Utilizzando una pipetta sierologica, aspirare il PIS dai campioni nelle provette.

Aggiungere 10 millilitri di ES a ciascun campione e capovolgere le provette due o tre volte. Quindi incubare i campioni a 29% Celsius e 180 RPM durante la notte. Il terzo giorno, per raccogliere e lavare i protoplasti, rimuovere i campioni dall'agitatore e lasciarli riposare per circa 10 minuti.

Con una pipetta sierologica, aspirare la maggior parte possibile della soluzione ES, facendo attenzione a evitare il tessuto digerito. Quindi, utilizzando una micropipetta e tenendo la provetta inclinata, rimuovere nuovamente l'eventuale soluzione ES rimanente evitando il tessuto digerito. È fondamentale rimuovere la maggior parte possibile della soluzione di lavaggio dei protoplasti per evitare danni ai nuclei.

Tenere il tubo inclinato può aiutare con la rimozione della soluzione mentre si lasciano i protoplasti. Aggiungere 15 millilitri di PWS a ciascun campione. E capovolgere delicatamente il tubo due o tre volte.

Lasciare riposare i protoplasti per 10 minuti. Quindi utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere il PWS. E una micro pipetta per rimuovere il liquido residuo.

Mantenendo i campioni sul ghiaccio, aggiungere 1,5 millilitri di FCB ghiacciato a ciascuna provetta. Agitare brevemente o agitare ogni campione per rompere il tessuto aggregato. È importante rompere i grumi di tessuto tuberare in modo che l'FCB possa permeare completamente le cellule e rilasciare i nuclei.

Se è necessario aggiungere un controllo a partire da questo passaggio, utilizzare una lama di rasoio per tritare finemente una fogliolina in 1,5 millilitri di FCB ghiacciato. I campioni di controllo devono avere la stessa ploità dei campioni sperimentali, preferibilmente dello stesso genotipo. Inserire una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con la punta tagliata e una rete metallica da 106 micrometri fusa sul fondo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.

Quindi passare un millilitro di sospensione tissutale FCB attraverso il filtro. Aggiungere 250 microlitri della soluzione di RNA a ciascun campione. Quindi capovolgere le provette e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere 125 microlitri di ioduro di propidio o soluzione PI precedentemente preparata a ciascun campione. Capovolgere e incubare le provette con ghiaccio per 30 minuti. Utilizzare i campioni il prima possibile ed entro due ore evitare la degradazione.

Crea due grafici a punti utilizzando la scala logaritmica della dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale e PI rispetto alla dispersione laterale. Creare anche un istogramma con PI sull'asse x. La scala logaritmica è necessaria per garantire che tutti gli eventi siano all'interno della scala, poiché i nuclei possono differire notevolmente nella fluorescenza.

Caricare una provetta di un campione di controllo noto, come un tessuto fogliare in vitro, da un genotipo di campione. E regola la tensione in modo che tutti gli eventi siano in scala. Prendere nota del canale del picco 2C nel campione di controllo.

I picchi di 2C dei campioni sperimentali dovrebbero cadere nella stessa posizione. Caricare un campione sperimentale di tubero e assicurarsi nuovamente che tutti gli eventi siano in scala. Se sono necessarie regolazioni, ripetere la regolazione della tensione del campione di controllo per identificare il canale dei picchi 2C.

Gate manualmente i nuclei dei protoplasti utilizzando il grafico side scatter versus PI. Quindi impostare l'istogramma PI in modo che mostri solo la regione dei nuclei dei protoplasti gated. Raccogliere il numero desiderato di eventi da ogni campione.

Spesso i ricercatori utilizzano 10.000 eventi gated per la citometria a flusso. Tuttavia, qui vengono utilizzati 2000 eventi per campioni di protoplasti di tuberi per ospitare più campioni e campioni con basse concentrazioni. La generazione di protoplasti è necessaria per ottenere risultati ripetibili di citometria a flusso dai tuberi di patata.

La cui morfologia generale è mostrata qui. La separazione tra midollo e parenchima perimidollare è illustrata da linee nere. L'anello vascolare, che separa il parenchima dalla corteccia, è indicato con una freccia nera.

I protoplasti isolati devono essere sferici e simmetrici con la membrana plasmatica intatta. Si noti la differenza di dimensioni tra i protoplasti fogliari e tuberogeni, nonché le differenze di dimensioni all'interno di un tessuto che possono indicare diversi livelli di endoreduplicazione. Questa figura mostra la variazione dei risultati che si possono riscontrare sia nei grafici a dispersione della citometria a flusso che negli istogrammi.

I nuclei intatti mostrano una netta separazione tra i picchi per quantificare l'abbondanza relativa delle cellule, mentre i campioni integrati nei picchi mostrano basi larghe e sovrapposte. Nei corrispondenti grafici a dispersione, le caselle nere indicano il gating degli eventi nucleari per gli istogrammi e il raggruppamento degli eventi si riflette nell'ampiezza dei picchi degli istogrammi. Questo esperimento che analizza i livelli di endoreduplicazione o EI conferma i risultati precedenti che il tessuto midollo mostra un'EI più elevata rispetto al tessuto della corteccia.

Sorprendentemente, il profilo del tessuto del parenchima era simile a quello della corteccia ed era anche significativamente diverso dal tessuto del midollo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la sterilità del campione per le prime due incubazioni e di mantenere i campioni in ghiaccio il più possibile dopo che i protoplasti sono stati lisati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la manipolazione genetica per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali geni influenzano i livelli di endoreduplicazione del tubero.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre protoplasti dai tuberi di patata e prepararli per la citometria a flusso per studiare i loro livelli di endoreduplicazione. Non dimenticare che lavorare con lo ioduro di propidio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario sempre prendere precauzioni come DPI adeguati.