Name: Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Scopri come quantificare gli eventi di endocitosi nelle cellule di lievito utilizzando il pHluorin supereclittico e la citometria a flusso. Questo metodo permette di analizzare l'impatto di mutazioni sul traffico vescicolare.

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Vorremmo ringraziare Gero Miesenböck e Tim Ryan per aver condiviso il cDNA di pHluorin utilizzato per generare reagenti in questo studio, Nathan Wright, Joanna Poprawski e Lydia Nyasae per l'eccellente assistenza tecnica, i membri del laboratorio Wendland per le utili discussioni, e Michael McCaffery e Erin Pryce dell'Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) per i consigli e l'assistenza con la microscopia e la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (a B.W., GM60979) e della National Science Foundation (a B.W., MCB 1024818). K.W. è stato sostenuto in parte da una borsa di studio per la formazione del National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. è stato sostenuto da fondi per lo sviluppo del Dipartimento di Scienze Biologiche della Duquesne University e dalla National Science Foundation CAREER grant 553143.

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Applicazioni di pHluorin per la quantificazione degli eventi endocitosi in cellule di lievito fa uso di carichi transmembrana in cui il tag fluorescente viene fusa alla coda citoplasmatica della proteina (Figura 1A). Per i saggi qui descritte, carichi sono fluorescenti vivacemente quando il tag pHluorin è esposto ad ambienti neutri, ma diventano spenta quando il tag pHluorin incontra condizioni di acidità. Così, un carico endocitico pHluorin-tag è prontamente rilevata la faccia citoplasmatica della memb...

traffico vescicolare svolge un ruolo importante nel mantenimento dell&#39;identità organello e funzione in cellule eucariotiche, ed è un meccanismo fondamentale di regolazione composizione proteica e la membrana dei singoli compartimenti cellulari. Alla membrana plasmatica, fusione delle vescicole esocitosi offre nuove proteine ​​e membrane alla superficie della cellula, mentre vescicole generati tramite endocitosi rimuovere la membrana e proteine ​​dalla superficie per il successivo riciclaggio o destinata al lisosoma. Così, endocitosi è importante per l&#39;assorbimento dei nutrienti e risposte all&#39;ambiente extracellulare. Esocitosi e endocitosi sono equilibrati per regolare la superficie della membrana plasmatica, e per consentire un fatturato di proteine ​​danneggiate. Studi in lievito e cellule di mammifero hanno identificato un gran numero di proteine ​​coinvolte nella endocitosi, così come molteplici percorsi endocitosi che promuovono internalizzazione dei carichi specifici o che agiscono in risposta ad una varietà di encondizioni am-. Il percorso più studiato è clatrina mediata endocitosi (CME), in cui clathrin e accessori citosolico proteine ​​assemblano in una struttura cappotto per stabilizzare la vescicola endocitico nascente. Gli esperimenti in erba lievito Saccharomyces cerevisiae hanno prodotto conoscenze fondamentali nei confronti delle dinamiche e l&#39;ordine di assunzione per molte proteine endocytic 1-3. In particolare, la macchina CME è altamente conservata attraverso l&#39;evoluzione tale che la maggior parte delle proteine ​​CME-relativi a lievito ha ortologhi umani; in tal modo, il lievito è stato uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi di endocitosi che sono conservati in eucarioti superiori. Ad esempio, gli studi che utilizzano il lievito in erba hanno determinato che la formazione e la maturazione delle strutture ECM (denominato patch actina come corticali nel lievito) coinvolge il reclutamento sequenziale di molte proteine, a cominciare da clatrina e proteine ​​adattatrici cargo-binding, seguita da assunzione di accessorio endocytic supplementari proteine,attivazione di polimerizzazione actina Arp2 / 3-mediata, e l&#39;assunzione di proteine coinvolte nella scissione delle vescicole 1,2. Assunzione di proteine ​​macchine ECM per corticale patch di actina è un processo altamente ordinato e stereotipata, e l&#39;ordine preciso di reclutamento per molte proteine ​​è stato stabilito rispetto ad altri componenti del macchinario CME. È importante sottolineare che recenti studi hanno confermato un ordine simile di reclutamento per le proteine ECM ai box clathrin rivestite in cellule di mammifero 4. Oltre al CME, molti tipi di cellule in possesso di uno o più endocitico (CIE) percorsi clatrina-indipendenti che si basano su meccanismi alternativi per promuovere la formazione di vescicole e interiorizzazione dalla membrana plasmatica 5-7. In lievito, abbiamo recentemente identificato un percorso CIE che utilizza la piccola GTPasi Rho1 e il suo fattore di attivazione guanina scambio nucleotide (GEF), Rom1 8,9. Rho1 attiva il Formin Bni1 di promuovere la polimerizzazione 10,11, che è richiesto per questa forma di endocitosi clatrina-indipendenti in lievito 12. Inoltre, la famiglia α-arrestina di proteine reclutare l&#39;ubiquitina ligasi Rsp5 per promuovere carico ubiquitinazione e successiva interiorizzazione attraverso CME 13-17, e anche promuovere carico interiorizzazione attraverso la via CIE, possibilmente attraverso l&#39;interazione diretta con le proteine coinvolte nel CIE 18. Una varietà di percorsi CIE esistono anche nelle cellule dei mammiferi, inclusi i percorsi clatrina-indipendenti e fagocitarie che si basano sul ortologo Rho1, RhoA 9,19. Il ruolo di RhoA in mammiferi CIE è poco conosciuta; in tal modo, gli studi in lievito in erba possono fornire approfondimenti meccanicistici aggiuntive che sono applicabili a CIE mammiferi. quantificazione accurata di eventi endocitici può fornire informazioni importanti circa i ruoli di proteine ​​specifiche nella regolazione endocitosi, e può rivelare gli effetti delle mutazioni sul carico internalizzazione o progression attraverso la via endocitico. A tale scopo, metodi biochimici possono essere utilizzati per monitorare ligando assorbimento o misurare tassi di degradazione delle proteine ​​cargo endocitosi. Nelle cellule viventi, fusione di proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti per carichi di interesse permette la visualizzazione diretta del trasporto merci. Tuttavia, carichi GFP-tagged sono di uso limitato per la quantificazione di endocitosi perché GFP è resistente alla degradazione in lisosomi (o vacuolo nel lievito). Inoltre, GFP fluorescenza è solo parzialmente sensibile alle variazioni di pH, e rimane rilevabile all&#39;interno del vacuolo lume 20,21. Di conseguenza, la fluorescenza del tag GFP persiste nel vacuolo molto tempo dopo il resto del carico è stato degradato, e tutta la quantificazione delle cellule a base di intensità di carico può essere impreciso a causa di fluorescenza GFP-lungo termine nel vacuolo. Al fine di superare gli inconvenienti della vacuolare GFP fluorescenza, abbiamo in precedenza fatto uso di pH supereclipticluorin, una variante pH-sensibile GFP che brilla fluorescente a pH neutro, ma perde fluorescence in ambienti acidi, come il lume del vacuolo / lisosoma 20,22,23. Posizionamento di un tag pHluorin sulla coda citoplasmatica dei carichi endocitici consente di visualizzare i carichi a livello della membrana plasmatica e su endosomi precoci, in cui il tag pHluorin rimane esposta al citoplasma (Figura 1A). Come endosomi precoci maturano, il endosomal di ordinamento complessi necessari per i pacchetti di trasporto (ESCRT) macchine carichi superficie localizzata in vescicole che germogliano nel lume del endosome, generando corpi multivesicular (MVB) 24. Per carichi che sono stati incorporati in vescicole MVB interne, il tag pHluorin rivolta verso il lume vescicole. vescicole MVB interne sono acidificati; in tal modo, carichi pHluorin-taggate perdono fluorescenza su endosomi precoci man mano che maturano in MVB 20. la fusione successiva della MVB con vacuolo fornisce i contenuti MVB luminaleper la degradazione, tag e pHluorin rimangono spente nell&#39;ambiente acido del lume vacuolo. Questo documento fornisce descrizioni dettagliate di analisi quantitativa, utilizzando endocitici carichi con tag pHluorin citoplasmatici nel lievito. I ceppi esprimenti carichi pHluorin-marcati possono essere utilizzati in saggi cinetici e / o del computer, a seconda delle proprietà e traffico comportamento del carico specifico. Inoltre, alcuni carichi pHluorin-tag sono suscettibili di metodi di analisi high-throughput, tra cui citometria a flusso. È importante sottolineare che il tag pHluorin è uno strumento versatile per studiare eventi endocytic nelle cellule viventi, permettendo la quantificazione di endocitosi e confronto della funzione endocitico nel wild-type e mutanti.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Utilizzare per la preparazione di terreni di coltura</td></tr><tr><td>BD Difco Lievito Base di azoto (senza amminoacidi)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Utilizzare per la preparazione di terreni liquidi e piastre</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>Utilizzare per il rivestimento della camera </td></tr><tr><td>vetrini Destrosio</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>Utilizzare per la preparazione di liquidi e piastre</td></tr><tr><td>L-istidina</td><td>Fisher</td><td>BP382-100</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Acros</td><td>125121000</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi e di una soluzione madre</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>Utilizzare per la preparazione di una miscela di aminoacidi</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 pozzetti)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Utilizzare per saggi cinetici e finali di internalizzazione Mup1-pHluorin</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Utilizzare per la preparazione di miscele di aminoacidi e soluzione madre</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens Carl</td><td>Zeiss</td><td></td><td>L'obiettivo deve essere 100X, 1.4NA o superiore</td></tr><tr><td>La fotocamera Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>deve avere una gamma dinamica a 12 bit o superiore</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Fonte di illuminazione</td><td>Software Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5</td><td>Software Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

le domande di phluorin per quantitativa, cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti sono ampiamente utilizzati strumenti per studiare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica di eventi come il rimodellamento del citoscheletro e il traffico vescicolare nelle cellule viventi. metodologie quantitative che utilizzano fusioni GFP chimerici sono stati sviluppati per molte applicazioni; tuttavia, GFP è un po &#39;resistente alla proteolisi, così la sua fluorescenza persiste nel lisosoma / vacuolo, che può ostacolare la quantificazione del traffico merci nella via endocitico. Un metodo alternativo per quantificare endocitosi e post-endocitosi eventi traffico fa uso di superecliptic pHluorin, una variante pH-sensibile GFP che viene raffreddato in ambienti acidi. la fusione chimerica del pHluorin alla coda citoplasmatica di transmembrana carico proteine ​​risultati in una attenuazione della fluorescenza al momento della costituzione del carico in corpi multivesicular (MVB) e la consegna al lume lisosomi / vacuolo. Così, tempra di fluorescenza vacuolare facilita quantificazione di endocitosi ed eventi precoci nella via endocitico. Questo documento descrive i metodi che utilizzano carichi pHluorin-tag per la quantificazione di endocitosi tramite microscopia a fluorescenza, così come saggi basati sulla popolazione citometria a flusso.

Localizzazione steady-state e la quantificazione del costitutivamente interiorizzato endocitico proteine cargo STE3 Per dimostrare che carichi pHluorin-tag possono essere utilizzati per la quantificazione di endocitosi in cellule viventi, localizzazione di GFP chimerico e fusioni pHluorin con la coda citoplasmatica C-terminale STE3, il recettore feromone un fattore in lievito, sono stati confrontati. STE3 è un...

La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare gli eventi di trasporto vescicolare nel percorso endocitico di cellule vive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trasporto vescicolare, ad esempio come le mutazioni o i cambiamenti nell'espressione proteica influenzino i tassi e l'efficienza degli eventi di trasporto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione diretta del trasporto endocitico in cellule vive misurando l'intensità di proteine cargo marcate con fluorocromi.Dopo aver preparato le soluzioni e i mezzi in base al protocollo descritto nel testo, inoculare da due a tre colonie di cellule di lievito in cinque millilitri di mezzo YNB, privo di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento della selezione del plasmide. Far crescere le colture a 30 gradi Celsius con agitazione per 16-24 ore. Circa tre ore prima dell'acquisizione delle immagini, misurare l'OD 600 di ciascuna coltura notturna.Quindi preparare delle diluizioni da cinque millilitri con un OD a 600 nm compreso tra 0,35 e 0,4 in mezzo YNB, privo di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento del plasmide, e coltivare a 30 gradi Celsius con agitazione per tre ore. Durante l'incubazione, pre-equilibrare la camera ambientale del microscopio o il piatto riscaldato a 30 gradi Celsius. Dopo aver preparato una piastra in vetro da otto pozzetti trattata con canna e una piastra con camera per l'acquisizione di immagini secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 200 microlitri di mezzo YNB privo di nutrienti aggiuntivi per la selezione del plasmide in ciascun pozzetto.Quando le colture sono pronte, trasferire un millilitro in una provetta microcentrifuga e formare il pellet cellulare a 8.000 giri/min per due minuti. Rimuovere quindi 975 microlitri del sopranatante. Ri-sospendere il pellet cellulare nel sopranatante rimanente.Quindi aggiungere 2,5 microlitri della sospensione cellulare al centro di ogni pozzetto della piastra a otto pozzetti. Pipettare su e gi&ugrave; per disperdere le cellule e lasciare sedimentare le cellule per cinque-dieci minuti. Posizionare la camera portaoggetti su un microscopio a fluorescenza invertito equilibrato a 30 gradi Celsius.Quindi, utilizzare l'illuminazione in campo chiaro per individuare un campo di cellule. Aggiungere 50 microlitri di mezzo YNB preriscaldato contenente 100 microgrammi per millilitro di metionina ai 200 microlitri di mezzo nel pozzetto, in modo da ottenere una concentrazione finale di metionina pari a 20 microgrammi per millilitro. Lasciare equilibrare le cellule per due minuti prima di iniziare l'acquisizione delle immagini.Quindi immediatamente prima dell'acquisizione delle immagini, regolare il microscopio sul piano focale desiderato. Acquisire le immagini di GFP in campo chiaro o in contrasto di interferenza differenziale (DIC) a intervalli di 5 minuti per un periodo compreso tra 45 e 60 minuti. Utilizzare parametri di acquisizione identici per tutte le immagini all'interno di una serie temporale.Fare riferimento al protocollo testuale per ulteriori dettagli. Quantificare l'intensità di fluorescenza delle singole cellule in ogni punto temporale ed esprimere i valori come percentuale dell'intensità iniziale della prima immagine. Dopo aver esportato le immagini secondo il protocollo testuale in ImageJ, aprire i file nel menu file utilizzando l'opzione Apri.Utilizzare l'immagine in fluorescenza per la quantificazione e l'immagine in campo chiaro o in contrasto di fase (DIC) come riferimento per identificare la posizione delle cellule. Escludere le cellule morte, se presenti, che appaiono più scure rispetto alle cellule vive quando osservate in DIC e autofluorescono nel canale GFP. Per immagini con uno sfondo non uniforme, nel menu Elabora, selezionare l'algoritmo di sottrazione dello sfondo e scegliere l'impostazione predefinita.Dopo aver acquisito le immagini, è importante eseguire la sottrazione del fondo prima di procedere con la procedura di quantificazione. Questo passaggio è particolarmente importante perché il segnale di fondo potrebbe altrimenti mascherare o attenuare le differenze tra i campioni. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, delimitare una cellula assicurandosi di includere l'intera cellula ma con la minima area possibile al di fuori di essa.Quindi, nel menu Analizza, utilizzare la funzione imposta misurazioni per misurare l'area, la densità integrata e il valore medio di grigio. Aprire il Gestore ROI cliccando su Analizza, quindi su Strumenti. Nella finestra del Gestore ROI, fare clic sul pulsante Aggiungi per inserire la regione evidenziata come nuova ROI.Ripetere il tracciamento e la misurazione per le restanti cellule nell'immagine, escludendo le cellule morte o quelle che toccano il bordo dell'immagine. Salvare le ROI selezionate come file zip facendo clic sul pulsante measure, che mostrerà i valori misurati in una nuova finestra. Quindi fare clic sul pulsante more ed esportare tutte le misurazioni in un foglio di calcolo o in un software di analisi statistica.Inoculare due o tre colonie di cellule di lievito e 0,5 millilitri di mezzo YNB, privo di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento della selezione del plasmide. Far crescere le cellule su un tamburo rotante a 30 gradi Celsius per 16-24 ore. Aggiungere un millilitro di mezzo YNB privo di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento del plasmide e far crescere per ulteriori tre ore.Successivamente, trasferire un millilitro di cellule in ciascuna di due provette rotonde da cinque millilitri. Aggiungere quindi 0,25 millilitri di mezzo YNB Met alla prima provetta e 0,25 millilitri di mezzo YNB contenente 100 microgrammi per millilitro di metionina alla seconda provetta, per ottenere una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro. Per un elevato numero di campioni, aggiungere la metionina in modo sfalsato per lasciare tempo sufficiente per l'analisi dei dati.Il nostro citometro a flusso può misurare fino a 40 campioni per run. Aggiungiamo la metionina in lotti. Otto campioni ogni cinque minuti.Questo garantisce che tutti i campioni vengano misurati tra 45 e 50 minuti dopo l'aggiunta di metionina. Incubare le cellule per 45 minuti. Successivamente, analizzare le cellule mediante citometria a flusso, selezionando lo scatter in avanti o FS come misura della dimensione cellulare e riportando un'intensità di fluorescenza in flusso proveniente da un filtro FITC come misura dell'internalizzazione del carico. Durante l'incubazione di 45 minuti, utilizzare i pulsanti scorrevoli per regolare il voltaggio dei canali FS e FITC al fine di ottimizzare il rilevamento in base all'intervallo di dimensioni e all'intensità di fluorescenza delle cellule di lievito utilizzate. Misurare il valore di FS e l'intensità di fluorescenza per 10.000 cellule per ogni condizione. Utilizzando l'impostazione ad alto flusso, generare un grafico a dispersione di FS rispetto all'intensità di fluorescenza cliccando su "aggiungi grafico".Quindi selezionare FITC per l'asse x e FS per l'asse y e riportare su grafico 1000 punti. Utilizzando la funzione di gating e la condizione wild type Met, impostare un gate verticale in modo che circa il 5% delle cellule più brillanti si trovi a destra del gate. Utilizzare questo gating per tutte le altre condizioni dell'esperimento.Come mostrato qui, l'acquisizione di immagini in time-lapse delle cellule &egrave; stata eseguita a intervalli di cinque minuti in assenza o in presenza di metionina per monitorare l'internalizzazione di Mup1 marcato con GFP o fluoro e le variazioni della fluorescenza. Come previsto, Mup1 marcato con GFP e fluoro &egrave; rimasto sulla membrana plasmatica in assenza di metionina. Al contrario, le cellule acquisite in presenza di metionina hanno mostrato un progressivo esaurimento del segnale fluorescente dalla superficie cellulare, coerente con l'internalizzazione del carico.Tuttavia, la cinetica della fluorescenza persa in presenza di metionina è risultata ritardata nelle cellule Mup1 GFP rispetto alle cellule pHlourin Mup1. Questi grafici a dispersione confrontano l'intensità di fluorescenza di cellule di tipo selvaggio o di quattro cellule delta ENTH1 in presenza o assenza di metionina dopo l'applicazione di un gate verticale. Il 4% delle cellule di tipo selvaggio trattate con metionina si trovava sul lato destro del gate, corrispondente alle cellule più brillanti della popolazione, mentre il 65% delle cellule di tipo selvaggio non trattate era contenuto all'interno del gate.Al contrario, le quattro linee cellulari delta ENTH1 non hanno mostrato differenze nella distribuzione di cellule luminose rispetto a quelle deboli, coerentemente con un difetto nell'endocitosi. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di suddividere i tempi di inizio quando si eseguono esperimenti simultanei, in modo che i dati finali possano essere raccolti dopo un identico tempo di trattamento per tutti i campioni.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come schermate genetiche su fiori per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali nuovi fattori contribuiscono al traffico vescicolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico vescicolare per esplorare aspetti relativi all'attrizione degli endosomi, nonché un nuovo percorso indipendente dalla clatrina e acido individuato nel lievito in gemmazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare cargo di tipo florent per quantificare eventi endocitici in cellule vive.

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Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari...

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Vi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L'analisi include lignaggio automatico e l'assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Scopri come quantificare gli eventi di endocitosi nelle cellule di lievito utilizzando il pHluorin supereclittico e la citometria a flusso. Questo metodo permette di analizzare l'impatto di mutazioni sul traffico vescicolare.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

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