Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'alloreattività dei linfociti T mediante citometria a flusso con imaging. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'immunologia dei trapianti, ad esempio quale proporzione dei linfociti T del ricevente reagisce agli alloantigeni del donatore. Questa tecnica combina le capacità quantitative multiparametriche della citometria a flusso con le potenzialità di imaging della microscopia fluorescente, consentendo l'analisi ad alto rendimento delle sinapsi tra singole cellule T e cellule presentanti l'antigene.

La procedura sarà dimostrata da Sajad Moshkelgosha, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Iniziare seminando zero virgola cinque per 10 alla sesta cellule dendritiche in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, seguite da uno per 10 alla sesta cellule T e un volume finale fino a 50 microlitri di mezzo di coltura per pozzetto.

Incubare le colture fredde per quattro ore a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica. Successivamente, aggiungere a ogni pozzetto un volume di fissativo pari a tre volte il volume della coltura, costituito da formaldeide all'1,5% in PBS, per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, trasferire le cellule da ogni pozzetto in un tubo di polistirene corrispondente da cinque millilitri.

Incubare le cellule con gli anticorpi coniugati con fluorocromo appropriato in 100 microlitri di buffer di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Successivamente, lavare le cellule in un millilitro di buffer di lavaggio e risospendere i pellet nel buffer di permeabilizzazione/lavaggio contenente fitaleina FITC. Dopo ulteriori 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, lavare le cellule in un millilitro di buffer di permeabilizzazione/lavaggio fresco.

Risospendere i pellet nel colorante nucleare di interesse in tampone di permeabilizzazione/lavaggio per un'incubazione finale di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Lavare le cellule in un millimetro di tampone di permeabilizzazione/lavaggio, seguito da un ulteriore lavaggio in tampone di lavaggio semplice. Quindi, risospendere le cellule in da 50 a 100 microlitri di tampone di lavaggio fresco.

Trasferire le cellule in piccole provette con tappo per microcentrifuga. Per analizzare le interazioni tra cellula e cellula, riservare innanzitutto un canale per l'acquisizione dell'immagine in campo chiaro e caricare la prima provetta di controllo. Con il canale in campo chiaro spento, nella finestra dell'area di lavoro, creare un nuovo grafico a dispersione per ogni canale utilizzato, con il rapporto d'aspetto rispetto all'area.

Selezionare i singoletti in cui il rapporto di aspetto è prossimo a uno. Per ogni fluorocromo, verificare la popolazione positiva e regolare la tensione del laser nella casella di illuminazione, se necessario. Nella casella dei canali, selezionare i canali appropriati per i fluorocromi utilizzati nella colorazione.

Quindi, fare clic su "record". Quando il numero di eventi raggiunge la soglia specificata, l'acquisizione si interromperà automaticamente. Dopo aver acquisito tutti i controlli con colorazione singola, caricare il primo tubo del campione sperimentale e acquisire diverse decine di migliaia di eventi nei canali di analisi appropriati, inclusi il canale in campo chiaro.

Per generare una matrice di compensazione, caricare i file dei dati di controllo con colorazione singola nel wizard di compensazione e selezionare i canali fluorescenti appropriati per l'esperimento. Dopo aver verificato che siano state selezionate le popolazioni positive corrette, fare doppio clic su un valore nella matrice e aggiungere il grafico all'area di analisi per ogni canale. Fare clic su Fine per salvare la matrice di compensazione come file CTM.

Caricare il file RIF nel software di analisi appropriato. Convertire il file RIF in un file DAF per l'analisi dati. Aprire il primo file del campione.

Tracciare la radice quadrata media del tasso di variazione dell'intensità di imaging nel canale in campo chiaro. Successivamente, tracciare il rapporto dimensionale rispetto all'area per il marcatore della cellula presentatrice dell'antigene. Selezionare le coppie contenenti una singola cellula presentatrice dell'antigene.

Tracciare il rapporto dimensionale in funzione dell'area per il marcatore delle cellule T. Effettuare l'ingating sui doppietti contenenti una singola cellula T. Per identificare le cellule a contatto tra loro, utilizzare l'opzione maschere nel menu di analisi per aprire il gestore delle maschere e assegnare alla nuova maschera il nome maschera oggetto cellula T.

Fare clic sul pulsante di funzione e, nella finestra di dialogo, selezionare l'oggetto. Selezionare il canale in cui viene rilevato il marcatore delle cellule T e fare clic su OK. Creare una maschera per il marcatore della cellula presentatrice dell'antigene nel canale appropriato, seguendo lo stesso procedimento. Riportare graficamente l'intensità di fluorescenza del marcatore delle cellule T nella maschera dell'oggetto della cellula presentatrice dell'antigene rispetto all'intensità di fluorescenza della cellula presentatrice dell'antigene nella maschera dell'oggetto della cellula T.

Quindi, tracciare una regione di selezione che includa solo le cellule a contatto tra loro. Infine, esaminare manualmente le immagini di FITC-fallodina degli eventi all'interno di questa regione per distinguere le sinapsi immunitarie mature dai semplici contatti cellulare-cellulare, utilizzando la funzione di marcatura delle immagini per identificare tali immagini. Qui viene mostrata la regione di contatto membranoso per linfociti T positivi per CD4 splenici ottenuti da riceventi tollerizzati e non tollerizzati di allotrapianti cardiaci B6, sette giorni dopo il trapianto, e coincubati con cellule dendritiche derivate dal midollo osseo B6, come illustrato.

Con gli eventi sinaptici e non sinaptici indicati dalle crocette verdi. Le analisi dei canali in campo chiaro e fluorescente permettono inoltre la visualizzazione degli eventi sinaptici e non sinaptici individuali. In effetti, le sinapsi provenienti sia da riceventi CDA non tollerizzati che tollerizzati di cuori B6 si distinguono facilmente dai contatti non sinaptici per la presenza di densi rilievi positivi al FITC all'interfaccia tra cellula T e cellula presentante l'antigene.

Dopo ulteriori sviluppi, questa tecnica potrebbe essere applicata in ambito clinico, ad esempio nella riduzione o sospensione dell'immunosoppressione oppure nella previsione dell'esito del trapianto nei riceventi umani.