Sviluppo e caratterizzazione di

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un dispositivo microfluidico che permetta alle cellule endoteliali di crescere sotto un flusso di taglio fisiologicamente rilevante e di misurare le variazioni indotte dall'agonista nella produzione di calcio e ossido nitrico. Questo approccio può contribuire a far progredire la ricerca sui microvasi, validando il modello di microvaso in vitro e colmando le lacune tra studi in vivo e in vitro. I principali vantaggi di questa tecnica sono la progettazione versatile dei microcanali, che permette di mimare diversi tipi di vascolarizzazione, e il miglioramento dell'ambiente di coltura cellulare, che si avvicina di più alle condizioni in vivo rispetto alle colture statiche convenzionali.

Le procedure saranno dimostrate da Sulei e Xiang, i due del mio laboratorio. Prima di iniziare, utilizzare la fotolitografia standard per creare uno stampo master e la litografia morbida per fabbricare i dispositivi a microcanale in PDMS come descritto nel protocollo testuale. Per preparare i dispositivi a microcanale, coprire innanzitutto l'ingresso e l'uscita con un sottile pezzo di PDMS e posizionare il dispositivo all'interno di una piastra di Petri con un tessuto umido.

Quindi, avvolgere la piastra con Parafilm e sterilizzare il dispositivo sotto luce UV per almeno tre ore. Il passo successivo consiste nell'applicare la fibronectina. Per prima cosa, aggiungere una goccia di 30-50 microlitri di PBS all'ingresso.

Crea un vuoto all'uscita per risciacquare il dispositivo. Successivamente, posiziona una goccia di fibronectina a 100 microgrammi per millilitro all'ingresso. Crea un vuoto all'uscita per caricare la soluzione di fibronectina.

Successivamente, coprire l'ingresso e l'uscita. Avvolgere nuovamente la piastra con Parafilm e incubare il dispositivo durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, risciacquare manualmente il dispositivo con PBS per tre volte.

Quindi, caricarlo con 30-50 microlitri di mezzo di coltura cellulare e riscaldare il dispositivo in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Iniziare mescolando le HUVEC nel mezzo di coltura per HUVEC con l'8 percento di Dextrano a una concentrazione di due-quattro milioni di cellule per millilitro. Il Dextrano è necessario per aumentare la viscosità e migliorare così il seeding cellulare.

Successivamente, aggiungere 10-20 microlitri di cellule sull'ingresso e introdurle per gravità o sfruttando l'azione capillare di una pipetta Pasteur di vetro posizionata sull'uscita. Successivamente, incubare il dispositivo per 15-20 minuti. Quindi, verificare lo stato di semina al microscopio.

Se necessario, caricare ulteriori cellule per raggiungere la densità cellulare desiderata. Una volta caricato un numero sufficiente di cellule, risciacquare delicatamente il dispositivo con del mezzo di coltura cellulare normale e tiepido per rimuovere la destrana. Successivamente, coltivare il dispositivo senza alcuna perfusione di mezzo per sei ore.

Successivamente, preparare i collegamenti dei tubi per la perfusione a lungo termine. Fissare il dispositivo a una piastra di Petri e collegare il tubo di ingresso a una siringa con ago. Inserire i tubi sia nell'ingresso che nell'uscita del dispositivo.

Collegare il tubo di uscita a un raccoglitore di scarto. Posizionare ora la piastra e il contenitore per gli scarti in un incubatore. Collegare la siringa con un lungo tubo di ingresso a una pompa per fusione esterna che passa attraverso la porta dell'incubatore.

Quindi, impostare la velocità di perfusione in base al disegno sperimentale. Con una perfusione ben controllata, la coltura all'interno della rete microvascolare può essere mantenuta fino a due settimane. Pertanto, è possibile estendere l'approccio a studi a lungo termine che simulano l'ambiente cellulare e emodinamico in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

Per iniziare la colorazione immunoistochimica, come l'etichettatura di VE-cadherina, fissare innanzitutto le cellule mediante perfusione con paraformaldeide al due percento per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo una serie di passaggi di perfusione per il blocco, la permeabilizzazione e la colorazione con anticorpi, mantenere il dispositivo a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione delle immagini delle cellule. Per acquisire l'immagine della concentrazione di calcio all'interno delle cellule, effettuare la perfusione del dispositivo con 10 milligrammi per millilitro di albumina in soluzione di Ringer per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, perfondere il dispositivo con Fluo-4 AM a cinque micromolare per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, rimuovere con un lavaggio il Fluo-4 AM legato alla parete del lume utilizzando Ringer albuminato per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, avviare il sistema confocale per l'acquisizione di immagini dei livelli di calcio intracellulare con Fluo-4 AM. Acquisire immagini dei microvasi caricati con Fluo-4.

Acquisire le immagini di base per 10 minuti. Successivamente, perfondere il dispositivo in modo continuo con ATP 10 micromolare e registrare le variazioni dell'intensità di fluorescenza per 20 minuti. Per acquisire l'immagine della produzione di ossido nitrico nelle cellule, perfondere il dispositivo con Ringer albuminato per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, perfondere le cellule con DAF-2 DA 5 micromolare per circa 35-40 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, impostare il sistema di imaging a fluorescenza per misurare la produzione di ossido nitrico indotta da ATP. Registrare il valore basale per 5 minuti, quindi perfondere il dispositivo con ATP 10 micromolare e raccogliere le immagini per 30 minuti a intervalli di un minuto.

Per la misurazione dell'ossido nitrico cellulare, è importante comprendere che l'adattatore di distacco per il profilo di intensità rappresenta una produzione cumulativa di ossido nitrico nel tempo e non una concentrazione di ossido nitrico. Selezionare manualmente le regioni di interesse dalle immagini raccolte a livello cellulare individuale. Ogni ROI copre l'area di una singola cellula, che può essere indicata dal contorno di fluorescenza.

Quantificare le variazioni di calcio endoteliale e ossido nitrico indotte dall'ATP. Calcolando le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4, sottratta al fondo del tessuto. Quantificare la velocità di produzione di ossido nitroso effettuando la derivata prima della variazione dell'intensità di fluorescenza di DAF-2 nel tempo.

Il modello di microcanali nel dispositivo presenta una rete ramificata a tre livelli. È stata eseguita una simulazione numerica 3D per stimare le distribuzioni dello sforzo di taglio a una portata di 0,35 microlitri al minuto. Le cellule endoteliali sono state seminate nella rete come descritto.

Successivamente, l'F-actina e i nuclei sono stati marcati. Analogamente, anche la VE-cadherina è stata colorata. I risultati sono risultati simili all'espressione di VE-cadherina in una venula integra.

Successivamente, sono stati esaminati gli aumenti di calcio intracellulare e la produzione di ossido nitrico indotti da ATP. I livelli di calcio sono stati analizzati utilizzando Fluo-4 AM come descritto nella sezione del protocollo. La produzione di ossido nitrico è stata monitorata utilizzando DAF-2 DA come descritto nella sezione del protocollo.

I risultati erano paragonabili a quelli ottenuti con venule integre perfuse singolarmente. Il metodo è stato semplice e rigorosamente controllato in condizioni biologiche e in ambienti fluidi dinamici, condizioni che non sarebbero state possibili con tecniche microchirurgiche convenzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare il dispositivo e come effettuare misurazioni del calcio e dell'ossido nitrico.

Dopo che questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, non solo per indagare gli effetti indotti dall'agonista, ma anche per ampliare le applicazioni nella ricerca biomedica.