Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'alloreattività delle cellule T utilizzando la citometria a flusso di imaging. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunologia dei trapianti, come ad esempio quale percentuale delle cellule T di un ricevente è reattiva agli alloantigeni del donatore. Questa tecnica combina i poteri quantitativi multiparametrici della citometria a flusso con le capacità di imaging della microscopia a fluorescenza per consentire l'esame ad alto rendimento delle sinapsi cellulari presentanti l'antigene delle singole cellule T.

A dimostrare la procedura sarà Sajad Moshkelgosha, un postdoc del mio laboratorio. Inizia seminando il punto zero cinque volte 10 alla sesta cellula dendritica. in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare da 96 pozzetti, seguita da una volta 10 alla sesta cellula T e un volume finale fino a 50 microlitri totali di terreno di coltura per pozzetto.

Incubare le colture fredde per quattro ore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Quindi, aggiungere tre volte il volume di coltura di uno virgola cinque percento di formaldeide in PBS a ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, trasferire le cellule da ciascun pozzetto in una provetta di polistirene da cinque millilitri corrispondente.

Colorare le cellule con gli appropriati anticorpi coniugati al fluorocromo in 100 microlitri di tampone di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Successivamente, lavare le celle in un millilitro di tampone di lavaggio e risospendere i pellet in permanente/tampone di lavaggio contenente falloidina FITC. Dopo altri 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, lavare le cellule in un millilitro di tampone fresco per permanente/lavaggio.

Risospendere i pellet nel colorante nucleare di interesse nel tampone permanente/lavaggio per un'incubazione finale di 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Lavare le celle in un millimetro di permanente/tampone di lavaggio seguito da un lavaggio nel solo tampone di lavaggio. Quindi, risospendere le cellule in 50-100 microlitri di tampone di lavaggio fresco.

Trasferire le cellule in piccole provette da microcentrifuga tappate. Per analizzare le interazioni cellula-cellula, riservare prima un canale per l'acquisizione di immagini in campo chiaro e caricare il primo tubo di controllo. Con il canale campo chiaro disattivato, nella finestra dell'area di lavoro, creare un nuovo grafico a dispersione per ogni canale utilizzato con le proporzioni sull'area.

Incaricare le canottiere dove il rapporto d'aspetto è vicino a uno. Per ogni fluorocromo, controllare la popolazione positiva e regolare la tensione del laser nella scatola di illuminazione, se necessario. Nella casella dei canali, selezionare i canali appropriati per i fluorocromi utilizzati nella colorazione.

Quindi, fai clic su registra. Quando il numero di eventi raggiunge la soglia specificata, l'acquisizione si interromperà automaticamente. Dopo aver acquisito tutti i controlli a colorazione singola, caricare la prima provetta campione sperimentale e acquisire diverse decine di migliaia di eventi nei canali di analisi appropriati, incluso il canale del campo chiaro.

Per generare una matrice di compensazione, caricare i file di dati del singolo colorante nella procedura guidata di compensazione e selezionare i canali fluorescenti appropriati per l'esperimento. Dopo aver verificato che sono state selezionate le popolazioni positive corrette, fare doppio clic su un valore nella matrice e aggiungere il grafico all'area di analisi per ciascun canale. Fare clic su Fine per salvare la matrice di compensazione come file CTM.

Caricare il file RIF nel software di analisi appropriato. Convertire il file RIF in un file DAF di analisi dei dati. Aprire il primo file di esempio.

Tracciare il quadrato medio della radice del tasso di variazione dell'intensità dell'immagine nel canale del campo chiaro. Quindi, traccia il rapporto d'aspetto rispetto all'area per il marcatore cellulare che presenta l'antigene. Inghiare i doppietti contenenti una singola cellula presentante l'antigene.

Traccia le proporzioni rispetto all'area per l'indicatore della cellula T. Inghiare sui doppietti contenenti una singola cellula T. Per identificare le celle in contatto tra loro, nel menu di analisi, utilizzare l'opzione maschere per aprire il gestore maschere e denominare la nuova maschera T cell object mask.

Fare clic sul pulsante funzione e nella finestra di dialogo, selezionare l'oggetto. Selezionare il canale in cui viene rilevato l'indicatore della cella T e fare clic su OK. Creare una maschera per il marcatore cellulare presentante l'antigene nel canale appropriato allo stesso modo. Tracciare l'intensità della fluorescenza del marcatore delle cellule T nella maschera dell'oggetto cellula presentante l'antigene rispetto all'intensità della fluorescenza della cellula presentante l'antigene nella maschera dell'oggetto della cellula T.

Quindi, disegna un cancello che includa solo le celle in contatto tra loro. Infine, rivedere manualmente le immagini FITC della falloidina degli eventi all'interno di questo cancello per distinguere le sinapsi immunitarie mature dai semplici contatti cellula-cellula utilizzando la funzione di tag images per contrassegnare queste immagini. Qui, il cancello di contatto della membrana è mostrato per le cellule T CD4 positive spleniche ottenute da riceventi tollerati e non tollerati di allotrapianti cardiaci B6 sette giorni dopo il trapianto e cocubate con cellule dendritiche derivate dal midollo osseo B6, come dimostrato.

Con gli eventi sinaptici e non sinaptici indicati dal mirino verde. Le analisi dei canali Brighfield e fluorescenti consentono inoltre la visualizzazione dei singoli eventi sinaptici e non sinaptici. Infatti, le sinapsi dei riceventi CDA non tollerati e tollerati di cuori B6 sono facilmente distinguibili dai contatti non sinaptici per la presenza di dense creste positive per FITC all'interfaccia cellulare presentante l'antigene delle cellule T.

Dopo ulteriori sviluppi, questa tecnica potrebbe essere in grado di essere applicata in contesti clinici, come la riduzione o la sospensione dell'immunosoppressione o la previsione dell'esito del trapianto in riceventi di tralpanti umani.