Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare con precisione la quantità e la struttura di ciascuna specie di sfingomielina in campioni biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo lipidico relative alla biologia dei lipidi e ai lipidi Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo caratterizzare una varietà di specie di sfingomielina in campioni biologici mediante sistema di spettrometria di massa cromatografica. Per iniziare, rimuovere i terreni di coltura da una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri contenente cellule HeLa e sciacquare le cellule due volte con sei millilitri di PBS ghiacciato.

Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato nella piastra di coltura tissutale da 10 centimetri e utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule. Una volta tolte dalla superficie del piatto, trasferire le cellule in provette di plastica siliconata da due millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di metanolo a ciascun pellet cellulare.

Quindi agitare brevemente i tubi. Quindi, posizionare i campioni in un sonicatore a bagno e sonicare a 200 watt per cinque minuti. Al termine, trasferire l'intero omogeneizzato di cella in provette dotate di tappi a vite rivestiti in teflon.

Ora aggiungi un millilitro di metanolo, un millilitro di cloroformio, 0,8 millilitri di acqua distillata doppia in 50 microlitri di 10 micromolari di uno standard interno in ogni provetta. Tappare i tubi e farli vorticare energicamente a 2, 500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un ulteriore millilitro di cloroformio e un millilitro di acqua distillata doppia in ogni tubo.

Ancora una volta, agitare vigorosamente i tubi a 2.500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare i campioni in modo da separare completamente la fase acquosa da quella organica. Trasferire la fase inferiore in provette di vetro monouso.

Aggiungere due millilitri di cloroformio nelle provette. Quindi agitare vigorosamente i tubi a 2.500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente per mescolarli sufficientemente con la fase superiore e la lanugine interfasica. Dopo una seconda centrifugazione, trasferire la fase inferiore modificata nelle provette di vetro monouso insieme alla fase inferiore iniziale.

A questo punto, porre le provette di vetro sotto un flusso di azoto per circa 60 minuti e rimuovere completamente i solventi organici nella fase inferiore raccolta. Infine, ricostituire i campioni con 500 microlitri di metanolo o etanolo. Filtrare la miscela risultante con un filtro da 0,02 micron in fiale di vetro.

Quindi conservare il campione a meno 20 gradi Celsius. Eseguire diluizioni seriali del composto standard e aggiungere 50 microlitri di ciascuna concentrazione in provette separate. Quindi, preparare tre campioni di controllo qualità aggiungendo al primo campione una quantità entro tre volte il limite inferiore della curva standard, una quantità vicino al centro della curva per il secondo campione e una quantità vicino al limite superiore della curva standard per il terzo campione.

Quindi aggiungere l'omogeneizzato cellulare in un millilitro di metanolo in ciascuna provetta ed estrarre la frazione lipidica totale da ciascun campione utilizzando il metodo appena mostrato. Per iniziare, prepara la fase mobile. Mescolare insieme acetonitrile, metanolo e acqua distillata doppia in un rapporto di due a due a uno per la fase acquosa.

Utilizzare isopropanolo per la fase organica in flaconi di vetro con tappi a vite rivestiti in teflon. Quindi sonicare entrambe le fasi mobili per cinque minuti in un sonicatore a bagno. Quindi aggiungere l'acido formico a una concentrazione finale di 26,4 millimolari e l'idrossido di ammonio a 14,9 millimolari in ciascuna fase mobile.

Per l'analisi qualitativa, attivare il sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni. Inserire i tubi di ingresso nelle bottiglie di vetro che contengono le fasi mobili e spurgare le linee HPLC. Quindi collegare una colonna HPLC C18 al sistema HPLC.

Mantenere la temperatura nel forno a colonna a 50 gradi Celsius e condizionare la colonna con la fase mobile acquosa a 100 microlitri al minuto. Durante la corsa, posizionare i campioni in un rack per campioni dell'autocampionatore. Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa a trappola ionica tripla quadrupla e quadrupla lineare per l'analisi della spettrometria di massa a tre stadi come elencato nella tabella uno e nella tabella due del protocollo di testo allegato.

Inoltre, impostare i parametri per il primo e il secondo ione precursore della specie SM di interesse, come descritto più dettagliatamente nel protocollo di testo allegato. Crea un file batch e invia il file batch per ottenere i dati degli spettri ionici del prodotto MS tre di ciascuna specie di sfingomielina mediante cromatografia liquida, ionizzazione elettrospray, analisi spettrometrica di massa tandem. Ottenere gli spettri ionici trifase del prodotto MS delle specie di sfingomielina di interesse mediante cromatografia liquida, ionizzazione elettrospray, analisi di spettrometria di massa tandem.

Quindi assegnare a ciascun MS tre spettri di ioni prodotto della sfingomielina confrontando il rapporto massa/carica degli spettri ionici del prodotto nella massa esatta della base a catena lunga sfingoide e della porzione n-acilica di interesse. Analizzare quantitativamente la sfingomielina utilizzando la cromatografia liquida, l'analisi della spettrometria di massa tandem con ionizzazione elettrospray come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi elaborare i dati di monitoraggio delle reazioni multiple utilizzando il software per l'integrazione dei dati per ottenere i dati dell'area del picco per il cromatogramma ionico estratto di ciascuna specie di sfingomielina.

Quantificare ogni specie di sfingomielina e costruire le curve standard come descritto nel protocollo di testo allegato. Qui è mostrato lo spettro della sfingomielina e della sfingomielina sintetizzate chimicamente nei campioni lipidici estratti dalle cellule HeLa. Da notare che l'intensità dello spettro della sfingosilfosforilcolina demetilata è maggiore di quella della porzione SM n-acilica in entrambi i campioni.

Di interesse è anche lo spettro corrispondente alla sfingosina-1-fosfato utile per speculare sul numero di carbonio e doppi legami della base sfingoide a catena lunga della Sfingomielina. Nell'attuale metodo quantitativo, è fondamentale preparare con precisione i campioni per la costruzione della curva di calibrazione nella convalida di questo metodo. L'adattamento della curva a bassa concentrazione è stato chiaramente migliorato utilizzando il fattore di ponderazione uguale a uno su x al quadrato rispetto a quello che utilizza il fattore di ponderazione di uno o uno su x.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e dell'industria per caratterizzare una varietà di specie di sfingomielina in campioni biologici e prodotti industriali come i cosmetici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare con precisione la quantità e la struttura di ciascuna specie di sfingomielina in campioni biologici. Non dimenticare che lavorare con gli assorbenti può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di un'adeguata usura del vetro.

Inoltre, è importante indossare i guanti per prevenire la contaminazione dei lipidi derivati dalle mani.