Name: Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Impara a misurare l'alloreattività delle cellule T mediante citometria a flusso con imaging per l'immunologia dei trapianti. Questo metodo ad alto rendimento permette di analizzare le sinapsi immunitarie individuali e predire gli esiti del trapianto.

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SCJ è stato sostenuto da un&#39;International Society for Heart Lung Transplantation Research Fellowship e un Royal College of Physicians e chirurghi del Canada Detweiler Viaggiare Fellowship.SM stato sostenuto in parte da un&#39;International Society for Heart Lung Transplantation Career Development Award (a SCJ). SS è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH è il destinatario di un rene Research Fellowship UK anziano non clinici. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni per AB e KW: un Wellcome Trust Grant Program (082519Z07Z), un British Heart Foundation Grant Program (PG / 10 / 62,28,504 mila), e il programma dell&#39;Unione europea quadro 7 (uno studio; BioDRIM). Gli autori desiderano ringraziare Michael Parsons e il meccanismo di citometria a flusso Nucleo presso l&#39;Istituto di Ricerca Lunenfeld-Tanenbaum, Sinai Health System, Toronto per la fornitura di accesso e il supporto con lo strumento ImageStream Mark X.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cellular+events+in+a+systemic+graft-vs.-host+reaction.+II.+Autoradiographic+estimates+of+the+frequency+of+donor+lymphocytes+which+respond+to+each+Ag-B-determined+antigenic+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex.</a> J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).</li>
<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
<li>Noorchashm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+the+calculation+of+alloreactive+CD4%2B+T+cell+precursor+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency.</a> Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Imaging flusso citometria è stato usato per dimostrare la formazione di sinapsi immune tra cellule T e APC monoclonali o in presenza di superantigeni 24, 25, 26, 27, 28. Questo metodo sfrutta il fatto che dopo un cellule T-APC contatto produttivo, la cellula T cambia la sua citoscheletro actina, polarizzando verso il sito di contatto 21. Questo riarrangiamento non avviene senza segnalazione TCR, ed è quindi un correlato precoce di attivazione delle cellule T 19, 20, 21. Il metodo qui presentato si adatta questo approccio alla misurazione della frequenza alloreattive cellule T in policlonali popolazioni di cellule T. Come tale, essa può in futuro servire come base per lo sviluppo di test per reactivi donatore<html> ty nel trapianto clinica. Anche se i confronti diretti non sono ancora stati fatti, l&#39;individuazione di alloreattive sinapsi immuni sembra avere potere predittivo superiore rispetto alla tradizionale MLR. Ad esempio, lavori precedenti hanno dimostrato che, nel protocollo tolerizing sopra descritto, i risultati di una MLR riescono a correlare in modo affidabile con innesto risultato 2. Un certo numero di saggi sono stati sviluppati per lo stato operativo tolleranza nell&#39;uomo 9, 10, 11, anche se questi non misurano la funzione delle cellule effettrici in risposta a alloantigene. Al contrario, IFNy ELISPOT Saggi funzione 8 misura effettore cellule T ma non può catturare l&#39;intero spettro di secrezione di citochine che possono essere relativo al rigetto del trapianto acuto e cronico, quali IL-17 38,&gt; 39. Il saggio diluizione limitante 4, che è laborioso, e il saggio trans-vivo 6, che richiede i topi, hanno importanti limitazioni pratiche che impedirebbero la loro applicazione in ambito clinico. Recenti miglioramenti sull&#39;analisi di cellule proliferanti utilizzando TCR analisi della sequenza di cellule T che rispondono in MLR possono essere di valore, ma come il saggio qui presentato, richiedono ulteriore validazione in studi clinici 18, 40. Ulteriore sviluppo del test di rilevamento sinapsi immunitaria richiederà che un certo numero di questioni importanti rispondere. In primo luogo, il saggio come sviluppato misura solo alloreattività diretta. La via diretta prevede la presentazione di allogenici complessi MHC / peptide su APC donatore-derivati. Queste ultime sono in genere eliminati rapidamente dopo il trapianto, e l&#39;ulteriore presentazione alloantigene è carricato da APC beneficiari presentano intatta donatore MHC (via semi-diretto) o antigeni donatore trasformati in sé MHC (via indiretta). Il percorso indiretto è un importante fattore di rigetto cronico 33, 41. In linea di principio, dovrebbe essere possibile individuare le sinapsi immuni indiretti da questo test, ma indirettamente alloreattive cellule T hanno una frequenza molto più bassa di quelli diretti 42, 43, il che significa che sarà necessaria l&#39;analisi di un maggior numero di eventi. Una seconda considerazione è che abbiamo testato soltanto questo saggio utilizza cellule T CD4 +, mentre le cellule T CD8 + sono anche una componente importante della risposta anti-donatore. Ancora una volta, dovrebbe essere possibile rilevare sinapsi T CD8 + cellule APC utilizzando questo metodo. Un&#39;altra limitazione è che il metodo richiede l&#39;esame manuale e l&#39;analisi delle immagini cellulari in memb finalecancello contatto rane e stiamo lavorando l&#39;automazione di questa fase. Infine, il metodo richiede sperimentazione e sviluppo in soggetti umani, e sono attualmente in corso studi preliminari con campioni umani. Ulteriori fenotipica sottoinsieme di analisi delle cellule T (vale a dire, effettrici, la memoria, normativo, ecc) in combinazione con il rilevamento di sinapsi del sistema immunitario nei pazienti trapiantati rappresenterebbe un approccio potente per la caratterizzazione del repertorio delle cellule T alloreattive e sarà un focus importante per lavoro futuro.

trapianto di organo solido ha trasformato la cura di pazienti con malattie allo stadio terminale del rene, fegato, cuore e polmoni. A causa di disparità di maggiori e minori antigeni di istocompatibilità, tuttavia, trapianti vengono prontamente respinte da cellule riceventi T se non vengono utilizzati farmaci immunosoppressivi. Questi agenti hanno numerosi effetti collaterali, compresi i rischi per il cancro e la disfunzione d&#39;organo. Un importante obiettivo clinico è quindi quello di ridurre la dose di immunosoppressione al livello minimo necessario per evitare rigetto. Questo livello può variare a seconda del grado di attivazione del sistema immunitario innato; il grado di donatore-ricevente alloantigene disadattamento; e le differenze tra pazienti in funzione immunitaria, farmacocinetica, farmacodinamica e. Purtroppo, i medici trapianto non hanno alcuno strumento per valutare con precisione reattività donatore nei singoli pazienti 1. il mistoreazione leucocitaria (MLR) può rilevare reattività donatore, ma non riesce a prevedere in modo affidabile innesto esito 2, 3. Limitanti saggi di diluizione, ELISPOTs citochine, e il saggio trans-vivo sia misurare una gamma limitata di risposte o non sono pratici segnature 4, 5, 6, 7, 8 profili di espressione .Gene hanno rivelato relative alla tolleranza operativa 9, 10, 11, 12 e rifiuto 13, 14, 15, ma questi non sono sempre generalizzabile nelle popolazioni 16 e può quindi avere un&#39;utilità limitata nei singoli pazienti. analy Sequence-basedses del recettore delle cellule T (TCR) di cellule T nel sangue periferico 17 o proliferando in MLR 18 sono stati anche sviluppati ma richiedono ulteriore convalida. Concettualmente, sarebbe desiderabile avere un saggio che rileva i primi passi necessari a destinatario attivazione delle cellule T da un antigene donatore. Poiché la coltura di cellule più giorni (come nel MLR) può introdurre artefatti, tale test idealmente non richiedono la misurazione di eventi a valle, come proliferazione o funzione effettrice. Ugualmente, tuttavia, sarebbe anche desiderabile per la prova di dipendere qualche elemento della funzione delle cellule T, poiché valutazioni puramente descrittivo (Ad esempio, TCR sequenziamento) potrebbe non essere in grado di distinguere tra cellule T anergic e funzionali. Numerosi studi hanno indicato che il contatto prolungato T-APC è necessaria per la formazione di una sinapsi immunitario, che è un primo fondamentalepasso nella risposta delle cellule T 19, 20, 21, 22. Recentemente abbiamo riportato che, durante dinamica nell&#39;imaging time lapse vitro, circa 5 - 10% di topo cellule T CD4 + formano contatti duraturi con cellule ossee allogeniche derivate dal midollo dendritiche (BMDCs) 23. La frequenza di contatto prolungato è aumentata negli animali che hanno respinto un innesto, mentre in topi precedentemente reso tollerante agli stessi antigeni, rimanendo su livelli osservati nei topi untransplanted 23. Interazioni prolungate sono stati ridotti in presenza di destinatario Tregs e aumentato in loro assenza, e abbiamo osservato fenomeni simili utilizzando cellule umane T e cellule dendritiche derivate da monociti allogeniche (MoDCs) 23. Tuttavia, l&#39;enumerazione di contatti prolungati effettuate in un popolazio policlonale cellule Tn è in termini di tempo e ad alta intensità di manodopera. Abbiamo quindi fatto uso dell&#39;imaging citometria a flusso per esaminare allogenico formazione di sinapsi immunitaria. flusso Imaging incorpora citometria le capacità multiparametriche di acquisizione e analisi dei dati di flusso convenzionale citometria con le capacità di imaging singola cella di microscopia a fluorescenza. Questa tecnica è stata utilizzata da altri ricercatori per studiare la formazione di sinapsi immune dalle cellule T monoclonali 24, 26, 27 o in presenza di superantigeni 28. In questi contesti, tuttavia, la frequenza di cellule T che rispondono varia dal 30-100%, mentre le cellule T alloreattive sono generalmente stimati per rappresentare 5-15% del repertorio totale delle cellule T 29, 30, 31, 32. È importante sottolineare che, abbiamo dimostrato che il flusso di immagini in grado di produrre citometria avery misura comparabile di alloreattive frequenza delle cellule T 23 e che i cambiamenti nella frequenza sinapsi all&#39;interno di una popolazione di cellule T policlonale sono predittivi di innesto 23 risultati. Attualmente, questo approccio è stato ottimizzato per calcolare l&#39;alloreattività diretto delle cellule T CD4 +, ma, in linea di principio, potrebbe anche essere sviluppato per esaminare le cellule T CD8 + e la via indiretta. Alloreattività indiretta si crede di diventare sempre più rilevante in tempi più lunghi post-trapianto 33. Stiamo sviluppando questo metodo per utilizzare cellule umane, che consentirà di testare in pazienti. Così, in futuro, l&#39;approccio generale può essere utile per la valutazione funzionale delle risposte delle cellule T in pazienti trapiantati prima del trapianto; subito dopo il trapianto; e nel lungo termine, quando la droga minimizzazione diventa un obiettivo importante.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Varie</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamenetetraacetico, soluzione 0,5 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Detergente non ionico Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>La</td> soluzione <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td> è composta al <td>37% di formaldeide e quindi deve essere diluita 25 volte per una soluzione all'1,5%</td></tr><tr><td>Filtri cellulari, 70 &; m dimensione dei pori</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di falloidina-fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-amminoattinomicina D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Ricostituire in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-topo coniugato alloficocianina CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo coniugato blu del Pacifico CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Il blu del Pacifico è stato sostituito da eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotinilato anti-topo CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato anti-topo MHC classe II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato anti-topo B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato anti-topo CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato anti-topo CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separatore di cellule magnetiche MidiMACS</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>topo ricombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta umano ricombinante; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>TGF umano&beta; 1 ha attività su cellule di topo</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Citometro a flusso per immagini; dettagli disponibili all'indirizzo http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Download gratuito (registrazione obbligatoria): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare&nbsp;</td><td>Vari</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Vari</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Vari</td><td>Varia</td><td></td></tr></tbody></table>

misura della t cellulare alloreattività utilizzando imaging citometria a flusso

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

La misurazione della reattività immunologica agli antigeni del donatore in pazienti sottoposti a trapianto è probabile che sia di fondamentale importanza per la riduzione di successo o la revoca di immunosoppressione. La reazione mista leucociti (MLR), saggi di diluizione limite, e ipersensibilità test trans-vivo di tipo ritardato (DTH) sono stati tutti applicati a questa domanda, ma questi metodi hanno limitato la capacità predittiva e / o significative limitazioni pratiche che riducono la loro utilità. flusso Imaging citometria è una tecnica che combina i poteri quantitativi multiparametriche di citometria a flusso con le funzionalità di imaging di microscopia a fluorescenza. Recentemente abbiamo utilizzato un approccio citometria di flusso imaging per definire la proporzione di cellule T riceventi capaci di formare sinapsi immuni mature con cellule presentanti l&#39;antigene (APC) donatore. Utilizzando un modello di trapianto di cuore del mouse ben caratterizzato, abbiamo dimostrato che la frequenza delle sinapsi del sistema immunitario in vitro tra T-APC Membreventi contatti ane predetti fortemente esito allotrapianto a rifiuto, la tolleranza, e una situazione in cui il trapianto sopravvivenza dipende cellule T regolatrici indotte. La frequenza dei contatti T-APC aumentato con le cellule T da topi durante rigetto acuto e diminuita con cellule T da topi resi insensibile alla alloantigene. L&#39;aggiunta delle cellule T regolatorie al sistema in vitro ridotto prolungati contatti T-APC. Criticamente, questo effetto è stato osservato anche con policlonale umano espanso, naturalmente linfociti T regolatori, che sono noti per controllare il rigetto di tessuti umani in modelli di topo umanizzato. Ulteriore sviluppo di questo approccio può consentire una caratterizzazione più profonda del vano cellule T alloreattive nei pazienti trapiantati. In futuro, sviluppo e valutazione di questo metodo utilizzando cellule umane possono costituire la base per i saggi utilizzati per selezionare i pazienti per immunosoppressione minimizzazione, e può essere utilizzato per misurare l&#39;impatto di tolerogenic terapie nella clinica.

Questo metodo è stato utilizzato per studiare CD4 + alloreattività cellule T nei topi resi tolleranti a alloantigeni donatori prima eterotopico trapianto allogenico cardiaco. Topi CBA (H-2 k) hanno avuto un protocollo tolerizing costituito da un donatore-specifica (B6, H-2 b) trasfusione di sangue in combinazione con un anticorpo CD4 uno mese non riducono prima di ricevere un trapianto cardiaco B6. Questo protocollo risultati nella sopravvivenza del trapianto a lungo termine che dipende da linfociti T regolatori Foxp3 + 36, 37. Sette giorni dopo il trapianto, splenici cellule T CD4 + sono stati ottenuti da tolleranti e quelli riceventi non controllo tolleranti di allotrapianti cardiaci B6 e sono stati co-incubate con B6 osso DC derivate dal midollo secondo questo protocollo. La figura 2 mostra i dati rappresentativi di questo esperimento. Il cancello contatto membrana è mostrato in figura 2A, con mirino verdi disposti su un evento sinaptica (pannello di sinistra, 1) e su un evento non-sinaptica (pannello di destra). La Figura 2B mostra i canali campo chiaro e fluorescenza di questo evento. Per ridurre i pregiudizi, i dati sono stati analizzati con un osservatore cieco al trattamento assegnato 23. Come mostrato in diversi esempi in figura 3, sia dal non controllo tolleranti (Figura 3A-B) e controllo tolleranti (Figura 3C-D) CBA destinatari dei cuori B6, sinapsi sono facilmente distinguibili dai contatti non-sinaptici dalla presenza di una cresta FITC-positivo denso all&#39;interfaccia T-APC. Questi risultati mostrano che rilevazione visiva delle sinapsi immuni fatte da cellule riceventi T tracce con il grado di alloreattività nel ricevente. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Figura 2. Identificazione di T-APC Doublets con membranaContatto e Formazione Synapse immunitario. Eventi nel cancello doppietto finale (figura 1F) vengono analizzati. A. marcatore delle cellule T di fluorescenza nella maschera oggetto APC è tracciata contro APC marcatore fluorescente nella maschera oggetto DC. Alcuni eventi hanno un doppietto APC e una cellula T senza contatto cellula-cellula e appaiono nell&#39;angolo in basso a sinistra del grafico (immagini non mostrato). Un cancello contatto membrana è pertanto possibile stabilire che include solo doppietti in cui le cellule T e APC sono in contatto. Immagini di ogni evento in questa porta sono rivisti per la prova di actina citoscheletro riarrangiamento nel canale falloidina-FITC e possono essere etichettati utilizzando il software di analisi. Il pannello di sinistra indica un evento sinapsi immune (contrassegnata con 1 e indicato con mirino verdi), mentre il pannello di destra indica un evento contatto membrana senza formazione di sinapsi immune (etichettati 2 ed indicato con reticolo verde). La determinazione della formazione di sinapsi richiede revisione manuale di questiimmagini, mostrato in B. B. La riga superiore mostra campo chiaro e canali di fluorescenza immagini per un doppietto con una sinapsi immune (corrisponde all&#39;evento 1 in A); la fila inferiore mostra un doppietto con contatto membrana ma manca formazione sinapsi (corrisponde all&#39;evento 2 in A). I dati sono stati analizzati in cieco rispetto al trattamento assegnato e sono da un esperimento pubblicato in precedenza 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di T-APC Synapse Formation. Topi CBA ricevuti allotrapianti cardiaci da donatori B6 dopo o senza pre-trattamento (AB) o dopo l&#39;induzione della tolleranza con sangue intero B6 sotto la copertura di un anticorpo anti-CD4 non-ozono ( <st<html> rong&gt; CD). Dopo 7 giorni, splenici cellule T CD4 + sono stati testati per la formazione di sinapsi con DC B6. A. Tre esempi di doppietti non-sinaptici con contatto a membrana da un animale non controllo tolleranti. B. Tre esempi di sinapsi immuni da un animale non controllo tolleranti. C. Tre esempi di doppietti non-sinaptici con contatto a membrana da un animale controllo tolleranti. D. Tre esempi di sinapsi immuni da un animale controllo tolleranti. formazione delle sinapsi è indicato dalla presenza di un brillante, cresta FITC-positivo all&#39;interfaccia T-APC (Ch03). I dati sono stati analizzati in cieco rispetto al trattamento assegnato e sono da un esperimento pubblicato in precedenza 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> AYS &quot;&gt; <tbody><tr><td> Anticorpo / Dye </td><td> fluorocromo </td><td> Canale </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> Ch02 </td><td> 5 ug / mL, titolare empiricamente </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ug / mL, titolare empiricamente </td></tr><tr><td> falloidina </td><td> FITC </td><td> Ch03 </td><td> 0,05 - 0,5 mg / ml </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Gli anticorpi e coloranti utilizzati in questo studio. anticorpi fluorocromo-coniugati, coloranti, fornitori, e le concentrazioni raccomandate sono presentati nella tabella. Il flusso di imaging citometro canale che è stato utilizzato per rilevare ogni fluorocromo è anche mostrato nella tabella.

Questo documento descrive un metodo per misurare alloreattività in una popolazione mista di cellule T usando un flusso di imaging citometria.

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'alloreattività dei linfociti T mediante citometria a flusso con imaging. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'immunologia dei trapianti, ad esempio quale proporzione dei linfociti T del ricevente reagisce agli alloantigeni del donatore. Questa tecnica combina le capacità quantitative multiparametriche della citometria a flusso con le potenzialità di imaging della microscopia fluorescente, consentendo l'analisi ad alto rendimento delle sinapsi tra singole cellule T e cellule presentanti l'antigene.La procedura sarà dimostrata da Sajad Moshkelgosha, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Iniziare seminando zero virgola cinque per 10 alla sesta cellule dendritiche in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, seguite da uno per 10 alla sesta cellule T e un volume finale fino a 50 microlitri di mezzo di coltura per pozzetto.Incubare le colture fredde per quattro ore a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica. Successivamente, aggiungere a ogni pozzetto un volume di fissativo pari a tre volte il volume della coltura, costituito da formaldeide all'1,5% in PBS, per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, trasferire le cellule da ogni pozzetto in un tubo di polistirene corrispondente da cinque millilitri.Incubare le cellule con gli anticorpi coniugati con fluorocromo appropriato in 100 microlitri di buffer di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Successivamente, lavare le cellule in un millilitro di buffer di lavaggio e risospendere i pellet nel buffer di permeabilizzazione/lavaggio contenente fitaleina FITC. Dopo ulteriori 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, lavare le cellule in un millilitro di buffer di permeabilizzazione/lavaggio fresco.Risospendere i pellet nel colorante nucleare di interesse in tampone di permeabilizzazione/lavaggio per un'incubazione finale di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Lavare le cellule in un millimetro di tampone di permeabilizzazione/lavaggio, seguito da un ulteriore lavaggio in tampone di lavaggio semplice. Quindi, risospendere le cellule in da 50 a 100 microlitri di tampone di lavaggio fresco.Trasferire le cellule in piccole provette con tappo per microcentrifuga. Per analizzare le interazioni tra cellula e cellula, riservare innanzitutto un canale per l'acquisizione dell'immagine in campo chiaro e caricare la prima provetta di controllo. Con il canale in campo chiaro spento, nella finestra dell'area di lavoro, creare un nuovo grafico a dispersione per ogni canale utilizzato, con il rapporto d'aspetto rispetto all'area.Selezionare i singoletti in cui il rapporto di aspetto è prossimo a uno. Per ogni fluorocromo, verificare la popolazione positiva e regolare la tensione del laser nella casella di illuminazione, se necessario. Nella casella dei canali, selezionare i canali appropriati per i fluorocromi utilizzati nella colorazione.Quindi, fare clic su "record". Quando il numero di eventi raggiunge la soglia specificata, l'acquisizione si interromperà automaticamente. Dopo aver acquisito tutti i controlli con colorazione singola, caricare il primo tubo del campione sperimentale e acquisire diverse decine di migliaia di eventi nei canali di analisi appropriati, inclusi il canale in campo chiaro.Per generare una matrice di compensazione, caricare i file dei dati di controllo con colorazione singola nel wizard di compensazione e selezionare i canali fluorescenti appropriati per l'esperimento. Dopo aver verificato che siano state selezionate le popolazioni positive corrette, fare doppio clic su un valore nella matrice e aggiungere il grafico all'area di analisi per ogni canale. Fare clic su Fine per salvare la matrice di compensazione come file CTM.Caricare il file RIF nel software di analisi appropriato. Convertire il file RIF in un file DAF per l'analisi dati. Aprire il primo file del campione.Tracciare la radice quadrata media del tasso di variazione dell'intensità di imaging nel canale in campo chiaro. Successivamente, tracciare il rapporto dimensionale rispetto all'area per il marcatore della cellula presentatrice dell'antigene. Selezionare le coppie contenenti una singola cellula presentatrice dell'antigene.Tracciare il rapporto dimensionale in funzione dell'area per il marcatore delle cellule T. Effettuare l'ingating sui doppietti contenenti una singola cellula T. Per identificare le cellule a contatto tra loro, utilizzare l'opzione maschere nel menu di analisi per aprire il gestore delle maschere e assegnare alla nuova maschera il nome maschera oggetto cellula T.Fare clic sul pulsante di funzione e, nella finestra di dialogo, selezionare l'oggetto. Selezionare il canale in cui viene rilevato il marcatore delle cellule T e fare clic su OK. Creare una maschera per il marcatore della cellula presentatrice dell'antigene nel canale appropriato, seguendo lo stesso procedimento. Riportare graficamente l'intensità di fluorescenza del marcatore delle cellule T nella maschera dell'oggetto della cellula presentatrice dell'antigene rispetto all'intensità di fluorescenza della cellula presentatrice dell'antigene nella maschera dell'oggetto della cellula T.Quindi, tracciare una regione di selezione che includa solo le cellule a contatto tra loro. Infine, esaminare manualmente le immagini di FITC-fallodina degli eventi all'interno di questa regione per distinguere le sinapsi immunitarie mature dai semplici contatti cellulare-cellulare, utilizzando la funzione di marcatura delle immagini per identificare tali immagini. Qui viene mostrata la regione di contatto membranoso per linfociti T positivi per CD4 splenici ottenuti da riceventi tollerizzati e non tollerizzati di allotrapianti cardiaci B6, sette giorni dopo il trapianto, e coincubati con cellule dendritiche derivate dal midollo osseo B6, come illustrato.Con gli eventi sinaptici e non sinaptici indicati dalle crocette verdi. Le analisi dei canali in campo chiaro e fluorescente permettono inoltre la visualizzazione degli eventi sinaptici e non sinaptici individuali. In effetti, le sinapsi provenienti sia da riceventi CDA non tollerizzati che tollerizzati di cuori B6 si distinguono facilmente dai contatti non sinaptici per la presenza di densi rilievi positivi al FITC all'interfaccia tra cellula T e cellula presentante l'antigene.Dopo ulteriori sviluppi, questa tecnica potrebbe essere applicata in ambito clinico, ad esempio nella riduzione o sospensione dell'immunosoppressione oppure nella previsione dell'esito del trapianto nei riceventi umani.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo documento descrive una semplice tecnica per indurre alloantigen specifiche anergia nelle cellule mononucleari del sangue periferico. La tecnica può essere applicata clinicamente per generare non alloreactive cellule del donatore. L'infusione di queste cellule potrebbero migliorare la ricostituzione immunitario e ridurre la tossicità dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.

L&#39;induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

Questo video dimostra un metodo per valutare l'alloreattività in popolazioni di cellule T miste osservando le interazioni con le cellule dendritiche portatrici di alloantigene, che portano alla formazione di sinapsi immunologiche. La colorazione differenziale e la quantificazione dei doppietti contenenti sinapsi tramite citometria a flusso rivelano l'alloreattività delle cellule T.

Misurazione dell'alloreattività in una popolazione mista di cellule T

Questo video mostra una tecnica basata sulla citometria a flusso che utilizza due fluorocromi per identificare le cellule T CD4+ e CD8+, le cellule T γδ, le cellule B, le cellule natural killer (NK) e i monociti nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Dopo l'incubazione delle cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro i marcatori di superficie, i sottogruppi cellulari vengono identificati utilizzando una strategia di gating citofluorimetrico ottimale.

Un test di citometria a flusso per identificare sottogruppi di cellule immunitarie nelle cellule mononucleate del sangue periferico

Il video dimostra un metodo immunologico per monitorare in vivo la produzione di linfociti T citotossici indotti da adiuvanti o CTL. A un topo viene pre-iniettato linfociti T CD8+ di donatori geneticamente modificati e colorati con colorante proliferativo. L'iniezione sottocutanea di ovoalbumina con adiuvanti genera linfociti T CD8+ citotossici che vengono identificati dopo il prelievo attraverso l'immunocolorazione e la citometria a flusso.

Una tecnica immunologica per monitorare la generazione di linfociti T citotossici mediati da adiuvanti

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

Descriviamo un protocollo per monitorare la mobilità radiale delle cellule immunitarie non aderenti in vitro utilizzando un collettore/apparato di vetrini per sedimentazione cellulare. La migrazione cellulare viene tracciata su monostrati di cellule tumorali o su proteine della matrice extracellulare. L'esame al microscopio ottico e a fluorescenza consente di osservare la mobilità cellulare e la funzionalità citotossica.

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

Citometria a flusso può essere utilizzato per valutare lo stato della cromatina in cellule T. Questo protocollo permette agli scienziati di interpretare prove di cromatina decondensazione durante l'attivazione delle cellule T dimostrato da un aumento dell'intensità media fluorescenza (MFI) di anticorpi fluorescenti istone H3...

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

L'afflusso di calcio, una misura della segnalazione delle cellule T, è un modo efficace per analizzare le risposte alla stimolazione del recettore delle cellule T. Questo protocollo per il multiplexing di Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare sfrutta le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo.

Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Il presente protocollo descrive un flusso di lavoro sperimentale che consente l'analisi ex vivo della stimolazione di cellule T umane in un sistema di co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate.

Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Impara a misurare l'alloreattività delle cellule T mediante citometria a flusso con imaging per l'immunologia dei trapianti. Questo metodo ad alto rendimento permette di analizzare le sinapsi immunitarie individuali e predire gli esiti del trapianto.

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

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