Name: Sviluppo e caratterizzazione di In Vitro Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale Ca 2+ i E ossido nitrico Produzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri come sviluppare microdispositivi per colture di cellule endoteliali HUVEC in condizioni fisiologiche di flusso. Questo metodo consente di misurare in tempo reale le variazioni di calcio intracellulare e la produzione di ossido nitrico in risposta all'ATP.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL56237, National Institute of Diabetes e Digestiva e Malattie renali Istituto DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1.227.359 e EPS-1003907).

1. fabbricazione di dispositivi Microfluidic <ol><li> Fotolitografia di fabbricazione standard di un SU-8 50 Master Mold <ol><li> Pulire il wafer di silicio prima spin-coating. Risciacquare un wafer di silicio 2 pollici nudo con acetone per 15 min seguito da alcol isopropilico (IPA) per 15 min. Disidratare il wafer ponendolo su una piastra riscaldante a 150 ° C per 1 ora. Dopo la disidratazione, raffreddare il wafer a temperatura ambiente. </li><li> Spin-coat wafer di silicio con SU-8 fotosensibile. Aggiungere 2 ml di SU-8 photoresist sul wafer. Rampa wafer a 500 rpm a 100 rpm accelerazione / sec per 10 sec, seguita da 1,000 rpm a 300 rpm accelerazione / sec per 30 sec. (Vedi Supplemental Video 1) </li><li> Pre-cuocere il wafer su una piastra calda a 65 ° C per 10 minuti, quindi cuocere morbido a 95 ° C per 30 min. </li><li> Utilizzare l&#39;esposizione UV a trasformare il modello progettato da una maschera film al photoresist spin-rivestito. Stampa il modello su una sottile pellicola trasparente come maschera film. Posizionare la maschera pellicola sulla parte superiore dellaspin-rivestito photoresist ed esporre a UV con una dose di 300 mJ / cm 2. (Vedi Supplemental Video 2) Nota: In questo protocollo, il modello di rete di microcanali (159 micron canali madre ampie ramificazioni in quattro canali 100 micron figlia di larghezza) è stato progettato con il software CAD. Il modello sul film mostra come campo chiaro e il resto del film è coperta da inchiostro nero. Poiché SU-8 è un fotoresist negativo, la porzione del photoresist che è esposta al UV sarà reticolato e diventa insolubile al solvente durante lo sviluppo stampo (fase 1.1.6). Dopo lo sviluppo, questa porzione insolubile replicherà il pattern rete progettata e servire come stampo master. </li><li> Post-bake il wafer esposta su una piastra calda a 65 ° C per 1 min, quindi 95 ° C per 10 min. </li><li> Sviluppare lo stampo master. Utilizzare SU-8 sviluppatore come solvente per rimuovere il photoresist non-reticolato. Immergere il wafer di SU-8 sviluppatore per 3 minuti e risciacquare con IPAper 1 min. </li><li> Ripetere questo ciclo di sviluppo di 2-3 volte fino a quando non si ha formazione striscia bianca (residuo di fotoresist non curata) dopo il risciacquo IPA. asciugare delicatamente il wafer con azoto ed esaminare le caratteristiche minori del modello sotto un microscopio. Ripetere i cicli di sviluppo supplementari, se necessario. </li><li> Duro cuocere il wafer su una piastra calda a 150 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> litografia soft <ol><li> mescolare manualmente le due parti (base e induritore) di polidimetilsilossano (PDMS) elastomero ad un peso. rapporto di 10: 1. </li><li> De-gas miscela PDMS con un essiccatore collegata con un vuoto casa per 15 min. Gettate la soluzione PDMS sullo stampo maestro fotosensibile. Lo spessore del PDMS deve essere superiore a 3 mm a fornire una tenuta stabile del tubo di ingresso / uscita. De-gas PDMS ancora per 15 min, e rimuovere le bolle d&#39;aria restanti con azoto gassoso, se necessario. Curare il PDMS fuse in un forno a 65 ° C per 3 ore. </li><li> Pulire la superficie diil vetrino di vetro con un nastro adesivo e un pulitore di plasma (trattamento al plasma 30 sec). Spin-coat PDMS ONU cured (0,5 ml) sul vetrino di vetro di rampa a 4.000 rpm a velocità di accelerazione / sec 500 rpm per 30 sec. Curare il PDMS spin-rivestite coprioggetto in stufa a 65 ° C per almeno 30 min. </li><li> Tagliare e rilasciare i PDMS curato dallo stampo master. Quindi creare un ingresso ed una uscita con ± 1 mm perforatrice di diametro in corrispondenza dell&#39;estremità distale dei canali madre. </li><li> Incollare il dispositivo al vetrino di vetro PDMS spin-rivestito. Ossidare le superfici delle PDMS e il vetrino coprioggetto con un pulitore plasma per 1 min. Dopo il trattamento al plasma di ossigeno, posizionare una goccia di acqua deionizzata (acqua deionizzata) sulla superficie di incollaggio, e posizionare le due parti insieme. Cuocere il dispositivo in un forno a 65 ° C per 30 minuti per ottenere un legame permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Supplemental Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Supplemental Video 1 (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Supplemental Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Supplemental Video 2 (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> 2. cellule endoteliali da semina e cultura <ol><li> Sterilizzazione dispositivi e fibronectina Coating <ol><li> Conservare la proprietà idrofoba della superficie PDMS intorno all&#39;ingresso / uscita dall&#39;ossidazione. Coprire la superficie PDMS intorno entrata e uscita con piccole strisce di nastro adesivo per prevenire l&#39;ossidazione. Questa procedura può impedire all&#39;acqua DI diffusione su tutta la superficie superiore del dispositivo durante la fase di riempimento (2.1.3). </li><li> Trattare il dispositivo PDMS con plasma di ossigeno for 5 min per cambiare la superficie da idrofila, quindi facilitare il flusso di fluido attraverso il microcanali e prevenire la bolla intrappolando nella procedura di riempimento (2.1.3). </li><li> Utilizzare una siringa con un ago inserito o una pipetta per riempire il dispositivo con acqua deionizzata dall&#39;ingresso. Continuare il riempimento fino a quando c&#39;è una goccia d&#39;acqua DI (30-50 ml) accumulato in uscita. Esaminare il dispositivo al microscopio per controllare se ci sono la formazione di bolle all&#39;interno del microcanali. Rimuovere la goccia d&#39;acqua eccessiva in ingresso ed uscita con un fazzoletto di carta. </li><li> Sterilizzare il dispositivo in una capsula di Petri con UV per un minimo di 3 ore in una cappa di biosicurezza laminare. Per evitare l&#39;evaporazione, coprire l&#39;ingresso / uscita con un sottile pezzo di PDMS, mettere un fazzoletto di carta umida all&#39;interno del piatto, e avvolgere il piatto con Parafilm. </li><li> Rivestire il dispositivo con fibronectina. Risciacquare il primo dispositivo con tampone fosfato salino (PBS), poi ricoprirlo con 100 ug / ml fibronectina notte in frigorifero (4 ° C). Mettere una goccia di soluzione in ingresso, e quindi creare una pressione negativa in uscita con un vuoto casa, una siringa con un ago o una pipetta. </li><li> Riempire il dispositivo con mezzi di coltura cellulare. Risciacquare il dispositivo con PBS manualmente per 3 volte prima di caricare i supporti di coltura cellulare. Riscaldare il dispositivo in un incubatore a 37 ° C. </li></ol></li><li> EC semina e la perfusione a lungo termine Nota: confronto con la cultura 2D CE statico convenzionale, il modello di rete microvasi in vitro con perfusione continua fatto nell&#39;ambiente di coltura cellulare più vicino alle condizioni in vivo. Il vitro di rete in microvasi dimostrato in questo protocollo può essere mantenuta fino a due settimane. La perfusione ben controllati continuamente riempire le sostanze nutrienti, rimuovere i rifiuti, e impedire un eccesso di confluenza del monostrato CE. Pertanto, può essere esteso ad un studi a lungo termine, mimando l&#39;ambiente cellulare ed emodinamica sotto diversi Physiological e condizioni patologiche. <ol><li> Mescolare HUVECs primarie in terreni di coltura HUVEC (MCDB 131) con l&#39;8% destrano (Peso Mol 70.000). Il destrano è usato per aumentare la viscosità dei mezzi di carico e ottenere un migliore risultato semina cellulare. La densità raccomandata è di circa 2-4 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Seme le cellule nel dispositivo. Mettere una goccia 10-20 ml di cellule oltre l&#39;ingresso. Introdurre una leggera corrente da uno inclinando il dispositivo o azione capillare usando una pipetta Pasteur di vetro in uscita. La chiave per un carico cella successo è quello di controllare la velocità di flusso inferiore a 1 mm / sec all&#39;interno dei canali più piccoli. </li><li> Controllare la semina delle cellule. Dopo la semina iniziale, incubare il dispositivo per 15-20 min (atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C) prima di verificare lo stato di semina al microscopio. Se necessario, effettuare il caricamento delle cellule addizionali per ottenere una densità cellulare desiderato. </li><li> Lavare delicatamente il dispositivo con terreno di coltura cellulare (37° C) per rimuovere il destrano. Culture del dispositivo in assenza di flusso per la prima 6 ore in un incubatore (5% CO 2 a 37 ° C). </li><li> Impostare la connessione tubi per perfusione a lungo termine. Nastro il dispositivo in una capsula di Petri per impedire il movimento. Creare piccoli fori sul coperchio della scatola di Petri per inserimenti di aspirazione e tubo di uscita. Collegare il tubo di ingresso ad una siringa con un ago per la coltura cellulare mezzi di perfusione. Collegare il tubo di uscita ad un raccoglitore. Nota: posizionare il dispositivo e il collettore rifiuti in un incubatore di coltura cellulare, pur ponendo una pompa di perfusione di fuori dell&#39;incubatore e collegarlo al dispositivo dal lungo tubo di ingresso. Il tasso di perfusione è determinato dal disegno sperimentale. Nel presente dispositivo, utilizzare un tasso di perfusione di 0,35 microlitri / min e una gamma sollecitazione di taglio tra 1-2 dyne / cm 2. In questa condizione di perfusione, i HUVECs raggiungono confluenza in circa 3-4 giorni. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent colorazione <ol><li> Fissare la EC nel dispositivo mediante perfusione del 2% paraformaldeide per 30 minuti a 4 ° C, seguita da 1x PBS risciacquo a temperatura ambiente per 15 min e 1% BSA blocco per 30 min. Utilizzare una velocità di perfusione che è lo stesso di quello usato per la coltura cellulare. </li><li> Permeabilize l&#39;EC fissato per colorazione anticorpale con 0,1% Triton X-100. Profumato il dispositivo con Triton per 5-7 minuti per l&#39;etichetta VE-caderina, e 3 minuti per l&#39;etichetta F-actina. </li><li> Caricare gli anticorpi nel dispositivo. Profumato il dispositivo con 1x PBS per 15 minuti per lavare le soluzioni precedenti. caricare manualmente l&#39;anticorpo primario contro VE-caderina (anti-capra) nel dispositivo alla concentrazione di 2 mg / ml (volume totale è 20-50 microlitri). Conservare il dispositivo in frigorifero a 4 ° C durante la notte. Profumato l&#39;anticorpo secondario (asino anti-capra) da una pompa a siringa alla concentrazione di 7 mg / ml per 45-60 min. </li><li> Etichetta CE F-actina con falloidina. Profumato il dispositivo con fo PBS 1Xr 15 min prima di caricare manualmente phalloidin (10 ug / ml) per 7-10 min. </li><li> Label nuclei CE (v Lista dei materiali). </li><li> Risciacquare il dispositivo con PBS 1x e mantenerla a 4 ° C fino imaging. </li></ol> 4. imaging di fluorescenza del endoteliali [Ca 2+] i <ol><li> Profumato il dispositivo con albumina (10 mg / ml) di soluzione -Ringer per 15 min a 37 ° C. Utilizzare lo stesso tasso di perfusione di quello usato per la coltura cellulare. Le concentrazioni di tutti i componenti della soluzione di albumina-Ringer sono descritti nella Lista dei materiali. </li><li> Impostare sistema confocale per CE [Ca 2+] i di imaging con fluo-4 del mattino. Utilizzare un sistema microscopico confocale per Ca 2+ imaging. Utilizzare un laser ad argon (488 nm) per l&#39;eccitazione e impostare la banda di emissione come 510-530 nm. Raccogliere le immagini con un obiettivo 25X (immersione in acqua, NA: 0,95) a 512 x 512 formato di scansione. Utilizzare un z-passo di 2 micron e un intervallo di scansione per ogni pila di imaghi di 20 sec. </li><li> Profumato il dispositivo con fluo-4 AM (5 micron) per 40 min a 37 ° C, poi lavare il lume fluo-4:00 con la soluzione di albumina Ringer. </li><li> Acquisire le immagini di microvasi fluo-4 caricato. Raccogliere le immagini di base per 10 min. Profumato il dispositivo con ATP (10 pM) e registrare le variazioni di intensità di fluorescenza (FI) per 20 min. </li></ol> 5. imaging di fluorescenza di ossido nitrico Produzione <ol><li> Profumato il dispositivo con la soluzione di albumina Ringer per 15 min. Utilizzare una velocità di perfusione che è lo stesso di quello usato per la coltura cellulare. </li><li> Impostare il sistema di imaging di fluorescenza per misurare la produzione di ossido nitrico ATP-indotta. Utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera CCD digitale a 12 bit ed un otturatore controllato da computer per la misurazione dell&#39;ossido nitrico. Utilizzare una lampada allo xeno 75 W come fonte di luce. Nota: selezionare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di emissione per il DAF-2 DA da un filtro di interferenza (480/40 nm) e uno specchio dicroico(505 nm) con una barriera passa-banda (535/50 nm). Utilizzare una lente obiettivo 20X (NA: 0,75) per raccogliere le immagini. Per minimizzare photobleaching, posizionare un filtro a densità neutra (0,5 N) di fronte al filtro di interferenza e limitare il tempo di esposizione a 0,12 sec. </li><li> Caricare le cellule con DAF-2 DA (5 micron). Profumato il dispositivo con DAF-2 DA per circa 35-40 minuti a 37 ° C. Registrare la linea di base del DAF-2 intensità di fluorescenza (FI DAF) dopo il caricamento iniziale. Nota: DAF-2 DA è continuamente presente nel perfusato tutto l&#39;esperimento 7. </li><li> Raccogliere DAF-2 immagini. Registrare la base di FI DAF per 5 min. Profumato il dispositivo con l&#39;ATP (10 micron) e raccogliere le immagini per 30 minuti con intervalli di 1 minuto. Raccogliere tutte le immagini dello stesso gruppo di celle nello stesso piano focale. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Selezionare manualmente la regione di interesse (ROI) dalle immagini raccolte a livello di singola cellula. OgniROI copre l&#39;area di una cella singola che può essere indicata dal contorno fluorescenza. </li><li> Sottrarre fluorescenza di fondo e calcolare la media di ciascun FI ROI. </li><li> Misurare le variazioni ATP-indotti in CE [Ca 2+] i e la produzione di NO. Quantificare i cambiamenti ATP-indotti in CE [Ca 2 +] i calcolando le variazioni di Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, dove 0 è la FI FI media al basale durante albumina-Ringer perfusione prima di aggiungere ATP) meno la misura sfondo. Quantificare NO tasso di produzione conducendo la prima conversione differenziale del FI DAF nel corso del tempo. Nota: La durata di FI DAF rappresenta una produzione di NO cumulativo con il tempo. Pertanto, NO tasso di produzione è calcolato sulla base del profilo di FI DAF sotto basale e stimolata ATP condizioni. Dettagli di analisi dei dati e procedure sperimentali sono stati descritti in una precedente pubblicazione 7. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione o conflitto di interessi da dichiarare.

<html> In questo articolo, presentiamo protocolli dettagliati per lo sviluppo della rete dei microvasi colta, la caratterizzazione di giunzioni CE e citoscheletro distribuzione F-actina, e le misurazioni quantitative della CE [Ca 2+] i e la produzione di NO utilizzando un dispositivo di microfluidica. Il dispositivo microfluidico perfuso fornisce un modello in vitro che consente uno stretto simulazione delle geometrie microvascolari in vivo e condizioni di flusso shear. Dal momento...

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio 1,2. La tecnologia microfluidica consente un fluido controllato con precisione attraverso un microscala geometricamente vincolata (sub-millimetrica) canali 3, che prevede la possibilità per le cellule in coltura, in particolare per ECS vascolare, di crescere in condizioni di flusso desiderate. Queste caratteristiche rendono le condizioni di coltura cellulare più vicino a in vivo rispetto alle tradizionali, colture cellulari statiche 2D. Sono estremamente importante quando i dispositivi microfluidici sono utilizzati per modellare diversi tipi di vasculatures e studiare risposte CE verso stimoli meccanici e / o chimici. Nonostante i vantaggi dimostrati dalla rete microcanali su una coltura cellulare statica, l&#39;adattamento e l&#39;applicazione di microfluidica in f biomedicoield rimangono limitati. Segnalato da una recente revisione, la maggior parte delle pubblicazioni del settore (85%) sono ancora in riviste di ingegneria 4. Le prestazioni di dispositivi microfluidici non è stato abbastanza convincente per la maggior parte dei biologi di passare dalle tecniche attuali, come il test Transwell e la cultura piatto / vetro macro-scala scorrevole a questo dispositivo miniaturizzato. Microfluidica è un campo multidisciplinare, che richiede collaborazioni interdisciplinari per spostare questo campo in avanti. L&#39;obiettivo di questo articolo tecnico è quello di ridurre il divario di conoscenze tra le discipline e rendere le procedure di fabbricazione comprensibili da biologi, fornendo applicazioni biologiche e validazione funzionale dei microvasi microfluidica. I protocolli sperimentali visualizzati includono la fabbricazione di entrambi i dispositivi microfluidici e la loro utilità biologici, che rappresenta una stretta collaborazione tra gli ingegneri e biologi. Recentemente abbiamo riportato alcuniapplicazioni biologiche che utilizzano la rete dei microvasi in vitro con dispositivo di microfluidica 5. Per progettare opportunamente le dimensioni della rete microcanali e applicare la sollecitazione di taglio desiderata, un modello numerico è stato costruito con software fluidodinamica computazionale per stimare vicino il profilo di flusso. Primarie vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) che sono state seminate nei microcanali raggiunti confluenza, cioè copriva l&#39;intera superficie interna del microcanale, in 3-4 giorni con perfusione continua. La formazione barriera corretta è stata dimostrata da VE-caderina colorazione e confrontati con quelli formati in condizioni di coltura cellulare statiche e in microvasi intatti. Applicando i protocolli sperimentali sviluppati in microvasi intatti perfuse singolarmente 6-8, abbiamo misurato quantitativamente le variazioni CE [Ca 2+] i e ossido nitrico (NO) in risposta ad adenosina trifosfato (ATP) con fluorescentedicatori e confocale e microscopia a fluorescenza convenzionale. L&#39;agonista-indotta aumenti CE [Ca 2+] i e la produzione di NO sono stati segnalati come necessari segnali intracellulari per infiammatorie aumenta mediatore indotte permeabilità microvascolare 6-15. Anche se alcuni studi precedenti hanno mostrato immagini di dispositivi microfluidici DAF-2 DA caricati 16,17, la risoluzione e dati appropriati analisi non aveva ancora raggiunto 18. A nostra conoscenza, questo studio dimostra le prime misurazioni quantitative di cambiamento dinamico agonisti indotta endoteliale I e produzione di NO che utilizza microfluidica sistema [2+ Ca] based. Tecniche di microfabbricazione hanno la flessibilità per fabbricare microcanali fino a pochi micron e consentire lo sviluppo di modelli complessi per simulare le geometrie del microcircolo in vivo. Qui abbiamo presentato una tipica rete a microcanali con tre livelli di ramificazione. Questorete è fabbricato dalla combinazione di fotolitografia che viene eseguita in una camera sterile microfabbricazione e litografia soft.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di cervello bovino (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG (H+L) Anticorpo secondario</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (colorazione dei nuclei)&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Vetro Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Soluzione salina tamponata</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ingrediente</td><td></td><td></td><td></td>soluzione di ringer per mammiferi</tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientifico</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O (1,2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (5,5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5,0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9,1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10,9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Colture Tecnologie per</td><td>la media vita</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>paraformaldeide</td><td>Scienze 15710</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina (colorazione F-actina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 fotoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore SU-8</td><td></td><td></td> Fiasche per colture tissutali MicroChem Y020100 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione neutralizzante della tripsina</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Tubo microforo in PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-caderina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>Nome dell'attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Biosafety Cappa laminare</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Classe II, Tipo A2</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Forno Isotemp</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Litografia banco</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Litografia</td><td></td>a contatto</tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Otturatore per la telecamera CCD</td><td>Strumento Sutter Lambda</td><td>10-2</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>PVA TePla / Harrick plasma</td><td>M4L / PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pompe a siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>Nome del software</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>software di simulazione CD</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Acquisizione e analisi di immagini per la produzione di NO&nbsp;</td><td>Metafluor</td><td></td> <td>di imaging universale</td></tr></tbody></table>

sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; in vitro</em&gt; microvasi rete e misurazioni quantitative di endoteliale [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; e ossido nitrico produzione

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio. Sebbene lo sviluppo di dispositivi microfluidici è stato abbracciato dagli ingegneri più di due decenni, le loro applicazioni biologiche rimangono limitati. Un modello in vitro microvasi più fisiologicamente rilevanti convalidato da applicazioni biologiche è importante per far avanzare il campo e colmare il divario tra in vivo e in vitro. Qui, presentiamo procedure dettagliate per lo sviluppo della rete microrecipiente coltivate utilizzando un dispositivo microfluidico con una capacità di perfusione a lungo termine. Abbiamo anche dimostrare le sue applicazioni per misurazioni quantitative dei cambiamenti agonisti indotte CE [Ca 2 +] i e l&#39;ossido nitrico (NO) la produzione in tempo reale utilizzando confocale e microscopia a fluorescenza convenzionale. La rete dei microvasi formatolavoro con perfusione continua mostrato giunzioni ben sviluppati tra EC. Distribuzione VE-caderina era più vicino a quello osservato nei microvasi intatti di monostrati CE staticamente in coltura. ATP-indotta aumenti transitori in CE [Ca 2+] i e la produzione di NO sono stati quantitativamente misurata a livello individuale cellulari, che ha convalidato la funzionalità dei microvasi in coltura. Questo dispositivo microfluidico consente EC di crescere sotto una ben controllata, flusso fisiologicamente rilevanti, il che rende l&#39;ambiente di coltura cellulare più vicino in vivo rispetto che nelle culture 2D convenzionali, statiche. Il disegno di rete microcanali è altamente versatile, e il processo di fabbricazione è semplice e ripetibile. Il dispositivo può essere facilmente integrato nel sistema microscopica confocale o convenzionale consentendo imaging ad alta risoluzione. Più importante, perché la rete microrecipiente coltura può essere formata da ECS umani primari, questo approccio servirà come strumento utile per studiare comepatologicamente emocomponenti alterati da campioni di pazienti influenzano EC umane e forniscono informazioni sulle problematiche cliniche. Anche può essere sviluppato come piattaforma per lo screening di droga.

Questa sezione mostra alcuni dei risultati ottenuti con la rete microrecipiente coltura sviluppata con questo protocollo. Il modello microcanali è una ramificazione rete a tre livelli (Figura 1A). In questo disegno, a 159 micron di larghezza rami del canale madre in due 126 micron canali di larghezza, e rami di nuovo in quattro canali 100 micron figlia di larghezza. Una simulazione numerica 3D è stato eseguito per stimare le distribuzioni di sollecitazione di taglio sott...

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un dispositivo microfluidico che permetta alle cellule endoteliali di crescere sotto un flusso di taglio fisiologicamente rilevante e di misurare le variazioni indotte dall'agonista nella produzione di calcio e ossido nitrico. Questo approccio può contribuire a far progredire la ricerca sui microvasi, validando il modello di microvaso in vitro e colmando le lacune tra studi in vivo e in vitro. I principali vantaggi di questa tecnica sono la progettazione versatile dei microcanali, che permette di mimare diversi tipi di vascolarizzazione, e il miglioramento dell'ambiente di coltura cellulare, che si avvicina di più alle condizioni in vivo rispetto alle colture statiche convenzionali.Le procedure saranno dimostrate da Sulei e Xiang, i due del mio laboratorio. Prima di iniziare, utilizzare la fotolitografia standard per creare uno stampo master e la litografia morbida per fabbricare i dispositivi a microcanale in PDMS come descritto nel protocollo testuale. Per preparare i dispositivi a microcanale, coprire innanzitutto l'ingresso e l'uscita con un sottile pezzo di PDMS e posizionare il dispositivo all'interno di una piastra di Petri con un tessuto umido.Quindi, avvolgere la piastra con Parafilm e sterilizzare il dispositivo sotto luce UV per almeno tre ore. Il passo successivo consiste nell'applicare la fibronectina. Per prima cosa, aggiungere una goccia di 30-50 microlitri di PBS all'ingresso.Crea un vuoto all'uscita per risciacquare il dispositivo. Successivamente, posiziona una goccia di fibronectina a 100 microgrammi per millilitro all'ingresso. Crea un vuoto all'uscita per caricare la soluzione di fibronectina.Successivamente, coprire l'ingresso e l'uscita. Avvolgere nuovamente la piastra con Parafilm e incubare il dispositivo durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, risciacquare manualmente il dispositivo con PBS per tre volte.Quindi, caricarlo con 30-50 microlitri di mezzo di coltura cellulare e riscaldare il dispositivo in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Iniziare mescolando le HUVEC nel mezzo di coltura per HUVEC con l'8 percento di Dextrano a una concentrazione di due-quattro milioni di cellule per millilitro. Il Dextrano è necessario per aumentare la viscosità e migliorare così il seeding cellulare.Successivamente, aggiungere 10-20 microlitri di cellule sull'ingresso e introdurle per gravità o sfruttando l'azione capillare di una pipetta Pasteur di vetro posizionata sull'uscita. Successivamente, incubare il dispositivo per 15-20 minuti. Quindi, verificare lo stato di semina al microscopio.Se necessario, caricare ulteriori cellule per raggiungere la densità cellulare desiderata. Una volta caricato un numero sufficiente di cellule, risciacquare delicatamente il dispositivo con del mezzo di coltura cellulare normale e tiepido per rimuovere la destrana. Successivamente, coltivare il dispositivo senza alcuna perfusione di mezzo per sei ore.Successivamente, preparare i collegamenti dei tubi per la perfusione a lungo termine. Fissare il dispositivo a una piastra di Petri e collegare il tubo di ingresso a una siringa con ago. Inserire i tubi sia nell'ingresso che nell'uscita del dispositivo.Collegare il tubo di uscita a un raccoglitore di scarto. Posizionare ora la piastra e il contenitore per gli scarti in un incubatore. Collegare la siringa con un lungo tubo di ingresso a una pompa per fusione esterna che passa attraverso la porta dell'incubatore.Quindi, impostare la velocità di perfusione in base al disegno sperimentale. Con una perfusione ben controllata, la coltura all'interno della rete microvascolare può essere mantenuta fino a due settimane. Pertanto, è possibile estendere l'approccio a studi a lungo termine che simulano l'ambiente cellulare e emodinamico in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.Per iniziare la colorazione immunoistochimica, come l'etichettatura di VE-cadherina, fissare innanzitutto le cellule mediante perfusione con paraformaldeide al due percento per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo una serie di passaggi di perfusione per il blocco, la permeabilizzazione e la colorazione con anticorpi, mantenere il dispositivo a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione delle immagini delle cellule. Per acquisire l'immagine della concentrazione di calcio all'interno delle cellule, effettuare la perfusione del dispositivo con 10 milligrammi per millilitro di albumina in soluzione di Ringer per 15 minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, perfondere il dispositivo con Fluo-4 AM a cinque micromolare per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, rimuovere con un lavaggio il Fluo-4 AM legato alla parete del lume utilizzando Ringer albuminato per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, avviare il sistema confocale per l'acquisizione di immagini dei livelli di calcio intracellulare con Fluo-4 AM. Acquisire immagini dei microvasi caricati con Fluo-4.Acquisire le immagini di base per 10 minuti. Successivamente, perfondere il dispositivo in modo continuo con ATP 10 micromolare e registrare le variazioni dell'intensità di fluorescenza per 20 minuti. Per acquisire l'immagine della produzione di ossido nitrico nelle cellule, perfondere il dispositivo con Ringer albuminato per 15 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi, perfondere le cellule con DAF-2 DA 5 micromolare per circa 35-40 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, impostare il sistema di imaging a fluorescenza per misurare la produzione di ossido nitrico indotta da ATP. Registrare il valore basale per 5 minuti, quindi perfondere il dispositivo con ATP 10 micromolare e raccogliere le immagini per 30 minuti a intervalli di un minuto.Per la misurazione dell'ossido nitrico cellulare, è importante comprendere che l'adattatore di distacco per il profilo di intensità rappresenta una produzione cumulativa di ossido nitrico nel tempo e non una concentrazione di ossido nitrico. Selezionare manualmente le regioni di interesse dalle immagini raccolte a livello cellulare individuale. Ogni ROI copre l'area di una singola cellula, che può essere indicata dal contorno di fluorescenza.Quantificare le variazioni di calcio endoteliale e ossido nitrico indotte dall'ATP. Calcolando le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4, sottratta al fondo del tessuto. Quantificare la velocità di produzione di ossido nitroso effettuando la derivata prima della variazione dell'intensità di fluorescenza di DAF-2 nel tempo.Il modello di microcanali nel dispositivo presenta una rete ramificata a tre livelli. È stata eseguita una simulazione numerica 3D per stimare le distribuzioni dello sforzo di taglio a una portata di 0,35 microlitri al minuto. Le cellule endoteliali sono state seminate nella rete come descritto.Successivamente, l'F-actina e i nuclei sono stati marcati. Analogamente, anche la VE-cadherina è stata colorata. I risultati sono risultati simili all'espressione di VE-cadherina in una venula integra.Successivamente, sono stati esaminati gli aumenti di calcio intracellulare e la produzione di ossido nitrico indotti da ATP. I livelli di calcio sono stati analizzati utilizzando Fluo-4 AM come descritto nella sezione del protocollo. La produzione di ossido nitrico è stata monitorata utilizzando DAF-2 DA come descritto nella sezione del protocollo.I risultati erano paragonabili a quelli ottenuti con venule integre perfuse singolarmente. Il metodo è stato semplice e rigorosamente controllato in condizioni biologiche e in ambienti fluidi dinamici, condizioni che non sarebbero state possibili con tecniche microchirurgiche convenzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare il dispositivo e come effettuare misurazioni del calcio e dell'ossido nitrico.Dopo che questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, non solo per indagare gli effetti indotti dall'agonista, ma anche per ampliare le applicazioni nella ricerca biomedica.

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Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Il saggio di formazione del tubo è un metodo veloce e quantificabili per misurare l'angiogenesi in vitro. Le cellule endoteliali sono combinati con i media condizionati e piastrate su estratto di membrana basale. Formazione del tubo avviene entro ore e tubuli appena formati facilmente quantificabile.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari.  Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Questo protocollo descrive in dettaglio un test in vitro per misurare l'assorbimento lipidico cellulare nelle cellule endoteliali dopo stimolazione con analoghi fluorescenti BODIPY-C12 e BODIPY-C16 di acidi grassi saturi a catena lunga e molto lunga. Questo metodo è efficiente e adattabile ad altri tipi di cellule, offrendo un approccio utile per lo studio del metabolismo dei lipidi.

Quantificazione dell'assorbimento endoteliale degli acidi grassi mediante analoghi fluorescenti degli acidi grassi

Scopri come sviluppare microdispositivi per colture di cellule endoteliali HUVEC in condizioni fisiologiche di flusso. Questo metodo consente di misurare in tempo reale le variazioni di calcio intracellulare e la produzione di ossido nitrico in risposta all'ATP.

Sviluppo e caratterizzazione di In Vitro Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale Ca 2+ i E ossido nitrico Produzione (Video) | JoVE Journal

Sviluppo e caratterizzazione di

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