Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare gli eventi di traffico vescicolare nella via endocitica delle cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico vescicolare, come ad esempio il modo in cui la mutazione o i cambiamenti nell'espressione proteica influenzano i tassi e l'efficienza degli eventi di traffico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione diretta del traffico endocitico e delle cellule viventi misurando l'intensità delle proteine cargo marcate in fluorescenza.

Dopo aver preparato le soluzioni e i terreni secondo il protocollo di testo, inoculare due o tre colonie di cellule di lievito in cinque millilitri di terreno YNB, mancando di nutrienti aggiuntivi per mantenere la selezione dei plasmidi. Coltiva le colture a 30 gradi Celsius agitando per 16-24 ore. Circa tre ore prima dell'imaging, misurare l'OD 600 di ciascuna coltura notturna.

Quindi preparare diluizioni di cinque millilitri a un OD 600 da 0,35 a 0,4 in terreno YNB, prive di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento del plasmide e crescere a 30 gradi Celsius agitando per tre ore. Durante l'incubazione, pre-equilibrare la camera ambientale del microscopio o il tavolino riscaldato a 30 gradi Celsius. Dopo aver preparato un vaso di vetro a otto pozzetti trattato con lattina e un vetrino da camera per l'imaging secondo il protocollo di testo, aggiungere 200 microlitri di terreno YNB privo di nutrienti aggiuntivi per la selezione del plasma a ciascun pozzetto.

Quando le colture sono pronte, trasferire un millilitro in una provetta per microfrigo e pellettare le cellule a 8.000 giri/min per due minuti. Quindi rimuovere 975 microlitri di surnatante. Risospendere il pellet di cella nel surnatante rimanente.

Quindi far cadere 2,5 microlitri della sospensione cellulare al centro di ciascun pozzetto della piastra a otto pozzetti. Pipettare su e giù per disperdere le cellule e lasciare che le cellule si stabilizzino per cinque-10 minuti. Posizionare il vetrino da camera su un microscopio a fluorescenza invertita bilanciato a 30 gradi Celsius.

Quindi, utilizzare l'illuminazione a campo chiaro per individuare un campo di celle. Aggiungere 50 microlitri di terreno YNB preriscaldato contenente 100 microgrammi per millilitro di metionina ai 200 microlitri di terreno nel pozzetto per ottenere una concentrazione finale di metionina di 20 microgrammi per millilitro. Lasciare che le cellule si equilibrino per due minuti prima di iniziare l'imaging.

Quindi, immediatamente prima dell'imaging, regolare il microscopio sul piano focale desiderato. Acquisizione di immagini GFP in campo chiaro o DIC a intervalli di 5 minuti per 45-60 minuti. Utilizzo di parametri di acquisizione identici per tutte le immagini all'interno di una serie temporale.

Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. Quantifica l'intensità della fluorescenza delle singole cellule in ogni punto temporale ed esprimi i valori come percentuale dell'intensità iniziale della prima immagine. Dopo aver esportato le immagini secondo il protocollo di testo nell'immagine j, aprire i file nel menu file utilizzando l'opzione Apri.

Utilizzare l'immagine a fluorescenza per la quantificazione e l'immagine in campo chiaro o DIC come riferimento per identificare la posizione delle cellule. Escludere le cellule morte presenti che appaiono più scure delle cellule vive quando visualizzate da DIC e autofluorescenza sotto il canale GFP. Per le immagini con uno sfondo irregolare nel menu Processo, scegliete l'algoritmo di sottrazione dello sfondo e scegliete l'impostazione predefinita.

Una volta acquisite le immagini, è importante eseguire la sottrazione dello sfondo prima di procedere con la procedura di quantificazione. Questo passaggio è particolarmente importante perché il segnale di fondo potrebbe altrimenti mascherare o smorzare le differenze tra i campioni. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, delinea una cella assicurandoti di includere l'intera cella ma la minor area possibile al di fuori della cella.

Quindi, nel menu Analizza, utilizzare la funzione di impostazione delle misurazioni per misurare l'area, la densità integrata e il valore medio di grigio. Apri il ROI Manager facendo clic su Analizza, quindi su Strumenti. Nella finestra ROI Manager, fare clic sul pulsante Aggiungi per inserire l'area evidenziata come nuovo ROI.

Ripetere la struttura e la misurazione delle celle rimanenti nell'immagine, escludendo le celle morte o le celle che toccano il bordo dell'immagine. Salva le ROI selezionate come file zip facendo clic sul pulsante di misurazione che visualizzerà i valori misurati in una nuova finestra. Quindi fare clic sul pulsante Altro ed esportare tutte le misurazioni in un foglio di calcolo o in un software di analisi statistica.

Inoculare due o tre colonie di cellule di lievito e 0,5 millilitri di terreno YNB, mancando di nutrienti aggiuntivi per mantenere la selezione dei plasmidi. Far crescere le cellule su un tamburo a rulli a 30 gradi Celsius per 16-24 ore. Aggiungi un millilitro di terreno YNB privo di nutrienti aggiuntivi per il mantenimento del plasmide e coltiva per altre tre ore.

Quindi, trasferisci un millilitro di cellule in ciascuna delle due provette a fondo tondo da cinque millilitri. Quindi aggiungere 0,25 millilitri di terreno YNB Met alla prima provetta e 0,25 millilitri di terreno YNB contenente 100 microgrammi per millilitro di metionina alla seconda provetta per una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro. Per un gran numero di campioni, scaglionare l'aggiunta di metionina per tenere conto del tempo necessario per l'analisi dei fatti.

Il nostro citometro a flusso può misurare fino a 40 campioni per corsa. Aggiungiamo metionina in lotti. Otto campioni ogni cinque minuti.

In questo modo si garantisce che tutti i campioni vengano misurati tra i 45 e i 50 minuti dopo l'aggiunta di metionina. Incubare le cellule per 45 minuti. Quindi analizza le cellule mediante citometria a flusso, selezionando la dispersione diretta o FS come misura delle dimensioni delle cellule e mappa un'intensità di fluorescenza a flusso da un filtro FITC come misura dell'internalizzazione del carico.

Durante l'incubazione di 45 minuti, utilizzare i pulsanti di scorrimento per regolare la tensione dei canali FS e FITC per ottimizzare il rilevamento in base all'intervallo di dimensioni e all'intensità di fluorescenza delle cellule di lievito utilizzate. Misura la FS e l'intensità della fluorescenza per 10.000 cellule da ciascuna condizione. Utilizzando l'impostazione della velocità di flusso elevata, generare un grafico a dispersione di FS rispetto all'intensità della fluorescenza facendo clic su aggiungi grafico.

Quindi selezionare FITC per l'asse x e FS per l'asse y e rappresentare graficamente 1000 punti. Utilizzando la funzione di gate e la condizione Met di tipo wild, assegnare un gate verticale in modo che circa il 5% delle celle più luminose cada a destra del gate. Utilizzare questo gating per tutte le altre condizioni dell'esperimento.

Come mostrato qui, l'imaging time-lapse delle cellule è stato eseguito a intervalli di cinque minuti in assenza o presenza di metionina per monitorare l'internalizzazione di Mup1 marcata con GFP o fluoro e i cambiamenti nella fluorescenza. Come previsto, la GFP e il Mup1 marcato con fluoro sono rimasti sulla membrana plasmatica in assenza di metionina. Al contrario, le cellule esaminate in presenza di metionina, hanno mostrato una progressiva deplezione del segnale fluorescente dalla superficie cellulare coerente con l'internalizzazione del carico.

Tuttavia, la cinetica della fluorescenza persa in presenza di metionina era ritardata nelle cellule GFP Mup1 rispetto alle cellule Mup1 Mup1. Questi grafici a dispersione confrontano l'intensità della fluorescenza di cellule ENTH1 wild-type o quattro delta in presenza o assenza di metionina dopo l'applicazione di un gate verticale. Il 4% delle cellule Met wild-type era contenuto sul lato destro del cancello, corrispondente alle cellule più luminose della popolazione, mentre il 65% delle cellule wild-type non trattate era contenuto nel cancello.

Al contrario, le quattro cellule delta ENTH1 non hanno mostrato differenze nella distribuzione delle cellule chiare rispetto a quelle deboli, coerenti con un difetto nell'endocitosi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di scaglionare i tempi di inizio dall'esecuzione di esperimenti simultanei, in modo che i dati finali possano essere raccolti dopo lo stesso tempo di trattamento per tutti i campioni.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come gli screening genetici floreali, al fine di rispondere a ulteriori domande, come quali nuovi fattori contribuiscono al traffico vescicolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico vescicolare per esplorare gli aspetti dell'attrito endosomico, nonché un percorso acido e indipendente dalla clatrina recentemente scoperto nel lievito in gemmazione. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i carichi di tipo florent per quantificare gli eventi endocitici nelle cellule viventi.