Visualizzazione e quantificazione del potenziale di differenziazione delle cellule mesenchimali adipogenico con un Marker specifico lignaggio

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la differenziazione delle cellule stromali in linea adipogenica, utilizzando un marcatore proteico specifico per la linea di linea, la proteina legante gli acidi grassi quattro. Ciò si ottiene isolando ed espandendo prima le cellule stromali di interesse. Le cellule stromali vengono quindi raccolte e piastrate in piastre di coltura standard in vitro.

Dopo l'incubazione per alcuni giorni, le cellule vengono trattate con un mezzo di differenziazione adipogenico. Le cellule vengono incubate per 14 giorni, con regolare sostituzione del terreno. Dopo la differenziazione, le cellule vengono fissate e colorate con anticorpi contro la proteina legante gli acidi grassi quattro.

Un microscopio immunofluorescente automatizzato ad alto contenuto viene utilizzato per acquisire immagini delle cellule marcate nelle piastre a micropozzetti. La differenziazione viene quindi quantificata, utilizzando un software specializzato nell'analisi delle immagini. A differenza dei metodi tradizionali di misurazione della differenziazione adipogenica utilizzando coloranti come Oil Red O, il test descritto in questo video utilizza un anticorpo contro la proteina specifica del lignaggio, la proteina legante gli acidi grassi quattro, per confermare la differenziazione adipogenica.

In tal modo, questo metodo quantifica i cambiamenti nell'espressione genica che corrispondono alla differenziazione adipogenica. Questo test è in grado di fornire una grande quantità di informazioni, tra cui la percentuale di cellule differenziate, l'intensità del segnale di fluorescenza per cellula e i cambiamenti nella morfologia cellulare. La capacità di analizzare molteplici caratteristiche consente l'identificazione di potenziali cambiamenti sottili nella differenziazione in risposta a vari trattamenti.

Questo test ha anche un'elevata capacità di through-pull, che lo rende ideale per applicazioni di screening di farmaci ad alto through-pull. Risospendere le cellule in un terreno ASC completo, che è un terreno basale DMEM/F-12, integrato con il 10% di siero fetale bovino, GlutaMAX e antibiotici. Pipettare in una piastra di coltura a 96 pozzetti, a 5000 cellule per pozzetto.

Sono necessari otto pozzetti per ogni donatore. Quattro pozzetti ricevono il mezzo di controllo, mentre il resto riceve il mezzo di differenziazione. Ogni quarto pozzetto di ogni trattamento servirà a un nodo di controllo primario.

Incubare le cellule a 37 gradi, umidificate con una condizione atmosferica del 5% di anidride carbonica per quattro giorni. Questo per consentire alle cellule di crescere fino alla confluenza in ogni pozzetto. Al quarto giorno, togli le piastre dall'incubatrice.

Rimuovere metà del supporto da ciascun pozzetto. Aggiungere un volume uguale di terreno ASC completo, o terreno di differenziazione adipogenico, che è integrato con insulina, isobutilimetilxantina, desametasone e indometasone. Incubare la piastra a 37 gradi, umidificata con una condizione atmosferica del 5% di anidride carbonica.

Il periodo di tempo necessario per una differenziazione sufficiente è di 14 giorni. Durante questo periodo, rifornire i supporti eseguendo il cambio dei supporti ogni due o tre giorni. Dopo la differenziazione, estrarre le piastre dall'incubatrice.

Pipettare con cura tutto il terreno da ciascun pozzetto. Fissare le cellule aggiungendo metanolo ghiacciato. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il metanolo, quindi lavare con soluzione salina tamponata con Tris. Bloccare aggiungendo lo 0,25% di bloccante della caseina. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la caseina, quindi lavare con soluzione salina tamponata Tris. Preparare la miscela di anticorpi primari diluendo 200 volte l'anticorpo anti-FABP4 in tampone di diluizione dell'anticorpo. Aggiungere la miscela a tutti i pozzetti, ad eccezione di quelli riservati come controllo primario del nodo.

Aggiungere invece un tampone di diluizione anticorpale a questi pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare una volta le celle con soluzione fisiologica tamponata con Tris.

Rimuovere, aggiungere soluzione salina fresca tamponata con Tris e incubare per cinque minuti sul bilanciere. Ripeti questo processo due volte. Preparare la seconda miscela di reanticorpi diluendo il secondo reanticorpo Anti-Rabbit Alexa 488 200 volte in tampone di diluizione degli anticorpi.

Aggiungere DAPI, che marcare i nuclei cellulari, a una diluizione finale di uno a 2000. Aggiungere il composto a tutti i pozzetti e avvolgere il piatto con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare le celle con TBS e altri due lavaggi di 15 minuti sul bilanciere. Rimuovere tutto il tampone dai pozzetti e aggiungere un tampone di conservazione, integrato con 0,4 milligrammi per millilitro di thimerosal, per prevenire la crescita batterica. Per l'imaging di questo biotest viene utilizzata una macchina di screening ad alto contenuto dotata di tavolino automatizzato, obiettivi di focalizzazione e filtri.

Verificare che siano presenti i filtri corretti. Pulisci il fondo della piastra per ottenere la migliore qualità. Caricare la piastra nel tavolino con A1 posizionato nell'angolo in alto a sinistra.

Utilizzando la procedura guidata di acquisizione delle lastre, è possibile registrare le informazioni essenziali sull'esperimento, come il numero di targa, l'ingrandimento, la data, le condizioni sperimentali e i dettagli di etichettatura. Selezionare il tipo di piastra per micropozzetti utilizzata. Gli utenti sono in grado di selezionare i pozzi e il numero di siti da acquisire.

Seleziona tutti i pozzetti da fotografare evidenziando la griglia. Sposta il palco nel pozzo più luminoso. La selezione del pozzetto più luminoso garantirà che tutte le immagini vengano acquisite con valori di grigio pixel che si trovano in un intervallo lineare e quindi direttamente proporzionali all'intensità della colorazione.

Se questo passaggio non viene eseguito, le immagini scattate nei pozzetti più luminosi potrebbero essere sovrasaturate. Seleziona le combinazioni di canali, il tempo di esposizione e i parametri di offset Z appropriati per l'esperimento. I filtri utilizzati per l'imaging di FABP4 e DAPI corrispondono alle etichette specifiche utilizzate per visualizzare la colorazione.

Alexa 488, che eccita a 480 nanometri ed emette a 560 nanometri, è stato utilizzato per visualizzare FABP4. E il colorante DAPI, che eccita a 360 nanometri ed emette a 460 nanometri, è stato utilizzato per visualizzare i nuclei cellulari. Per le piastre etichettate con Oil Red O, le goccioline di grasso sono state visualizzate con una luce brillante trasmessa dal carburante.

E anche l'etichetta Oil Red O è stata visualizzata con fluorescenza, poiché eccita a 575 nanometri ed emette a 630 nanometri. Una volta completata l'impostazione, il test biologico è pronto per essere acquisito. L'immagine viene salvata automaticamente sul server online, per consentire un facile accesso remoto alle immagini.

Il set completo di immagini memorizzate sul server online è accessibile utilizzando il programma di desktop remoto. Le immagini possono quindi essere analizzate utilizzando il software MetaXpress. L'applicazione di punteggio delle celle consente agli utenti di selezionare una lunghezza d'onda per rilevare tutti i nuclei in un campo, come DAPI, in questo caso.

Le lunghezze d'onda successive possono essere utilizzate per rilevare un marcatore positivo nel nucleo, nel citoplasma o in entrambe le posizioni cellulari. La proteina legante gli acidi grassi quattro, o FABP4, è un marcatore della linea adipogenica. L'espressione di FABP4 è localizzata nel nucleo e nel citoplasma degli adipociti differenziati.

In questo saggio biologico, analizziamo l'espressione di FABP4, utilizzando il modulo di punteggio cellulare. Innanzitutto, rileva i nuclei cellulari utilizzando il canale DAPI, con parametri definiti dall'utente per le dimensioni e l'intensità del segnale sopra lo sfondo. Rileva il segnale FABP4 utilizzando il canale C del piede e i parametri definiti dall'utente per le dimensioni e l'intensità del segnale sopra lo sfondo.

In questo test biologico, le goccioline di grasso marcate con Oil-Red-O, che fluorescono nell'intervallo di 560 nanometri, sono state analizzate con un modulo di lattine MetaXpress, Transflour. Questo algoritmo di analisi rileva le cellule totali utilizzando nuclei marcati DAPI, che soddisfano i criteri di dimensione e intensità della colorazione specificati dall'utente. L'utente specifica anche le dimensioni e l'intensità delle fosse, che in questo caso rilevano goccioline di grasso in prossimità dei nuclei cellulari.

Le informazioni relative alla dimensione delle goccioline di grasso, all'intensità della colorazione, al numero per cellula, vengono registrate dal test Transflour. È importante notare che l'etichetta Oil Red O è fuoriuscita o si è dissolta da alcune cellule, limitando e confondendo potenzialmente la vera quantità di differenziazione in corso. Immagini rappresentative di cellule di passaggio precoce e tardivo, di controllo e differenziate, marcate con DAPI, una colorazione nucleare e FABP4 sono mostrate insieme alle immagini di fusione e segmentazione.

Le immagini di segmentazione mostrano celle differenziate con una sovrapposizione verde e celle indifferenziate con una sovrapposizione rossa. La percentuale di cellule che esprimono FABP4 è stata utilizzata come misura del potenziale di differenziazione adipogenica. Un aumento significativo delle cellule che esprimono FABP4 è stato osservato con la differenziazione adipogenica nelle cellule di passaggio precoce e tardivo.

Le cellule di passaggio precoce hanno dimostrato un aumento significativamente maggiore della differenziazione rispetto alle cellule di passaggio tardivo. Le immagini rappresentative di DAPI e Oil Red O sono mostrate insieme alle immagini di unione e segmentazione. Le immagini di segmentazione raffigurano tutti i nuclei con una sovrapposizione verde e goccioline lipidiche colorate con olio-rosso-O con una sovrapposizione rossa.

L'area di colorazione Oil Red O per cellula è stata utilizzata come misura del potenziale di differenziazione adipogenica. Con la differenziazione adipogenica è stato osservato un aumento significativo dell'area di colorazione Oil Red O. Le cellule di passaggio precoce hanno mostrato una maggiore area di colorazione Oil Red O per cellula, rispetto alle cellule di passaggio tardivo.

Il western blot è stato eseguito per analizzare il livello di espressione della proteina FABP4 di ASC differenziate a passaggio precoce e tardivo. L'analisi semiquantitativa della densità ottica delle bande FABP4 come rapporto del controllo del carico proteico totale ha mostrato che l'immunomarcatura FABP4 era significativamente aumentata nelle cellule differenziate di passaggio precoce e, in misura minore, nelle cellule differenziate di passaggio tardivo. Guardando questo video, dovresti aver acquisito una comprensione di come differenziare le cellule staminali in linea adipogenica, come eseguire la colorazione con immunofluorescenza utilizzando il marcatore adipogenico specifico del gene, la proteina legante gli acidi grassi quattro e, infine, come visualizzare e analizzare tutte le caratteristiche morfologiche rilevanti delle cellule che sono immunopositive per la proteina legante gli acidi grassi quattro.

Spero che questo video ti sia utile per la tua ricerca.