Sviluppo e caratterizzazione di In Vitro Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca ²⁺] _i E ossido nitrico Produzione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un dispositivo microfluidico che consenta alle cellule endoteliali di crescere sotto un flusso di taglio fisiologicamente rilevante e di misurare i cambiamenti indotti dagli agonisti nella loro produzione di calcio e ossido nitrico. Questo messaggio può contribuire a far progredire il futuro della ricerca sui microvasi, convalidando il modello di microvasi in vitro e colmando le lacune tra gli studi in vivo e quelli in vitro. I principali vantaggi di questa tecnica sono il design versatile dei microcanali per imitare varie vascolarizzazione e migliorano l'ambiente di coltura cellulare che è più vicino all'ambiente in vivo rispetto allo statico condizionale alle colture originali.

A dimostrare le procedure saranno Sulei e Xiang, i due del mio laboratorio. Prima di iniziare, utilizzare la fotolitografia standard per creare uno stampo master e la litografia morbida per fabbricare i dispositivi a microcanali PDMS come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i dispositivi a microcanali, coprire prima l'ingresso e l'uscita con un sottile pezzo di PDMS e posizionare il dispositivo all'interno di una piastra di Petri con un fazzoletto umido.

Quindi, avvolgere il piatto con Parafilm e sterilizzare il dispositivo sotto una luce UV per almeno tre ore. Il passo successivo è applicare la fibronectina. Per prima cosa, posiziona una goccia da 30 a 50 microlitri di PBS all'ingresso.

Creare un aspirapolvere all'uscita per risciacquare il dispositivo. Quindi, posizionare una goccia di 100 microgrammi per millilitro di fibronectina all'ingresso. Creare un vuoto all'uscita per caricare la soluzione di fibronectina.

Quindi, coprire l'ingresso e l'uscita. Avvolgere nuovamente il piatto con Parafilm e incubare il dispositivo per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare manualmente il dispositivo con PBS tre volte.

Quindi, caricarlo con 30-50 microlitri di terreno di coltura cellulare e riscaldare il dispositivo in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Iniziare mescolando gli HUVEC nei terreni di coltura HUVEC con l'otto percento di destrano a due o quattro milioni di cellule per millilitro. Il destrano è necessario per aumentare la viscosità e quindi migliorare la semina cellulare.

Successivamente, mettere da 10 a 20 microlitri di cellule sull'ingresso e introdurle per gravità o utilizzando l'azione capillare di una pipetta di vetro pasteur all'uscita. Quindi, incubare il dispositivo per 15-20 minuti. Quindi, controlla lo stato di semina al microscopio.

Se necessario, caricare più celle per ottenere la densità desiderata. Una volta caricato un numero sufficiente di cellule, sciacquare delicatamente il dispositivo con un normale terreno di coltura cellulare caldo per rimuovere il destrano. Quindi, coltivare il dispositivo senza alcuna perfusione del fluido per sei ore.

Quindi, impostare i collegamenti dei tubi per la perfusione a lungo termine. Fissare il dispositivo con del nastro adesivo a una piastra di Petri, quindi collegare il tubo di ingresso a una siringa con un ago. Inserire il tubo sia nell'ingresso che nell'uscita del dispositivo.

Collegare il tubo di scarico a un raccoglitore di rifiuti. Ora, metti il piatto e il contenitore dei rifiuti in un'incubatrice. Collegare la siringa con un lungo tubo di ingresso a una pompa di perfusione esterna che passa attraverso la porta dell'incubatrice.

Quindi, impostare il tasso di perfusione in base al disegno sperimentale. Con una perfusione ben controllata, la coltura nella rete di microvasi può essere mantenuta fino a due settimane. Pertanto, può essere esteso a studi a lungo termine che imitano l'ambiente cellulare ed emodinamico sulle diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

Per iniziare l'immuno-colorazione, come l'etichettatura VE-caderina, prima fissare le cellule perfondendo con il due percento di paraformaldeide per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo una serie di perfusioni per bloccare, permeabilizzare e colorare con gli anticorpi, mantenere il dispositivo a quattro gradi Celsius fino a quando le cellule non vengono visualizzate. Per visualizzare la concentrazione di calcio nelle cellule, perfondere il dispositivo con 10 milligrammi per millilitro di albumina in soluzione di Ringer per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, perfondere il dispositivo con cinque micromolari Fluo-4 AM per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare il Fluo-4 AM legato al lume con i Ringers all'albumina per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, avviare il sistema confocale per l'imaging intercellulare del livello di calcio con Fluo-4 AM. Acquisire immagini dei microrecipienti caricati con Fluo-4.

Raccogli le immagini di base per 10 minuti. Quindi, perfondere continuamente il dispositivo con ATP 10 micromolari e registrare le variazioni di intensità della fluorescenza per 20 minuti. Per visualizzare la produzione di ossido nitrico nelle cellule, perfondere il dispositivo con i Ringer all'albumina per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, perfondere le cellule con 5 micromolari DAF-2 DA per circa 35-40 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, configura il sistema di imaging a fluorescenza per misurare la produzione di ossido nitrico indotta da ATP. Registrare la linea di base per 5 minuti, quindi perfondere il dispositivo con ATP 10 micromolari e raccogliere le immagini per 30 minuti a intervalli di un minuto.

Per la misurazione dell'ossido nitrico cellulare, è importante capire che l'adattatore di distacco per il profilo di intensità rappresenta una produzione cumulativa di ossido nitrico nel tempo e non una concentrazione di ossido nitrico. Selezionare manualmente l'area di interesse dalle immagini raccolte a livello di singola cella. Ogni ROI copre l'area della cellula di un individuo, che può essere indicata dal contorno floresense.

Quantificare i cambiamenti indotti dall'ATP nel calcio endoteliale e nell'ossido nitrico. Calcolando le variazioni dell'intensità floresense di Fluo-4, meno il fondo tissutale. Quantificare il tasso di produzione di protossido di azoto conducendo la prima conversione differenziale dell'intensità floresense di DAF-2 nel tempo.

Il modello a microcanali nel dispositivo ha una rete di ramificazione a tre livelli. È stata eseguita una simulazione numerica 3D per stimare le distribuzioni delle sollecitazioni di taglio sotto la portata di 0,35 microlitri al minuto. Le cellule endoteliali si stavano seminando nella rete come descritto.

Quindi, la F-actina e i nuclei sono stati marcati. Allo stesso modo, anche la VE-caderina è stata colorata. I risultati sono stati simili all'espressione della VE-caderina in una venula intatta.

Successivamente, sono stati esaminati gli aumenti indotti dall'ATP nella produzione intracellulare di calcio e ossido nitrico. I livelli di calcio sono stati esaminati utilizzando Fluo-4 AM come descritto nella sezione del protocollo. La produzione di ossido nitrico è stata monitorata utilizzando DAF-2 DA come descritto nella sezione del protocollo.

I risultati sono stati paragonabili a quelli ottenuti con venule intatte perfuse individualmente. L'avanzato è stato facile e strettamente controllato in condizioni biologiche e in ambienti fluidi dinamici, cosa che non sarebbe stata possibile con le tecniche convenzionali di microabilità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare il dispositivo ed eseguire misurazioni di calcio e ossido nitrico.

Successivamente, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, non solo per studiare l'agonista sottostante indotto, ma anche per aprire applicazioni più ampie per la ricerca biomedica.