Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino
May 26th, 2026
Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del >90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.
Lo scopo di questa ricerca è isolare le cellule dal tessuto adiposo in modo efficiente e rapido. La digestione tradizionale richiede costi di tempo e può essere troppo digerita. La nostra misura enzimatica e meccanica offre una dispersione delicata e riduce il tempo di isolamento.
Per cominciare, inserire un pezzo di tessuto adiposo sottocutaneo posteriore di un maiale soppresso in una tetola di coltura. Dissezionare lungo il piano naturale tra il tessuto adiposo e il derma per ottenere un foglio ULB completo spesso due o tre millimetri. Risciacqua l'ULB una volta con soluzione salina sterile gelida.
Dopo aver strappato una ciotola di coltura sterile, pesa il tessuto nella piastra sterile su una bilancia pre-sterilizzata. Per ogni 1,8 grammi di tessuto, aggiungi 10 millilitri di tampone di D-Hank gelato e tieni il tessuto completamente sommerso. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per identificare ed estrarre tutti i vasi sanguigni visibili dal tessuto.
Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e componenti fibrotici. Scartare i materiali estisi in contenitori designati come biohazard. Sciacquare il tessuto all'interno del buffer di D-Hank per rimuovere sangue residuo e detriti.
Pesa il tessuto nella piastra di coltura sterile su una bilancia pre-sterilizzata dopo aver strappato la piastrella. Trasferire 1,8 grammi dei frammenti di tessuto per risciacquo in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Aggiungi 800 microlitri di buffer di dissociazione tissutale di tipo A al tubo.
Usa forbici oftalmiche sterili per tritare il tessuto nel tubo in pezzi di circa uno o due millimetri cubi. Trasferire il tessuto macinato, insieme al tampone circostante, in un nuovo tubo microcentrifuga. Aggiungi 200 microlitri di agente dissociativo tissutale di tipo A alla prova.
Ruota delicatamente e scuoti il tubo a mano tre volte per mescolare il contenuto. Assicurati che i frammenti adiposi siano completamente immersi nella soluzione dissociativa. Controlla se il tappo del tubo è ben chiuso.
Metti il tubo in un bagno metallico a 37 gradi Celsius e incuba per cinque-dieci minuti. Trasferire il tessuto adiposo parzialmente digerito in tampone in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri designato per il sistema di dissociazione meccanica. Esegui il programma preimpostato per il tessuto adiposo per eseguire la dissociazione meccanica usando un'onda sinusoidale da 200 hertz.
Raccogli la sospensione della cella e passala attraverso un filtro per celle da 200 micrometri in un nuovo tubo centrifuga da 50 millilitri. Aggiungi cinque millilitri di soluzione D-Hank pre-raffreddata a quattro gradi Celsius al colino. Sciacquare il colino due volte con la soluzione D-Hank.
Centrifuga la sospensione a celle filtrate a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Usa una pipetta pasteur sterile per aspirare e scartare lo strato lipidico soprantante, lasciando un millilitro di tampone per proteggere lo strato di adipociti. Raccogliere il secondo strato contenente gli adipociti senza disturbare il terzo e il quarto strato.
Aspira e scarta il terzo strato. Aggiungi un millilitro di buffer di D.Hank al pellet inferiore contenente la frazione vascolare stromica o SVF. Risospendere delicatamente il pellet cellulare nel tampone per raggiungere una concentrazione cellulare da due a cinque volte dieci, alla potenza di sei celle per millilitro.
Prepara la sospensione della cella SVF in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Tieni la sospensione sul ghiaccio fino all'uso. Aggiungere 10 microlitri di sospensione a celle SVF e 10 microlitri di soluzione blu di tripan allo 0,4% in un tubo microcentrifuga sterile da 0,5 millilitri da 0,5 millilitri.
Pipetta delicatamente su e giù tre volte. Trasferire 10 microlitri della miscela di cellule colorate su un vetrino di conteggio, adatto al contatore automatico delle cellule. Verifica che il campione riempia completamente la camera senza traboccare.
Inserisci la slide di conteggio nel contatore automatico delle celle. Seleziona il tipo di saggio tripan blu e regola l'intervallo di concentrazione cellulare se necessario. Premi conteggio per avviare il conteggio automatico delle celle.
Monitorare le immagini della camera di conteggio e osservare la distinzione automatica tra cellule vive e morte. Registra la percentuale di vitalità delle celle e il numero totale di celle vitali visualizzate sullo schermo dello strumento. Esegui tre misurazioni indipendenti per ciascun campione.
Calcola la vitalità media e la resa cellulare per grammo di tessuto adiposo. Prepara una soluzione di colorazione con cinque microgrammi per millilitro sbucciato e un micromolare BODIPY in D.Hank's. Incubare gli adipociti isolati nella soluzione di colorazione per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Utilizzare un sistema di vetro per vetrata adatto agli adipociti adatto a portavetri per preparazioni adatte alla microscopia a fluorescenza. Il sistema di montaggio adatto agli adipociti ha permesso una distribuzione uniforme degli adipociti intatti per un'imaging chiaro. A differenza dei metodi tradizionali che producevano disposizioni affollate e multistrati, gli adipociti estratti mostravano una struttura intatta e una morfologia normale.
Il tasso di sopravvivenza degli adipociti ottenuto con il metodo di dissociazione meccanica è stato significativamente più alto rispetto al metodo tradizionale di idrolisi enzimatica. Le cellule staminali derivate da l'adiposo purificate e coltivate presentavano una morfologia uniforme simile a quella di un fibroblasto, con cellule allungate a forma di fuso disposte in modo ordinato. La maggior parte delle cellule rimase non colorata, indicando la vitalità, mentre solo una piccola parte colorava di blu, rappresentando cellule morte.
Questo protocollo consente ai ricercatori di confrontare i caratteri cellulari isolati tra i depositi adiposi. Le SVF isolate dal protocollo possono essere utilizzate per la costruzione di organoidi e la purificazione delle cellule staminali adipose. Studi futuri potrebbero ottimizzare ulteriormente il metodo di isolamento, considerando le variazioni del tessuto adiposo nella matrice extracellulare attraverso il deposito.
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Overview
This article presents a rapid and efficient protocol for isolating adipose-derived stem cells (ADSCs) from adipose tissue using a combination of enzymatic digestion and mechanical wave-based dissociation. The method, exemplified by the SoniConvert system, significantly reduces processing time, improves cell viability, and yields high-quality single-cell suspensions suitable for downstream applications in regenerative medicine and research.
Key Study Components
Area of Science
- Regenerative medicine
- Cell biology
- Stem cell isolation
Background
- ADSCs are valuable for tissue repair, disease modeling, and cell therapy due to their multipotency and immunomodulatory properties.
- Traditional isolation methods are time-consuming (1–3 hours), yield low cell viability (<70%), and suffer from batch variability.
- Efficient, reproducible isolation of high-viability ADSCs is critical for research and clinical translation.
- Mechanical wave-based dissociation offers a potential solution to these limitations.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a rapid, gentle, and reproducible protocol for isolating ADSCs from adipose tissue.
- To compare the new method's efficiency and cell viability with traditional enzymatic digestion protocols.
- To provide a platform compatible with various downstream applications, including organoid construction and cell culture.
Methods Used
- Harvesting and preparation of subcutaneous adipose tissue from euthanized pigs.
- Enzymatic digestion using a tissue-specific dissociation buffer and agent.
- Mechanical dissociation via a preset program using a 200 Hz sinusoidal wave (SoniConvert system).
- Filtration, centrifugation, and separation of stromal vascular fraction (SVF) and adipocytes.
- Cell viability assessment using trypan blue staining and automated cell counting.
- Fluorescence staining and microscopy to assess adipocyte morphology and integrity.
Main Results
- The core isolation process is completed in approximately 30 minutes, representing a >90% reduction in processing time compared to conventional methods.
- Cell viability of isolated ADSCs is 80–95%, significantly higher than traditional protocols.
- The method yields intact, morphologically normal adipocytes and uniform, viable ADSCs.
- Single-cell suspensions are suitable for primary culture, flow cytometry, cytotoxicity assays, and organoid construction.
Conclusions
- The combined enzymatic and mechanical wave-based protocol enables rapid, high-viability isolation of ADSCs.
- This approach reduces variability and preserves cell integrity, facilitating adipose tissue research and clinical applications.
- Future optimization may further improve isolation efficiency across different adipose depots.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Porcine Adipose Tissue Harvesting and Preparation
1:36
Dissociation of Adipose Tissue for Cell Isolation
3:08
Isolation of Adipocyte and Stromal Vascular Fractions (SVF)
4:21
Analysis of SVF Cell Suspension and Adipocyte Samples
6:16
Results
7:23
Conclusion
