Name: Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule staminali mesenchimali dal periostio alveolare umano e gli effetti osteoinduttivi della vitamina D sulla differenziazione osteogenica. Questo metodo supporta la rigenerazione dentale.

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Il protocollo di studio è stato approvato da Institutional Review Board per clinica ricerca di Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B e C 103-4223). Questo studio è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Questo manoscritto è stato modificato da Wallace accademico Editing.

Il protocollo di studio è stato approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital. Tutti i partecipanti fornito il consenso informato scritto.
1. tessuto preparazione
<ol><li>Raccogliere i tessuti periosteal dai pazienti durante la chirurgia dentale (Figura 1). Dopo la riflessione di falda in anestesia locale, prendere un pezzo di tessuto del periostio dall'osso alveolare utilizzando un separatore periosteal31.</li>
	<li>Dopo la raccolta, è possibile memorizzare le fette di tessuti periosteal di circa 5 x 2 mm in una soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) con 300 U/mL di penicillina e 300 mg/mL di streptomicina. Trasferire i tessuti al laboratorio entro 24 h.</li>
	<li>Tritare i frammenti di tessuto periostale alveolare con bisturi fino a ben tritata e mantenere i campioni in mezzo passaggio 0 (composto di 300 U/mL di penicillina e 300 mg/mL di streptomicina, α-MEM e 5% di siero fetale bovino [FB]) coltivate in un incubatore a 37 ° C con aria umidificata (5% anidride carbonica). Nell'incubatrice, preparare una bacinella di acqua per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Modificare il mezzo dopo 3 giorni e due volte alla settimana da allora in poi.</li>
	<li>Quando le cellule hanno raggiunto subconfluence (80%), rilasciare le cellule aderenti con 200 µ l di 0,25% tripsina nell'incubatrice (37 ° C) per 3 minuti e quindi utilizzare 4,5 mL di medium per terminare la reazione.</li>
	<li>Piastra le cellule ancora in fresco passaggio 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Piastra è 5 × 103 celle (a partire da un emocitometro).</li>
	<li>Eseguire ogni passaggio successivo dopo che le cellule di raggiungere 80% confluenza31. Nota: All'inizio, il mezzo sarà rosso arancio. Dopo circa tre giorni, il colore medio deve cambiare ad una tonalità giallastra. Il tempo di raddoppiamento delle cellule è di circa 30 – 40 h, che necessitano di 7 giorni per 3 – 5 generazioni.</li>
	<li>Cultura il PDC isolato in α-MEM supplementato con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina in un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2).</li>
	<li>Osservare la crescita delle cellule di tutti i giorni e sostituire il mezzo di crescita due volte a settimana. Utilizzare per quinto-celle di terza generazione per tutte le ulteriori esperimenti.</li>
</ol>2. flusso Cytometry
<ol><li>Raccogli 1 × 106 cellule tramite digestione della tripsina:<ol>
<li>Aggiungere 200 µ l di 0,25% tripsina. Dopo 3 min, utilizzare 4,5 mL di mezzo di coltura contenente FBS per terminare la reazione di tripsina e raccogliere attraverso centrifugazione (1500 giri/min, 5 min, 22 ° C).</li>
		<li>Lavare il pellet cellulare tre volte con 1 x DPBS. Risospendere le cellule in 200 µ l 1x buffer di permeabilizzazione. Contare le celle con un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esaminare gli indicatori di superficie espressi espressi di PDC tramite flusso cytometry (ordinamento di fluorescenza-attivato delle cellule)32. Utilizzare anticorpi monoclonali (MAb) contro CD19 (isotiocianato di fluorescina (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) e HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>Aggiungere gli anticorpi per i campioni e la cultura al buio a 4 ° C per 30 min.</li>
		<li>Lavare le cellule con 1 x DPBS tre volte.</li>
		<li>Fissare le celle utilizzando 2% di formaldeide e procedere con analisi di flusso cytometry32.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. allegato e vitalità con osteogenica, adipogenico e differenziazione Chondrogenic delle cellule
Indurre la differenziazione nelle cellule in osteogenica, adipogenico e lignaggi condrogenica coltivando le cellule periosteal in tutti i tre passaggi su sei pozzetti con media di differenziazione specifica.
<ol><li>Per la differenziazione osteogenica, coltura le cellule in α-MEM ad una densità di 5000 cellule per pozzetto su piastre di coltura di sei-pozzo.<ol>
<li>Al raggiungimento di 80% confluenza, coltura le cellule nei media contenente α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10− 7 M desametasone (0,1 mM) e 5 mL di acido ascorbico (100 uM). Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Modificare i media due volte a settimana.</li>
		<li>Dopo 4 settimane, valutare il potenziale delle cellule di differenziarsi in una linea osteogenica macchiando le cellule usando un'analisi di von Kossa, che contraddistingue la presenza di depositi calcificati in una cultura33.<ol>
<li>Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 minuti, aggiungere il 5% di nitrato di argento e trattare sotto luce ultravioletta (UV) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
			<li>Aggiungere 5% Na2così4 quattro volte, permettendo 3 min per ogni reazione. Infine, lavare le cellule due volte con acqua distillata. Nota: Von Kossa macchiatura è una reazione di precipitazione dove gli ioni d'argento e fosfato reagiscono in presenza di materiale siliceo; Questa tecnica di colorazione non è specifica per il calcio. In questo studio, quando le cellule studiate sono state trattate con soluzione di nitrato d'argento, calcio — che è ridotto da luce UV forte — è stato sostituito da argento, che è diventato visibile come argento metallizzato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per differenziazione adipogenico, coltura le cellule ad una densità di 5000 cellule per pozzetto su piastre di coltura sei pozzetti contenenti α-MEM.<ol>
<li>Al raggiungimento di 80% confluenza, coltura le cellule nei media contenente α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1%, penicillina, 10− 6 M desametasone (1 mM), insulina (5 mg/mL) e l'indometacina (60 mM).</li>
		<li>Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Dopo 6 – 9 settimane, utilizzare olio rosso O per macchiare le cellule ed evidenziare gocce lipidiche, determinando la presenza di adipogenico differenziazione33:<ol>
<li>Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 min, macchia le cellule con 0,5% olio rosso O a temperatura ambiente per 10 minuti e poi lavare le cellule tre volte con 60% isopropanolo per 3 minuti ogni volta; Infine, lavare le cellule con acqua distillata. Nota: Olio rosso O è un lysochrome (liposolubili) diazo colorante utilizzato per la colorazione dei lipidi neutri, principalmente esteri di triacilglicerolo, lipoproteine e colesterolo. Il colorante si dissolve nelle goccioline del lipido nella cella, colore rosso di rotazione le goccioline del lipido.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la differenziazione dei condrociti, cellule di coltura su piastre di coltura sei pozzetti con ciascuna contenente ben 5000 cellule.<ol>
<li>Aggiungere una media di differenziazione contenente α-MEM, 5% FBS, 10− 7 M desametasone (0,1 mM), piruvato di sodio (100 µ g/mL), insulina-transferrina-selenio-A (1 × ITS), fattore di crescita trasformante-β (10 ng/mL) e 5 mL di acido ascorbico (100 µM).</li>
		<li>Cultura del controllo negativo in media composto da α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Dopo 4-5 settimane, utilizzare Alcian blu colorazione per evidenziare i polisaccaridi acidi, come glicosaminoglicani o alcuni tipi di mucopolisaccaridi, nella cartilagine delle celle per determinare la presenza di condrociti differenziazione33.<ol>
<li>Aggiungere formalina al 10% per il fissaggio. Entro 30 min, aggiungere acido acetico al 3% e 2 minuti per la reazione. Successivamente, lavare con acqua distillata tre volte, aggiungere 1% Alcian blu 8GX incubate per 30 min e poi lavare con acqua distillata. Infine, aggiungere acido acetico al 3% e lavare per 3 minuti e poi lavare con acqua distillata per finire. Nota: Le parti della cella che macchia specificamente di questo colorante diventano blu a blu-verde dopo la macchiatura e sono chiamate "alcianophilic."</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. effetti di 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-2D3) sull'osteogenesi
<ol><li>Dividere il P3 a P5 PDC in sei gruppi e cultura su piastre da 6 pozzetti con vari terreni di coltura:</li>
	<li>gruppo negativo (α-MEM e 5% FBS);</li>
	<li>Gruppo vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C);</li>
	<li>e 10− 7 M 1,252D3 gruppo (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 10− 7 M 1,252D-3).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno a un incubatore (37 ° C) in ciascun pozzetto e modificare il mezzo due volte ogni settimana.</li>
</ol>5. invertire la trascrizione/quantitativa reazione a catena della polimerasi in tempo reale
<ol><li>Dopo 7 d di differenziazione degli osteoblasti, isolare il RNA totale sul ghiaccio utilizzando un reagente commerciale (Vedi Tabella materiali):<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento in ciascun pozzetto. Aggiungere 200 µ l di bromochloropropane e lasciare per 10 min generare RNA a strati e poi Centrifugare a 10.000 rpm per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, aggiungere 500 µ l di 2-propanolo a 500 µ l del supernatante contenente RNA. Precipiti il RNA sul ghiaccio e consentire 15 min per la reazione.</li>
		<li>Dopo la procedura, centrifugare a 12.000 rpm per 15 min a 4 ° C, dopo di che il RNA si trova nella parte inferiore del tubo. Successivamente, rimuovere il surnatante con 1 mL di alcool di 75% per lavaggio e centrifugare a 7.500 giri/min per 8 min a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e utilizzare un concentratore a vuoto per produrre RNA dal fondo del liquido. Recuperare con acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retromarcia trascrivere il RNA (1 μg) usando il transcriptase myeloblastosis aviaria virus. Impostare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per l'esecuzione a 25 ° C per 10 min seguita da 50 ° C per 60 minuti e poi 85 ° C per 5 min, prima infine di mantenere a 4 ° C.</li>
	<li>Sintetizzare il primo filo DNA complementare (cDNA). Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) utilizzando 5 μL di 01:10 diluito del cDNA. Condotta di RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) utilizzando primers per ALP, BSP, OCN, CBFA1 e collagene-1. Nota: Per evitare la contaminazione del DNA dai segnali, le sequenze di andata e d'inversione di ogni primer sono state progettate su distinti esoni.</li>
	<li>Eseguire qPCR utilizzando un commerciale PCR Master Mix (Vedi Tabella materiali) in conformità con le istruzioni del produttore. Impostare il termociclatore a 50 ° C per 2 min seguita da 95 ° C per 10 min e poi 40 cicli ciascuno a 95 ° C per 15 s seguita da 60 ° C per 60 s. Nota: Il protocollo SYBR richiede inoltre una fase di curva di fusione, che viene eseguita a 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 60 s e poi 95 ° C per 15 s.</li>
	<li>Normalizzare i valori di soglia del ciclo per ALP, BSP, CBFA1, collagene-1 e OCN a quella del gene housekeeping GAPDH. 34
</li>
	<li>Coppie di primer sono elencate nella Tabella materiali.</li>
</ol>6. attività della fosfatasi alcalina
<ol><li>Valutare l'attività enzimatica ALP di celle utilizzando la tecnica precedentemente descritta35, che converte p- nitrofenil fosfato di p- nitrofenolo; p- nitrofenil fosfato è un substrato fosfatasi che diventa giallo quando defosforilata di ALP, come determinato alla lunghezza d'onda di 405 nm. Normalizzare il totale p- nitrofenolo formato basato sulla proteina totale come determinata mediante l'analisi di Bradford.</li>
	<li>Confrontare le attività ALP del controllo (α-MEM, 5% FBS), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM, 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C), 1,25-2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM e 10− 7 M desametasone + 10− 8 M 1,252D-3) e vitamina C + 1,252D-3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato di 10 mM, 10− 7 M desametasone + 100 uM vitamina C +1,25-(OH)2D3) gruppi dopo 1, 2, 3 e 4 settimana della cultura.</li>
	<li>Eseguire una procedura di estrazione di proteine su ghiaccio:<ol>
<li>Raschiare le cellule dalle piastre 6 pozzetti e aggiungere 50 µ l di tampone di lisi. Successivamente, inserire le celle sul ghiaccio per 30 min distruggere le cellule e liberare la proteina.</li>
		<li>Dopo 30 min, centrifugare a 13000 rpm a 4 ° C per 15 min. Dopo la centrifugazione, estrarre il surnatante per deposito e utilizzare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Una modalità terapeutica sviluppata di recente, vale a dire che comportano MSCs, di ingegneria tissutale ha numerosi vantaggi. MSC, che sono presenti in diversi tipi di tessuto, sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in una varietà di tessuti mesodermal funzionale cellule37 e altre cellule quali osteoblasti.
Il periostio serve come una nicchia per cellule progenitrici e come un rifornimento ricco sistema vascolare per l'osso che avvolge38...

Anche se negli ultimi anni sono state sviluppate numerose tecniche pertinenti, osso resti ricostruzione limitata da vincoli multipli e stimare che l'entità della ricostruzione necessaria è spesso impossibile. L'incremento dei tessuti duri è necessaria per raggiungere obiettivi sia estetici che funzionali, oltre a un tasso di successo a lungo termine favorevole. Metodi comunemente usati per tali procedure includono l'innesto dell'osso autologo e allogenico trapianto xenogenico e l'innesto dell'osso di alloplastic. Tra i vari tipi di innesto osseo, innesti di osso autologo sono considerati il più efficace. Tuttavia, la morbilità del sito donatore, vascolarizzazione compromessa e tessuto limitata disponibilità1 sono stati gravi inconvenienti per l'innesto di osso autologo. Inoltre, gli innesti dell'osso allogenico e gli xenotrapianti sono stati associati con la trasmissione della malattia. Attualmente, gli innesti di osso sintetico sono ampiamente utilizzati per risolvere questi problemi. Tuttavia, con la loro mancanza di potenziale osteogenico, i risultati clinici hanno variato ampiamente. Materiali quali cellulosa sono associati con fluttuazione di volume, infezione e una mancanza di forza.
Aumento osseo mediante ingegneria tissutale ha suscitato notevole interesse. In questa tecnica, cellule staminali mesenchimali (MSCs) vengono inizialmente utilizzate per promuovere la differenziazione degli osteoblasti, che sono poi trapiantati al sito di perdita dell'osso per ottenere riparazione ossea. Questa procedura è attualmente applicata nella terapia cellulare. Raggiungimento di ricostruzione ossea tramite l'estrazione di una quantità limitata di tessuto è più semplice e meno invasivo rispetto ad altri metodi.
Il ruolo potenziale di cellule staminali mesenchimali come uno strumento per le terapie basate sulle cellule mirate alla rigenerazione dentale è un crescente interesse tra i vari gruppi di ricerca. Gli studi hanno confermato che MSCs possono essere differenziati dai seguenti tipi di tessuto: midollo osseo, membrana sinoviale, adiposa, Pericita, trabecular dell'osso, del cordone ombelicale umano e tessuti dentali2,3. Fonti comuni di MSCs includono del midollo osseo, tessuto adiposo e tessuti dentali. Rispetto con MSCs derivate dal tessuto adiposo e midollo osseo, i vantaggi delle cellule staminali dentali sono di facile accessibilità e meno morbosità dopo la raccolta. Confrontato con le cellule staminali embrionali, MSCs derivate da tessuto dentale appaiono nonimmunogenic e non sono associati a preoccupazioni di ordine etico complesso3.
Nel 2006, l'International Society for Cellular Therapy consigliato utilizzando i seguenti standard per identificare MSCs: in primo luogo, è necessario che i MSCs sia in grado di associare alla plastica. In secondo luogo, è necessario che MSCs sia positiva per gli antigeni di superficie CD105, CD73 e CD90 e negativo per i marcatori per i monociti, macrofagi e cellule di B oltre alla ematopoietici antigeni CD45 e CD344. Come criterio finale, MSCs deve essere in grado di differenziarsi nei seguenti tre tipi di cellule in condizioni standard di differenziazione in vitro : osteoblasti, adipociti e condrociti4. Fin qui, sei tipi di cellule staminali dentali umane sono stati isolati e caratterizzati. Il primo tipo è stato isolato dal tessuto umano della polpa e definito di cellule staminali della polpa dentale postnatale5. Successivamente, ulteriori tre tipi di MSCs dentale sono stati isolati e caratterizzati: cellule staminali da denti decidui esfoliate6, il legamento parodontale7e la papilla apicale8. Più recentemente, derivato dal follicolo dentale9, gengivale tessuto-derivato10, germe dentale staminali cells(DBSCs)11e ciste periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 inoltre sono stati identificati.
Friedenstein fu il primo a definire MSCs13. MSCs esibiscono un'alta potenziale di proliferazione e può essere manipolato per differenziare prima di essere trapiantate, il che suggerisce che sono candidati ideali per procedure rigenerative10.
Anche se la maggior parte degli studi hanno utilizzato midollo osseo come fonte di cellule staminali, cellule derivanti dal periostio (PDC) sono stati anche recentemente utilizzata la dimensione14. Il periostio è più facilmente accessibile del è il midollo osseo. Pertanto, in questa tecnica, utilizziamo periostio alveolare per eliminare la necessità di ulteriori incisioni durante l'intervento chirurgico e per ridurre la morbosità postsurgical in pazienti. Il periostio è il tessuto connettivo che forma il rivestimento esterno delle ossa lunghe e comprende due strati distinti: lo strato fibroso esterno composto da fibroblasti, collagene e fibre elastiche15e lo strato interno cellula-ricco cambiale a diretto contatto con la superficie dell'osso. Lo strato cambiale contiene una popolazione di cellule miste, soprattutto fibroblasti16, osteoblasti17, periciti18e una sottopopolazione critica identificati come MSCs19,20,21. Maggior parte degli studi hanno segnalato che PDC sono paragonabili, se non superiore, a cellule staminali derivate da midollo osseo (BMSC) in osso guarigione e rigenerazione22,23,24. Il periostio è facilmente accessibile ed esibisce eccellente efficacia rigenerativa. Tuttavia, pochi studi hanno messo a fuoco il periostio25,26,27.
Per quanto riguarda la riparazione ossea, l'attuale pratica clinica coinvolge il trapianto di cellule progenitrici periosteal amplificato all'interno di impalcature di sostegno. Recenti studi hanno messo a fuoco su acquisizione di cellule staminali nelle regioni difettose e che impiegano cellule progenitrici per tessuto rigenerazione20. Dentisti anche anticipano la futura applicazione di rigenerazione ossea parodontale in trattamenti parodontali e impianti dentali. Per quanto riguarda il sito donatore, il periostio può essere facilmente raccolto dai chirurghi dentali generali. Ciò paragona favorevole contro le cellule stromali del midollo, come il periostio può accedervi durante intervento chirurgico orale di routine. Così, l'obiettivo di questo studio è di stabilire un protocollo per la raccolta del PDC e di valutare la morfologia, attaccamento, vitalità e proliferazione di cellule staminali umane periostio.
I metaboliti della vitamina D influenzano l'equilibrio dinamico in vivo minerale ossea. Uno studio ha riferito che il 24R,25-(OH)2D3 forma attiva della vitamina D è essenziale per la differenziazione osteoblastica di umano MSCs (hMSCs)28. Omeostasi dell'osso e riparazione sono regolati da una rete di metaboliti di vitamina D3 , di cui 1,252D3 (calcitriol) è il più biologicamente attivo e rilevante nella regolazione della salute dell'osso. Vitamina D3 è essenziale per la calcificazione29. In uno studio facendo uso dei topi di Kunming bianco 2-d-vecchi, i corpi embryoid nei topi hanno indicato che i supplementi di vitamina D e vitamina C efficacemente promossa la differenziazione degli osteoblasti derivati ESC30. Tra le sue altre attività biologiche, 1,25-2D3 stimola la differenziazione in vitro di hMSCs di osteoblasti, che possono essere monitorati basati sull'aumento nell'attività dell'enzima fosfatasi alcalina (ALP) o OCN gene espressione.
Pochi studi hanno rilevato una relazione dose-risposta di trattamenti combinati con vitamina C e 1,252D3 nell'umano PDC con un focus particolare sull'ingegneria del tessuto osseo. Pertanto, in questo studio, esaminiamo le concentrazioni ottimale per il trattamento singolo o combinato di 1,252D-3 e vitamina C per l'induzione del differenziamento osteogenico di PDC umano. L'obiettivo del presente protocollo è quello di determinare se una popolazione di cellule isolata dal periostio alveolare dentale contiene cellule con un fenotipo MSC e se queste cellule possono essere espanse in coltura (in vitro) e differenziate per formare il tessuto desiderato . Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC. La seconda parte dello studio valuta gli effetti di vitamina C e 10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M 1,25-2D3 sull'attività osteogenica del PDC. L'obiettivo primario di questo studio è di valutare le funzioni di vitamina C e2D 1,25-3 durante la differenziazione osteoblastica di PDC da attività ALP e geni pro-osteogenico, come ALP, collagene-1, OCN, BSP e CBFA1. Inoltre, questo studio determina le condizioni ottimali osteoinduttivo per PDC umano sulla base di questi risultati.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>acido 2-fosfo-L-ascorbicosale trisodico Sigma</td><td></td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>piastre di coltura da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina</td><td>Kit</td><td></td> di dosaggio colorimetrico per l'attività della fosfatasi alcalina ABI Hs01029144_m1 <td></td></tr><tr><td></td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa del virus della mieloblastosi aviaria</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>core binding factor alpha-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>insulina... trasferimento&ndash; selenio-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione a 96 pozzetti (0,1 ml)</td><td>Life</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimo Terreno essenziale 1X Alpha Modification</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR Master Mix</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td>Life</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita trasformante-&beta;</td><td>Sigma</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol (per l'isolamento dell'RNA)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collagene-1</td><td>Invitrogen</td><td>primer diretto 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 primer inverso 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>primer in avanti 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' primer inverso 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>primer in avanti 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' primer inverso 5'-GATGCAAAGCCAGAGAATGGAT-3'</td><td></td></tr> <tr><td>Primer ALP commerciali Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>CBFA1</td></tr></tbody></table> commerciali

isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina d su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono presenti in una varietà di tessuti e possono essere differenziate in numerosi tipi cellulari, tra cui osteoblasti. Tra le fonti dentale di MSCs, il periostio è un tessuto facilmente accessibile, che è stato identificato per contenere MSCs nello strato cambiale. Tuttavia, questa fonte non è stato ancora ampiamente studiata.
Vitamina D3 e 1,252D-3 hanno dimostrati di stimolare la differenziazione in vitro di cellule staminali mesenchimali in osteoblasti. Inoltre, vitamina C facilita la crescita di collagene dell'osso e la formazione delle cellule. Tuttavia, nessuno studio ha ancora studiato gli effetti della vitamina D3 e la vitamina C su MSCs.
Qui, presentiamo un metodo per isolare MSCs dal periostio alveolare umano ed esaminare l'ipotesi che 1,25-2D3 può esercitare un effetto osteoinduttivo su queste cellule. Abbiamo anche indagare la presenza di cellule staminali mesenchimali nel periostio alveolare umano e valutare la proliferazione e l'adesione delle cellule staminali. Per valutare la capacità della vitamina C (come controllo) e le varie concentrazioni di 1,252D-3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) di alterare biomarcatori chiave di mRNA in l'espressione del mRNA di MSCs isolato della fosfatasi alcalina (ALP), osso sialoproteina (BSP), associazione nucleo fattore alfa-1 (CBFA1), collagene-1 e osteocalcina (OCN) sono misurati usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR).

Per tutte le analisi quantitative, i dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando dello studente t-test. In totale, 34 campioni sono stati ottenuti con un'età media di partecipanti di 48,1 ± y. 12,3 undici di questi campioni sono stati ottenuti da pazienti di sesso maschile e 23 da pazienti di sesso femminile. Ventotto campioni sono stati ottenuti dalle regioni molari e sei da regioni anteriori; 26 sono...

Vi presentiamo un protocollo per studiare i biomarcatori di espressione di mRNA di cellule derivanti dal periostio (PDC) indotte da vitamina C (vitamina C) e 1,25-diidrossi-vitamina D [1,252D-3]. Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

L'obiettivo generale di questo studio è quello di studiare gli effetti osteoinduttivi della vitamina D sulle cellule staminali mesenchimali in coltura che sono state raccolte dal periostio alveolare dentale. L'uso di cellule staminali mesenchimali è un grande progresso in odontoiatria nell'ultimo decennio. Sono stati isolati e coltivati con successo da molte parti del tessuto dentale.L'obiettivo è quello di isolare e coltivare cellule staminali mesenchimali dal periostio alveolare e di studiare il potenziale osteoinduttivo del composto di vitamina D. In generale, gli individui nuovi a questa materia avranno difficoltà a causa della nuova idea della formazione ossea nelle cellule staminali mesenchimali derivate dal periostio alveolare. La dimostrazione della procedura del personale di laboratorio sarà la signorina Hsin-Wen Chi.She è un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, prelevare i tessuti periostali dai pazienti durante la chirurgia dentale utilizzando un separatore periostale. Raccogli fette di circa due per cinque millimetri.Conservare le fette di tessuto in DPBS con antibiotici. In laboratorio, utilizzare un bisturi per tritare accuratamente i frammenti di tessuto periostale alveolare entro 24 ore dalla raccolta. Successivamente, coltivare il tessuto su piastre di Petri da 35 millimetri nel terreno di coltura appropriato.Utilizzare un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Tre giorni dopo, scartare i tessuti periostali raccolti e cambiare il terreno. Quando le cellule sono proliferate a circa l'80% di confluenza, staccare le cellule coltivate aggiungendo tripsina.E incubando la coltura per tre minuti. Successivamente, aggiungere 0,8 millilitri di terreno per terminare il distacco. Dopo la raccolta e il conteggio, distribuire 5.000 cellule in un millilitro per piastra.Contrassegnare le celle placcate come passaggio uno in questa fase. Coltiva queste cellule e separale di nuovo dopo che hanno proliferato fino all'80% di confluenza. Il mezzo con passaggio uno è inizialmente di colore arancio/rosso.Quando il mezzo inizia a diventare arancione tre giorni dopo, cambialo. Quando le celle di passaggio uno raggiungono l'80% di confluenza, creare le celle dalla seconda alla quinta generazione ripetendo le stesse procedure utilizzate per preparare la generazione zero alla prima generazione. Cambia il mezzo due volte a settimana.Quattro settimane dopo, valutare il potenziale delle cellule di differenziarsi in un lignaggio osteogenico osservando la morfologia delle cellule al microscopio. Staminali le cellule utilizzando un saggio di von Kossa. Questo test distingue la presenza di depositi calcificati nella coltura.Lavare le cellule con PBS e fissarle per 30 minuti in un millilitro di formalina al 10%. Successivamente, rimuovere la formalina e quindi lavare le cellule e trattarle con nitrato d'argento al 5%. Esporre le cellule alla luce UV per un'ora.Quindi, rimuovere il nitrato d'argento e trattare le cellule con due millilitri di solfato di sodio al 5% quattro volte per tre minuti ogni volta. Sostituire la soluzione tra un trattamento e l'altro. Infine, lavare le celle due volte utilizzando acqua distillata.20 dei 34 campioni di tessuto periostale hanno prodotto con successo colonie di cellule staminali derivate dal midollo. Non è stato riscontrato alcun fattore in relazione ai donatori che influenzi in modo significativo il successo della coltura. Inizialmente, le PDC formavano colonie e ammassi sferici con un mix di cellule rotonde e a forma di fuso.Dopo il primo passaggio, le cellule erano omogeneamente simili a fibroblasti con una forma a fuso. Al termine del differenziamento osteogenico, il saggio di von Kossa ha indicato la possibile presenza di depositi di calcio e differenziamento osteogenico. Questi risultati indicano fortemente che tra le popolazioni di cellule periostali, le cellule progenitrici possiedono il potenziale per differenziarsi in cellule osteogeniche.Le cellule precursori osteogeniche sono state anche trattate con calcitriolo ed esaminate utilizzando RTPCR per valutare il livello di espressione della fosfatasi alcalina, che è un forte indicatore della differenziazione osteogenica precoce delle cellule. Sia il trattamento della vitamina C che del calcitriolo, un metabolita attivo della vitamina D, hanno aumentato l'espressione della fosfatasi alcalina. Inoltre, l'espressione dei livelli di mRNA del collagene uno è aumentata in risposta agli stessi trattamenti.È stato riscontrato che l'espressione dell'mRNA della sialoproteina ossea aumenta per le cellule trattate con una concentrazione più elevata di calcitriolo. Tuttavia, il CBFA one e l'espressione dell'mRNA ostocalcico non hanno risposto ai trattamenti. Dopo aver visto questo video, il pubblico dovrebbe avere una buona comprensione della mineralizzazione e del protocollo di coltura del periostio alveolare umano.Una volta padroneggiata, questa ricerca può essere eseguita in quattro o cinque settimane se eseguita correttamente. Quando si tenta questo esperimento, è importante utilizzare una tecnica attenta e sterile per evitare la contaminazione della cellula.

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L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

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Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio (Video) | JoVE Journal

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

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