Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Vi presentiamo un protocollo per studiare i biomarcatori di espressione di mRNA di cellule derivanti dal periostio (PDC) indotte da vitamina C (vitamina C) e 1,25-diidrossi-vitamina D [1,25₂D-₃]. Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC.

L'obiettivo generale di questo studio è quello di studiare gli effetti osteoinduttivi della vitamina D sulle cellule staminali mesenchimali in coltura che sono state raccolte dal periostio alveolare dentale. L'uso di cellule staminali mesenchimali è un grande progresso in odontoiatria nell'ultimo decennio. Sono stati isolati e coltivati con successo da molte parti del tessuto dentale.

L'obiettivo è quello di isolare e coltivare cellule staminali mesenchimali dal periostio alveolare e di studiare il potenziale osteoinduttivo del composto di vitamina D. In generale, gli individui nuovi a questa materia avranno difficoltà a causa della nuova idea della formazione ossea nelle cellule staminali mesenchimali derivate dal periostio alveolare. La dimostrazione della procedura del personale di laboratorio sarà la signorina Hsin-Wen Chi.She

è un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, prelevare i tessuti periostali dai pazienti durante la chirurgia dentale utilizzando un separatore periostale. Raccogli fette di circa due per cinque millimetri.

Conservare le fette di tessuto in DPBS con antibiotici. In laboratorio, utilizzare un bisturi per tritare accuratamente i frammenti di tessuto periostale alveolare entro 24 ore dalla raccolta. Successivamente, coltivare il tessuto su piastre di Petri da 35 millimetri nel terreno di coltura appropriato.

Utilizzare un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Tre giorni dopo, scartare i tessuti periostali raccolti e cambiare il terreno. Quando le cellule sono proliferate a circa l'80% di confluenza, staccare le cellule coltivate aggiungendo tripsina.

E incubando la coltura per tre minuti. Successivamente, aggiungere 0,8 millilitri di terreno per terminare il distacco. Dopo la raccolta e il conteggio, distribuire 5.000 cellule in un millilitro per piastra.

Contrassegnare le celle placcate come passaggio uno in questa fase. Coltiva queste cellule e separale di nuovo dopo che hanno proliferato fino all'80% di confluenza. Il mezzo con passaggio uno è inizialmente di colore arancio/rosso.

Quando il mezzo inizia a diventare arancione tre giorni dopo, cambialo. Quando le celle di passaggio uno raggiungono l'80% di confluenza, creare le celle dalla seconda alla quinta generazione ripetendo le stesse procedure utilizzate per preparare la generazione zero alla prima generazione. Cambia il mezzo due volte a settimana.

Quattro settimane dopo, valutare il potenziale delle cellule di differenziarsi in un lignaggio osteogenico osservando la morfologia delle cellule al microscopio. Staminali le cellule utilizzando un saggio di von Kossa. Questo test distingue la presenza di depositi calcificati nella coltura.

Lavare le cellule con PBS e fissarle per 30 minuti in un millilitro di formalina al 10%. Successivamente, rimuovere la formalina e quindi lavare le cellule e trattarle con nitrato d'argento al 5%. Esporre le cellule alla luce UV per un'ora.

Quindi, rimuovere il nitrato d'argento e trattare le cellule con due millilitri di solfato di sodio al 5% quattro volte per tre minuti ogni volta. Sostituire la soluzione tra un trattamento e l'altro. Infine, lavare le celle due volte utilizzando acqua distillata.

20 dei 34 campioni di tessuto periostale hanno prodotto con successo colonie di cellule staminali derivate dal midollo. Non è stato riscontrato alcun fattore in relazione ai donatori che influenzi in modo significativo il successo della coltura. Inizialmente, le PDC formavano colonie e ammassi sferici con un mix di cellule rotonde e a forma di fuso.

Dopo il primo passaggio, le cellule erano omogeneamente simili a fibroblasti con una forma a fuso. Al termine del differenziamento osteogenico, il saggio di von Kossa ha indicato la possibile presenza di depositi di calcio e differenziamento osteogenico. Questi risultati indicano fortemente che tra le popolazioni di cellule periostali, le cellule progenitrici possiedono il potenziale per differenziarsi in cellule osteogeniche.

Le cellule precursori osteogeniche sono state anche trattate con calcitriolo ed esaminate utilizzando RTPCR per valutare il livello di espressione della fosfatasi alcalina, che è un forte indicatore della differenziazione osteogenica precoce delle cellule. Sia il trattamento della vitamina C che del calcitriolo, un metabolita attivo della vitamina D, hanno aumentato l'espressione della fosfatasi alcalina. Inoltre, l'espressione dei livelli di mRNA del collagene uno è aumentata in risposta agli stessi trattamenti.

È stato riscontrato che l'espressione dell'mRNA della sialoproteina ossea aumenta per le cellule trattate con una concentrazione più elevata di calcitriolo. Tuttavia, il CBFA one e l'espressione dell'mRNA ostocalcico non hanno risposto ai trattamenti. Dopo aver visto questo video, il pubblico dovrebbe avere una buona comprensione della mineralizzazione e del protocollo di coltura del periostio alveolare umano.

Una volta padroneggiata, questa ricerca può essere eseguita in quattro o cinque settimane se eseguita correttamente. Quando si tenta questo esperimento, è importante utilizzare una tecnica attenta e sterile per evitare la contaminazione della cellula.