Name: Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: Scopri l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale umana da denti permanenti con due metodi diversi. Questa tecnica aiuta a valutare la differenziazione odontoblastica.

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Si ringrazia il Dr. Leila Shakeri &amp; Dr. Aref Dournaei per la loro discus critica e Mohammad Reza Khadem Sharif per i suoi supporti tecnici.

1. Preparare la soluzione enzimatica e medie proliferazione (PM) <ol><li> Marca Collagenasi I Soluzione: Pesare, collagenasi di tipo I (12 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Fai Soluzione dispasi: Pesare dispasi (16 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Rendere soluzione enzimatica: Aggiungere 1 ml di collagenasi di tipo I soluzioni (12 mg / ml) e 1 ml di soluzioni dispasi (16 mg / ml) in 2 ml di PBS sterile contenente 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina. Concentrazione totale di dispasi e collagenasi I in volume finale deve essere di 4 mg / ml e 3 mg / ml, ricettivamente. Quindi, in questo volume aliquota di quattro tubo 15 ml, ciascuna contenente 1 ml di soluzione di enzima. Ogni tubo potrebbe essere utilizzato per una digestione pasta. </li><li> Rendere soluzione di lavaggio: Aggiungere 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina in PBS. </li><li> Assicurarsi che i supporti di base: Alpha modifica del mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS e 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina. </li><li> Rendere il supporto proliferazione (PM): modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomicina, 0,25 mg / ml di amfotericina B. </li><li> Rendere supporti odontogene: modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 0,01 pM desametasone, 5 mM β-glicerolo fosfato, 1,8 mM di fosfato monopotassico. </li></ol> 2. Preparare umano tessuto dentale Dental Pulp per Isolatio cellule staminali della polpan <ol><li> Normali molari umani terzi sono stati raccolti da adulti (21-29 anni di età) presso la Clinica Odontoiatrica dell&#39;Imam Ali sotto Institutional Review Board approvato (IRB). </li><li> Denti sono stati inseriti nel terreno base (α-MEM supplementato con 10% FBS) e sono stati trasferiti in laboratorio a 4 ° C. </li><li> Sotto la condizione sterile, lavorando all&#39;interno di una cappa a flusso laminare biohazard, set-up è stato fatto uno 100 millimetri Petri per ogni dente da trattare. Superfici dentali venivano pulite del 70% di etanolo. </li><li> Mentre lavora in uno dei piatti Petri, dente è stato tenuto da pinze dentali e una lama di bisturi è stato usato per pulire i detriti e legamento parodontale sulle radici. </li><li> Giunzione smalto-cemento è stato lentamente tagliato utilizzando sterilizzato disco dentale per rivelare la camera pulpare. Va considerato che il processo di taglio deve essere effettuata lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale. </li><li> Tessuto pulpare è stato delicatamente separato dalla corona e radice. </li&gt; <li> Tessuto pulpare è stato tagliato in piccoli pezzi con l&#39;aiuto di una lama di bisturi. </li></ol> 3. Umano Isolamento polpa dentale <ol><li> Pulp tessuti sono stati sottoposti sia dissociazione enzimatica del tessuto della polpa o cellule conseguenza diretta da espianti pasta tessuto per l&#39;isolamento di hDPSCs. </li><li> Dissociazione enzimatica del tessuto della polpa: <ol><li> Piccoli pezzi di tessuti paste sono state trasferite in soluzione enzimatica per 1 ora a 37 ° C. Vortex ogni 30 minuti per rompere il tessuto. </li><li> In seguito, gli aggregati a grandi cellule sono state rimosse e cella singola sospensioni sono stati ottenuti facendo passare le cellule attraverso un 70-mM filtro cella. </li><li> Monocellulari sospensioni sono state centrifugate a 1200 rpm per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Surnatanti sono stati accuratamente pipettati off e pellet è stato risospeso in 1 ml di terreno di proliferazione (PM). (Nota: FBS a medio proliferazione terminare enzimatica disciazione.) </li><li> Sospensioni monocellulari di polpa dentale è stato seminato in 25 cm 2 pallone di coltura con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Il terreno di coltura è stato cambiato ogni tre giorni fino a quando la confluenza delle cellule è stato raggiunto. </li></ol></li><li> Cella diretta conseguenza da espianti di tessuto pasta: <ol><li> Tessuto pulpare stata macinata in 1-2-millimetri frammenti, e ogni pezzo è stato posto in 25-cm 2 fiasche con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO 2. Si deve considerare che il volume totale del PM per conseguenza di cella deve supportare il fissaggio di pezzi paste per outgrowth cella ulteriore (2-3 ml per beuta). </li><li> Medio è stato modificato dopo escrescenza è stata osservata. </li><li> Le cellule erano cresciuti a confluenza sub-coltura con un rapporto di 1:4 (passaggio 1). </li></ol></li></ol> 4. Immunofenotipizzazione <ol><li> 250.000 cellule /tubo di entrambi i tipi di cellule nel passaggio 3 sono state incubate da PE o FITC-coniugato anti-umani coniugati con i loro isotipi per 30 min a 4 ° C al buio. (Nota:. Concentrazione di anticorpi è stato applicato secondo il protocollo fabbricazione) </li><li> Dopo il tempo di incubazione, 100 microlitri di PBS o soluzione di diluizione FACS è stato aggiunto a ciascuna provetta e centrifugati a 1200 rpm per 5 min in luogo buio. </li><li> Surnatanti sono stati rimossi e pellet sono stati risospesi in 100 pl di PBS o diluizione FACS in luogo buio. </li><li> Marcatori di superficie mirate (marcatori CD) sono stati valutati da BD FACSCalibur. </li></ol> 5. Induzione di differenziazione delle cellule in DPSCs mineralizzati e quantificata Assay Rosso alizarina S <ol><li> DPSCs che sono stati ottenuti da una dissociazione enzimatica del tessuto pulpare (noto come DPSC-DE) o conseguenza delle cellule direttamente da espianti di tessuto polpa (DPSC-OG) sono stati sub-coltivate per 3 passaggi. </li><li> Lat Passage 3, le cellule sono state seme in una piastra a 6 pozzetti 5000 cellule / pozzetto. </li><li> Alla confluenza del 60%, medie odontogeno stati sostituiti da PM convenzionale. Tre pozzetti erano rimasti come controllo negativo aggiungendo mezzo di crescita. </li><li> Media ogni 3 giorni fino al giorno 21. </li><li> Al giorno 21, cellule sono state lavate con PBS e sono stati fissati con 1 ml / pozzetto 10% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Poi paraformaldeide stato pipettato off, cura e le cellule sono state lavate 3 volte (5-10 minuti per ogni volta) con acqua distillata H 2 O. (Nota: evitare di disturbare il monostrato.) </li><li> Dopo il lavaggio, 1 ml / pozzetto di rosso alizarina S sono stati aggiunti per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate da H 2 O deionizzata quattro volte (5 min per ogni volta con gentile dondolio) per rimuovere qualsiasi ulteriore Alizarin rosso. </li><li> 1 ml / pozzetto H 2 O sono stati aggiunti per impedire alle cellule di essiccazione. </li><li> Le piastre sono stati assunti i componenti visivipection e / o l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Per il saggio di quantificazione Rosso alizarina S, H 2 O sono stati sostituiti da 1 ml di acido acetico 10% in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti e incubare per 30 min a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Poi, monostrato di cellule / pozzetto sono stati raschiare e sia l&#39;acido acetico e le cellule sono state trasferite nelle distinte da 1,5 ml micro-centrifuga tubi. (Nota:. Ogni bene dovrebbe essere il trasferimento in un tubo separato vale a dire tre pozzi di prova e tre pozzi di controllo per ogni gruppo ED &amp; OG) </li><li> Tubi furono vortexate energicamente per 30 sec. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 10 min. (Nota: per evitare l&#39;evaporazione, i tubi sono stati sigillati con parafilm.) </li><li> Dopo il riscaldamento, i tubi sono stati trasferiti in ghiaccio per 5 min. (Nota: I tubi non devono essere aperti finché diventano raffreddato.) </li><li> Gli impasti sono stati centrifugati a 20.000 xg per 15 min. Mentre centrifugazione, alizarina standard Red sono stati effettuatiup. </li></ol> Standard Rosso alizarina S sono state preparate prima diluendo il tampone di diluizione e usato per fare diluizioni seriali due volte in base alla tabella. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> Gamma Alta concentrazione di colorante </td><td colspan="7"> Gamma bassa concentrazione di colorante </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> 1 mM </td><td> 500 pM </td><td> 250 pM </td><td> 125 pM </td><td> 62,5 pM </td><td> 31,3 pM </td><td> 15,6 pM </td><td> 7,8 pM </td><td> 3,9 pM </td><td> 1,9 pM </td><td> 0,9 pM </td><td> 0,4 micron </td><td> Vuoto </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> Dopo la centrifugazione, 1 ml di surnatante / tubo sono state trasferite nei nuovi separati 1,5 ml micro-provette da centrifuga. </li><li> Il pH è stato neutralizzato con ~ 375 microlitri 10% Idrossido di ammonio per provetta. (Nota: la rabbia pH dovrebbe essere 4,1-4,5.) </li><li> 150 ml di standard e campioni (include test separati e controlli) sono stati aggiunti in una parete opaca, fondo trasparente piastra a 96 pozzetti. </li><li> L&#39;assorbanza è stata letta a 405 nm e valori di assorbanza dei campioni sono stati confrontati con trama standard per ulteriori analisi. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo descrive il processo di isolamento e caratterizzazione di hDPSCs da polpa dentale utilizzando due metodi, dissociazione enzimatica e la conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare. Inoltre, in vitro differenziazione di queste cellule in odontoblasti, è stata valutata mediante dosaggio quantitativo Rosso alizarina S &amp; QPCR. Protocolli esistenti per isolare dal tessuto pulpare dente umano era stato utilizzato diversi strumenti quali pi...

Le cellule staminali sono cellule clonogeniche che possiedono due caratteristiche notevoli, conosciuti come multi-potenza e di auto-rinnovamento 15. Tra tutte le cellule staminali con diverse potenze replicative, le cellule staminali dentali come le cellule staminali post-natali hanno attirato l&#39;attenzione negli ultimi anni, a causa della loro accessibilità, plasticità, e ad alta capacità proliferativa rispetto ad altre cellule staminali adulte 16. Caratteristicamente, simili alle cellule staminali mesenchimali, cellule staminali polpa dentale sono aderenti cellule clonogeniche aventi capacità multipla differenziazione in mesenchima e / o non-mesenchima lignaggi, sia in vitro che in vivo. 1-8,17,18 DPSCs sono identificati da la loro espressione negativa di antigeni ematopoietiche (ad esempio, CD45, CD34, CD14), e l&#39;espressione di CD90 positivo, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1. 19,20 Facile potenziale ottenuto con un minimo sforzo e la morbilità rendere DPSCs umani come un validosorgente in grado di MSC rispetto alle fonti ordinarie, come le cellule staminali mesenchimali del midollo 21. In generale, DPSCs sono stati isolati da una escrescenza metodo, cioè, la migrazione di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG) 22-24, e / o mediante digestione enzimatica (DPSC-ED) 4,6,25. Studi precedenti hanno dimostrato che il metodo di isolamento e condizioni di coltura possono indurre differenti popolazioni o casate sotto passaggi in vitro 26,27. Nel caso di denti permanenti (pDPSCs), Huang et al rivelato che enzimatiche pDPSCs digeriti hanno potenziale proliferativo superiore rispetto ai DPSCs cresciuti. 26 Inoltre, nel caso di denti decidui (dDPSCs), è stato dimostrato che STRO-1 e CD34 marcatori espressi più dDPSC-DE rispetto a dDPSC-OG. Inoltre, dDPSC-ED visualizzato elevato tasso di mineralizzazione in definito osteo / odonto media. 27 Pertanto, a causa del potenziale eccezionale di DPSCs in rmedicina egenerative, ulteriori studi saranno necessari per una migliore comprensione delle possibili varie popolazioni che sono derivati ​​da diversi metodi di isolamento. Qui, era tentativo di introdurre modo semplice di estrazione polpa, utilizzando uno step-disco diamantato dentale per facilitare il processo di estrazione polpa. Inoltre, dopo l&#39;isolamento di polpa umani cellule staminali derivate mediante l&#39;applicazione di metodi di ED o OG, proprietà generali e capacità di differenziazione tra i due gruppi sono stati studiati.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo o Lotto. numero </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi tipo I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino definito (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> L-ascorbico 2-fosfato </td><td> Sigma </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Desametasone </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-Glicerolo sale idrato fosfato disodico, BioUltra </td><td> Sigma </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogenesi Assay Kit </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG2b-PE isotipo di controllo </td><td> BD Pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC del mouse IgG2b isotipo di controllo </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> Del mouse FITC IgG1 isotipo κ </td><td> BD Pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE topo anti-umano CD34/CD45 </td><td> BD Pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-CD146 umano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> Monoclonale murino anti-umano CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE di topo anti-CD73 umano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-h CD105/Endoglin PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE topo anti-umana CD11b/Mac1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE topo anti umano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70-micron cella filtro </td><td> Falco </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0,2 micron filtro a siringa </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25 cm 2 cultura pallone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Multiskan spettrofotometro per micropiastre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense Microscopio </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flowing Versione software 2.3.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane dental pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"&gt; Denti del giudizio in via di sviluppo sono facilmente accessibile fonte di cellule staminali durante l&#39;età adulta che potrebbe essere ottenuta con trattamenti ortodontici di routine. Umani polpa cellule staminali derivate (hDPSCs) in possesso di un elevato potenziale di proliferazione con il multi-lignaggio capacità di differenziazione confrontare alla fonte ordinaria di cellule staminali adulte<sup&gt; 1-8</sup&gt;, Quindi, hDPSCs potrebbero essere i candidati ideali per il trapianto autologo in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Oltre a questi benefici, in possesso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) offre, come effetti immunolodulatory, hDPSCs rendere più prezioso, anche nel caso di trapianto allogenico<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. Pertanto, il passaggio principale per utilizzare questa fonte di cellule staminali è quello di selezionare il miglior protocollo per isolare hDPSCs dal tessuto pulpare. Al fine di raggiungere questo obiettivo, è fondamentale per studiare l&#39;effetto delle condizioni di isolamento diverse su differenti comportamenti cellulari, come i loro marcatori di superficie comuni e anche la loro capacità di differenziazione.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; In questo modo, qui si separano tessuti umani colpiti dalla polpa terzi denti molari, e poi usato entrambi i protocolli esistenti basati sulla letteratura, per hDPSCs isolamento,<sup&gt; 11-13</sup&gt;<em&gt; Per esempio</em&gt; Dissociazione enzimatica del tessuto pulpare (DPSC-DE) o escrescenza da espianti di tessuto (DPSC-OG). A questo proposito, abbiamo cercato di facilitare i metodi di isolamento mediante disco diamantato dentale. Quindi, queste cellule caratterizzato in termini di stromale associati marcatori (CD73, CD90, CD105 e CD44), pennarelli emopoietiche / endoteliale (CD34, CD45 e CD11b), marcatori perivascolare, come CD146 e anche STRO-1. Successivamente, questi due protocolli sono stati confrontati in base alla potenza differenziazione in odontoblasti sia quantitativa reazione a catena della polimerasi (QPCR) e Alizarin colorazione rossa. QPCR sono stati utilizzati per valutare l&#39;espressione dei geni correlati mineralizzazione (fosfatasi alcalina; ALP, phosphoglycoprotein matrice extracellulare; MEPE &amp; dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> DPSCs che sono stati ottenuti dalla dissociazione enzimatica (DPSC-ED) sono mostrati qui a 10 giorni, 15,18 (Figura 1). Le colonie avviato per formare su quasi 3 a 5 giorni dopo l&#39;isolamento. </li><li> DPSCs superato (DPSC-OG) sono mostrati nella Figura 2, il giorno 5, 10, 13 e 18. Fibroblasto-simili cellule hanno cominciato a migrare dal tessuto pulpare nel pallone da parallelo ordinazione quasi 5 giorni dopo la semina. </li><li> DPSCs al passaggio 3 utilizzando entrambi i metodi sono illu...

Il metodo descritto l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs) utilizzando<strong&gt; Dissociazione enzimatica della polpa (DPSC-DE)</strong&gt; O<strong&gt; Conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG). Seguito da</strong&gt;<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione comparativa di entrambi i tipi di hDPSCs in odontoblasti.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

I denti del giudizio in fase di sviluppo rappresentano una fonte di cellule staminali facilmente accessibile durante l'età adulta, che può essere ottenuta attraverso i comuni trattamenti ortodontici. Umani...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, caratterizzare e differenziare le cellule staminali del polso gentile umano da denti permanenti utilizzando due metodi. Ciò viene ottenuto raccogliendo denti del giudizio inclusi sani, tagliandoli intorno alla giunzione cemento-smalto all'inizio. Le cellule staminali polinucleari dentali (D PSCs) vengono isolate mediante due metodi diversi.Nel primo metodo, i tessuti polipoidi vengono digeriti enzimaticamente mediante incubazione in collaghenasi di tipo uno più soluzione per lo spazio interdiscale. Qui li chiamiamo ed. Per quanto riguarda il metodo di isolamento nel secondo metodo, i tessuti palp vengono semplicemente posti nel fiasco senza alcuna digestione.In questo modo, le dpss iniziano a migrare dal tessuto nel flacone. Queste cellule, denominate OG, fanno riferimento al metodo di isolamento per outgrowth. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'identificazione delle cellule staminali mediante citometria a flusso.Il terzo passaggio della procedura è l'induzione della differenziazione degli odontoblasti, e l'ultimo passaggio consiste nella valutazione comparativa della differenziazione degli odontoblasti tra due gruppi mediante colorazione rossa e QBCR. Sono RA Kde del Dipartimento di Cellule Staminali e Biologia dello Sviluppo presso l'Istituto Rian. Oggi vi mostrerò l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione comparativa di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando due metodi.Ciao, sono il dottor Rezaian dell'Istituto Rio. Stiamo lavorando a un progetto relativo alle cellule staminali della polpa dentale umana. Queste cellule sono un tipo di cellule staminali mesenchimali, facili da ottenere con dolore e morbosità minima.Le cellule staminali meccie si caratterizzano per la loro capacità plasica, la formazione di colonie e la capacità di differenziazione multipotente. Salve, sono la dottoressa Ami del Dipartimento di Cellule Staminali. Nel nostro istituto, utilizziamo questa procedura in laboratorio per isolare le cellule staminali ai fini di studi di ricerca e applicazioni future.In medicina rigenerativa, il primo passo per utilizzare questa fonte di cellule staminali per future terapie basate su cellule staminali consiste nello scegliere il miglior protocollo per l'isolamento delle cellule staminali dal tessuto parodontale umano. Per raggiungere questo obiettivo, è fondamentale indagare alcuni aspetti del comportamento cellulare in diverse condizioni di isolamento delle cellule staminali. Per prima cosa, procederò all'isolamento di cellule staminali del polso dentale umano utilizzando l'una o l'altra metodica: la dissociazione enzimatica del polso o l'espansione delle cellule staminali da impianti di tessuto.Quindi caratterizzarli e differenziarli in blastocisti. Cominciamo. Per prima cosa, spazio e collagenasi di tipo uno vengono sciolti in PBS.Quindi filtrarli utilizzando un filtro da siringa da 0,2 micron. Raccogliere entrambi in un tubo conico. Poi aggiungere pener e PBS per ottenere la concentrazione finale.Trasferire i denti del giudizio sani in laboratorio nel mezzo basico freddo, in condizioni sterili. Pulire la superficie del dente con etanolo al 70% prima dell'analisi. Assicurarsi di rimuovere ogni traccia di polvere dalla superficie del dente.Tagliare il dente intorno alla giunzione smalto-cementizia utilizzando un disco dentale sterilizzato per esporre la camera pulpare. È necessario considerare che il processo di taglio deve essere eseguito lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale. Successivamente, separare delicatamente il tessuto pulpare dalla corona, riducendo il tessuto pulpare in pezzi di uno-due millimetri con la lama di Scarpa.Trasferire piccoli pezzi di tessuto pulpare in un millilitro di soluzione enzimatica per un'ora a 37 gradi Celsius, vorticosando ogni 30 minuti per favorire la disgregazione del tessuto pulpare. Successivamente, rimuovere gli aggregati più grandi facendoli passare attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Quindi aggiungere PBS contenente PENER e centrifugare a 1.200 giri al minuto per cinque minuti.Rimuovere con attenzione il soprannatante. Quindi sospendere la piastra nel mezzo di proliferazione pm, trasferirla nel flacone di coltura e aggiungere il mezzo. Quindi incubare.Cambiare il mezzo ogni tre giorni fino al raggiungimento della confluenza cellulare per il metodo di outwork. Ripetere il processo di taglio. Dopo il taglio, porre i tessuti in frammenti di uno-due millimetri.Quindi posizionarli nella coltura. Aggiungere il mezzo di proliferazione, esporre brevemente e incubare. Si deve considerare che il volume totale del mezzo di proliferazione deve favorire l'adesione di tutti i frammenti per la successiva espansione cellulare.Cambiare il mezzo dopo aver osservato l'espansione cellulare e successivamente ogni tre giorni fino al raggiungimento della confluenza cellulare. Per l'immunofenotipizzazione, incubare entrambi i tipi di D PSCs con anticorpi coniugati a PE o FITC per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Quindi aggiungere PBS e centrifugare a 1.200 giri al minuto per cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e risospendere, sospendere la piastra in PBS e infine valutare i marcatori di superficie mediante citometria a flusso sottocolturando entrambi i tipi di DPC per tre passaggi. Quindi trattare con tripsina a ghiaccio e trasferirli in sei piatti di coltura rossi al 60% di confluenza, sostituendo il mezzo di coltura (PM) con mezzo odontogenico. Tre pozzetti vengono mantenuti come controllo negativo aggiungendo PM.Cambiare il mezzo ogni tre giorni; al giorno 21° lavare le cellule con PBS. Quindi fissarle con un millilitro per pozzetto di gel al 10% per 15 minuti a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, rimuovere con attenzione il fissativo e risciacquare le cellule tre volte con acqua distillata. Quindi sostituire l'acqua con un millilitro per ogni alza rossa in soluzione di colorante rosso. Dopo 20 minuti, rimuovere l'eccesso di colorante e lavare le cellule quattro volte con acqua deionizzata.Quindi aggiungere un millimetro di acqua per pozzetto per evitare che le cellule si secchino. Dopo la colorazione, si possono osservare tre rotaie superiori diventare rosse rispetto ai controlli al microscopio; con un ingrandimento elevato è possibile vedere l'assorbimento del colore di colorazione attorno alla cellula, per la quantificazione della colorazione rossa. Dopo aver rimosso l'acqua, aggiungere un millilitro per pozzetto di acido acetico al 10%, quindi incubare per 30 minuti con agitazione.Quindi, rimuovere delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un raschietto per cellule. Successivamente, trasferirle nei tubi separati. VOR agita vigorosamente per 30 secondi.Quindi riscaldarli a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Per evitare l'evaporazione, sigillare le provette con ParaView e trasferire il campione sul ghiaccio per cinque minuti; quindi centrifugarlo a 20.000 ×g per 15 minuti. Nel frattempo, preparare la diluizione seriale standard di rosso Congo secondo il protocollo della regione.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e trasferirlo nei nuovi tubi. Neutralizzare il pH con idrossido di ammonio al 10%. Quindi aggiungere gli standard e i campioni nella piastra a 96 pozzetti.Piastrare in una piastra a pozzetti, quindi misurare l'assorbanza a 405 nanometri e analizzare i dati in base alla diluizione seriale standard. Qui è possibile osservare le DPC, isolate mediante dissociazione enzimatica al giorno 10°, 15° e 18°, e anche le DPC espanse al giorno 5°, 10°, 13° e 18°. Entrambi i tipi di dpss nel sase tre sono quasi delle stesse dimensioni e morfologia. I risultati dell'immunofenotipizzazione mostrano la presenza di marcatori delle cellule staminali mesenchimali come CD 44, CD 73 e CD 19, e l'assenza di marcatori ematopoietici ed endoteliali come CD 34, CD 45 e CD 11 B. In modo interessante, l'espressione di CD 1 0 5 e CD 146 è maggiore nelle d PSC espanse rispetto alle D-P-S-C-E-D. La quantificazione della colorazione enzimatica rossa al giorno 21° della differenziazione in odontoblasti mostra un maggiore deposito di calcio nelle D-P-S-C-E-D rispetto alle cellule staminali dentali senza trattamento.I risultati di QPCR indicano anche espressioni significativamente più elevate di MEP e A LP come marcatori di mineralizzazione nel D-P-S-C-D rispetto alle cellule staminali dentali in uscita. Nel frattempo, entrambi i geni sono regolati durante la differenziazione e anche l'espressione di DSPP, come marcatore odontogenico, aumenta durante il processo differenziativo. Tuttavia, non vi è alcuna variazione significativa nell'espressione di DSVP nelle cellule differenziate tra i gruppi ED e OG.Abbiamo appena mostrato come isolare cellule staminali da tessuti dentali umani mediante la dissociazione enzimatica della polpa o la migrazione spontanea di cellule staminali da espianti di tessuto. Questo è tutto. Vi auguriamo buona fortuna nel provare a utilizzare questa procedura nei vostri esperimenti.Grazie.

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Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi (Video) | JoVE Journal

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

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