Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, caratterizzare e differenziare le cellule staminali del polso gentile umano dai denti permanenti utilizzando due metodi. Ciò si ottiene raccogliendo i denti del giudizio sani e inclusi, tagliandoli intorno al cemento alla giunzione dello smalto all'inizio. Le cellule staminali polistaminali dentali D PSC sono isolate con due metodi diversi.

Nel primo metodo, i tessuti dei polipi vengono digeriti enzimaticamente incubandoli nella soluzione di collagenasi di tipo uno più spazio discale. Qui li chiamiamo ed. Considerando il metodo di isolamento del secondo metodo, i tessuti palpi vengono solo inseriti nel pallone senza alcuna digestione.

In questo modo, i dps iniziano a migrare dal tessuto al pallone. Queste cellule denominate OG si riferiscono al metodo di isolamento della crescita. La seconda fase della procedura è l'identificazione delle cellule staminali mediante citometria a caduta.

La terza fase della procedura è l'induzione della differenziazione degli odontoblasti e la fase finale della procedura è la valutazione comparativa della differenziazione degli odontoblasti tra due gruppi mediante colorazione in rosso e QBCR. Sono RA Kde del Dipartimento di Cellule Staminali e Biologia dello Sviluppo del Rian Institute. Oggi vi mostrerò l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione comparativa di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando due metodi.

Ciao, sono il dottor Rezaian dell'Istituto di Rio. Stiamo lavorando a un progetto relativo alle cellule staminali della polpa dentale umana. Queste cellule sono una sorta di cellule staminali mechy, che sono facili da ottenere con il minimo dolore e morbilità.

Le cellule staminali di Mechy si specificano con capacità di aran plastica, formazione di colonie e capacità di differenziazione multipla. Ciao, sono il dottor Ami del Dipartimento di Cellule Staminali. All'istituto, utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per isolare le cellule staminali ai fini di studi di ricerca e applicazioni future.

Nella medicina rigenerativa, il primo passo per utilizzare questa fonte di cellule staminali per la futura terapia basata sulle cellule staminali è scegliere il miglior protocollo per isolare le cellule staminali dal tessuto umano. Per raggiungere questo obiettivo, è fondamentale studiare alcuni aspetti del comportamento cellulare in diverse condizioni di isolamento delle cellule staminali. In primo luogo, isolerò le cellule staminali della polpa dentale umana utilizzando la dissociazione enzimatica della polpa o la crescita di cellule staminali da impianti tissutali.

Quindi caratterizzarli e differenziarli in esplosione di ogeni. Quindi iniziamo. In primo luogo, lo spazio e la collagenasi di tipo uno si dissolvono entrambi in PBS.

Quindi filtrarli utilizzando un filtro per siringa da 0,2 micron. Tirare entrambi in un tubo conico. Quindi aggiungere pener e PBS per ottenere la concentrazione finale.

Trasferire i denti del giudizio sani in laboratorio nel mezzo di base freddo allo stato di acciaio. Pulire la superficie del dente con etanolo al 70% prima di studiare. Assicurati di pulire la brezza dalla superficie del dente.

Tagliare il dente attorno alla giunzione dello smalto cementizio utilizzando un disco dentale sterilizzato per rivelare la camera pulpare. Va considerato che il processo di taglio deve essere eseguito lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale. Quindi separare delicatamente il tessuto pulpare dalla corona, ovvero il tessuto pulpare, in pezzi da uno a due millimetri con la lama Scarpa.

Trasferire piccoli pezzi di tessuti pulpulp in una soluzione enzimatica da un millilitro per un'ora a un vortice di 37 gradi Celsius ogni 30 minuti per aiutare a rompere i tessuti polpare. Successivamente, rimuovere gli aggregati di grandi dimensioni facendoli passare attraverso un ceppo cellulare da 70 micron. Quindi aggiungere PBS contenente centrifughe PENER a 1, 200 giri/min per cinque minuti.

Rimuovere il supernat con attenzione. Quindi sospendiamo la piastra nel mezzo di proliferazione, pm, la trasferiamo nel pallone di coltura e aggiungiamo il terreno. Quindi incubare incubato.

Cambiare il mezzo ogni tre giorni fino a raggiungere la confluenza delle celle per il metodo di outwork. Ripetere il processo di taglio. Dopo aver tagliato il dente significa far scoppiare i tessuti in un frammento di uno o due millimetri.

Quindi inseriscili nella cultura. Flash con proliferazione, medio e incubato. Va considerato che il volume totale del mezzo di proliferazione deve essere supportato dall'attacco di tutti i pezzi per un'ulteriore crescita cellulare.

Cambiare il terreno dopo aver osservato la crescita e poi ogni tre giorni fino a raggiungere la confluenza cellulare. Per l'immunofenotipizzazione, incubare entrambi i tipi di PSC D con anticorpi coniugati PE o FITC per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Quindi aggiungi le visualizzazioni PBS e centi a 1.200 RPM per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e il resus, sospendere la piastra in PBS e infine valutare i marcatori di superficie utilizzando la sottocoltura del citometro a flusso, entrambi i tipi di DPC per tre passaggi. Quindi tripsin ghiaccio e trasferirli in sei piastre di coltura rossa al 60% di fluenza di Co sostituire il PM con un mezzo odontogeno. Tre pozzi rimangono come controllo negativo aggiungendo pm.

Sostituire il fluido ogni tre giorni alle celle di lavaggio del giorno 21 con PBS. Quindi fissarli di un millilitro per pozzetto. 10% di altezza formale del gel per 15 minuti a temperatura domestica.

Dopo 15 minuti, rimuovere con cura il fissativo e avvolgere le celle tre volte con acqua distillata. Quindi sostituire l'acqua con un millilitro per alza rosso in soluzione di macchia rossa. Dopo 20 minuti, rimuoviamo il colorante in eccesso e laviamo le celle quattro volte con acqua deionizzata.

Quindi aggiungere un millimetro per ogni acqua di pozzo per evitare che le celle si secchino. Dopo la colorazione, è possibile vedere tre binari verso l'alto diventare rossi rispetto ai controlli al microscopio, è possibile vedere l'assorbimento del colore della discolorazione intorno alla cellula con un grande ingrandimento per la quantificazione di una colorazione rossa. Dopo aver tolto l'acqua, aggiungere un millilitro per pozzetto, acido acido al 10%, quindi incubare per 30 minuti agitando.

Quindi raschiare delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un raschietto cellulare. Quindi trasferirli nelle provette separate. VOR impiega vigorosamente per 30 secondi.

Quindi scaldarli a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Per evitare l'evaporazione delle provette di tenuta con la provetta di trasferimento ParaView per congelare per cinque minuti, si consiglia di utilizzarle a 20.000 G per 15 minuti. Nel frattempo, fare la diluizione seriale standard del rosso Alzheimer secondo il protocollo regionale.

Dopo la centrifugazione, rimuovere le mecce e trasferirle nelle nuove provette. Neutralizzare il pH con idrocita di ammonio al 10%. Quindi aggiungi gli standard e anche i campioni in 96.

Posizionare il pozzo e quindi misurare l'assorbanza a 405 nanometri e analizzare i dati secondo la diluizione seriale standard. Qui si possono vedere i DPC, che sono isolati dalla dissociazione enzimatica il giorno 10, 15 e 18, e anche i DPC cresciuti il giorno quinto, 10, 13 e 18. Entrambi i tipi di dpss in sase tre sono quasi nella stessa dimensione e morfologia I risultati dell'immunofenotipizzazione mostrano la presenza di marcatori di cellule staminali mesenchimali come CD 44, CD 73 e CD 19 e l'assenza di marcatori ematopoietici ed endoteliali come CD 34, CD 45 e CD 11 B.È interessante notare che le espressioni di CD 1 0 5 e CD 146 sono più nelle PSC d cresciute rispetto a D-P-S-C-E-D, la quantificazione della colorazione enzimatica con rosso il giorno 21 della differenziazione degli odontoblasti mostra una maggiore deposizione di calcio in D-P-S-C-E-D rispetto a senza la parte superiore delle cellule staminali.

I risultati della QPCR indicano anche espressioni significativamente più elevate di MEP e A LP come marcatori di mineralizzazione in D-P-S-C-D rispetto all'estrazione dentale delle cellule staminali. Nel frattempo, entrambi i geni sono regolati durante il differenziamento e anche l'espressione di DSPP poiché il marcatore odontogeno aumenta durante il differenziamento. Tuttavia, non vi è alcuna variazione significativa nell'espressione di DSVP nelle cellule differenziate tra i gruppi ED e OG.

Vi abbiamo appena mostrato come isolare le cellule staminali delle parti dentali umane utilizzando la dissociazione enzimatica della polpa o la crescita delle cellule staminali dal tessuto. Quindi questo è tutto. Ti auguro buona fortuna per provare a utilizzare questa procedura nel tuo esperimento.

Grazie.