Name: Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri un metodo LC-MS/MS per analizzare quantitativamente e qualitativamente le specie di sfingomielina in campioni biologici. Questa tecnica consente una caratterizzazione precisa dei lipidi cellulari.

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Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) e una sovvenzione per lo studio del progetto di malattia intrattabile dal Ministero dell'economia Salute, lavoro e Welfare (K.Y. n. 201510032A). Ringraziamo il gruppo Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questo manoscritto.

Consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Indossare guanti per ridurre al minimo la contaminazione del campione di pelle-derivato SM. Il presente protocollo è stato applicato alle cellule HeLa sviluppate in minimo essenziale supplementato dell'Aquila con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1.000 U/L penicillina e streptomicina 100 mg/L.
1. preparazione dei campioni del lipido
Nota: È importante che tutte le Vetrerie artistiche tra cui provette con tappo a vite in Teflon-foderato essere privo di detersivo.
<ol><li>Estrazione della frazione lipidica totale da omogeneato cella utilizzando il metodo Bligh & Dyer7<ol>
<li>Rimuovere la cultura (o condizionata) media dalla piastra di coltura di tessuto di 10 cm e sciacquare due volte con 6 mL di PBS ghiacciata.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata nella piastra di coltura del tessuto 10 cm mediante pipetta P1000. Raccogliere le cellule con raschietti di cella e raccogliere in tubi di plastica siliconate 2,0 mL.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), è necessario eliminare il surnatante mediante una pipetta P1000.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di metanolo. Vortice tubi brevemente e Sonicare a 200 W per 5 min in un sonicatore bagno-tipo. Nota: Regolare il livello dell'acqua in un sonicatore bagno-tipo in modo che il pellet cellulare in modo efficiente è omogeneizzato.</li>
		<li>Trasferire l'omogenato di cella in metanolo mediante pipetta in provette (13 x 100 mm) con tappo a vite Teflon-allineato.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di metanolo, 1 mL di cloroformio, 0,8 mL di acqua distillata doppia e 50 µ l di 10 µmol/L di standard interno d18:1 /(D31)-16:0 SM in ogni provetta.</li>
		<li>Vortice provette vigorosamente per 5 min a temperatura ambiente. Nota: A questo punto, una sola fase (cloroformio/metanolo/acqua = 1/2/0,8 (v/v/v)) è formata.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di cloroformio e 1,0 mL di acqua distillata doppia.</li>
		<li>Tubi di vortice vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente. Nota: A questo punto, l'acquoso fase (superiore) e la fase organica (inferiore) è separato.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasferire la fase inferiore in provette monouso (fase iniziale inferiore). Nota: Raccogliere la fase inferiore utilizzando una pipetta di Pasteur e di un filtro di pipetta di sicurezza. Inserire la punta della pipetta nella fase inferiore, comprimere il bulbo piccolo accanto la valvola 'E' di fornire la fase superiore e lanugine interfacciale dentro la punta della pipetta e poi sifone la fase inferiore nella pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di cloroformio nelle provette e vortexare i tubi vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente per sufficientemente mescolare con la fase superiore e lanugine interfacciale.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasportare la fase inferiore modificata nelle provette di vetro monouso con la fase iniziale inferiore come descritto nel passaggio 1.1.10.</li>
		<li>Posizionare i tubi di vetro sotto un flusso di azoto e rimuovere completamente i solventi organici nella fase inferiore raccolta.</li>
		<li>Ricostituire i campioni con 500 µ l di metanolo o etanolo, filtrato con un filtro di 0,02-µm e memorizzare in fiale di vetro a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del campione per costruire la curva di calibrazione e la validazione del metodo<ol>
<li>Aggiungere 50 µ l di 0,1, 0,5, 1, 5, 10 o 50 µmol/L del composto standard (d18:1 /(D9)-18:1 SM) in provette con tappo a vite Teflon-allineato.</li>
		<li>Aggiungere cella omogeneato in ogni provetta e aggiungere 1 mL di metanolo. Nota: La quantità di omogenato di cella come una matrice varia secondo ogni esperimento. Se le specie di SM nei campioni derivati da cellule in un piatto di 10 cm cultura ordinariamente sono analizzate, la quantità di omogenato di cella in ogni provetta dovrebbe essere simile a quello delle cellule in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
		<li>Estrarre la frazione lipidica totale come descritto nella procedura 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Preparare il controllo qualità (QC) campioni per la convalida del metodo, come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3. Preparare i campioni con differenti concentrazioni di standard composto tre-QC (d18:1 /(D9)-18:1 SM): uno all'interno di 3 x il limite inferiore della curva standard (QC-basso, QC-L), uno vicino al centro (QC-middle, QC-M) e uno vicino al confine superiore della curva standard (QC-alta, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analisi mediante LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Preparazione della fase mobile<ol>
<li>Mescolare i solventi (acetonitrile/metanolo/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) per la fase acquosa e isopropanolo per la fase organica) in bottiglie di vetro con tappi a vite Teflon-allineato e Sonicare per 5 min in un sonicatore bagno-tipo.</li>
		<li>Aggiungere acido formico (concentrazione finale 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) in ogni fase mobile.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi qualitativa di SM da LC-ESI-MS3<ol>
<li>Attivare il sistema di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni, mettere i tubi di aspirazione in bottiglie di vetro contenenti fasi mobili e pulire le linee di HPLC. Collegare una colonna HPLC di18 C (1,5 mm i.d. × 100 mm lunghezza, particella 3.0 µm) per il sistema HPLC, mantenere la temperatura nel forno a colonna a 50 ° C e condizionare la colonna con la fase mobile acquosa a 100 µ l/min., mettere i campioni in un rack di campione nella autosampl er.</li>
		<li>Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica per analisi di3 MS come elencato nella tabella 1 e tabella 2 così come il precursore di primo e secondo gli ioni delle specie di interesse SM e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona del software per l'acquisizione dati, fare doppio clic su 'Configurazione Hardware', selezionare 'LC + QTRAP4500 + valvola' e fare clic su 'Attiva profilo'.</li>
			<li>Creare una nuova sottocartella facendo clic su 'Nuovo sottoprogetto' e 'OK'.</li>
			<li>Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca sull'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MS/MS/MS (MS3)', velocità di scansione come Da 10.000/s, polarità come 'Negativo' e 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati (min). Impostare il m/z del 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' come l'intervallo da analizzare. Impostare il m/z degli ioni del precursore di 1a e 2a del bersaglio specie di SM di interesse. Nota: Per analizzare più specie di SM, evidenziare la '-MS3' icona, fare clic destro, selezionare 'Copia questo esperimento' e poi mettere la m/z degli ioni del precursore 1 ° e 2 ° di altre specie di SM.</li>
			<li>Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: modalità di scansione come 'Profilo', dimensioni di passaggio come 0,12 (Da), risoluzione Q1 e Q3 'Unità' e 'Illuminato', rispettivamente, soglia di intensità come 0, tempo di impostazione come 50 (ms), pausa tra intervalli di massa come 1,5 ms, selezionare ' dinamica riempire il tempo ', Q3 barriera all'ingresso come 8 V e il tempo di eccitazione come 25 ms.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare 'origine/Gas' Tab. impostare i parametri della tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' impostare i parametri del declustering potenziale, potenziale ingresso, energia di collisione, energia di eccitazione e l'energia di collisione diffondere come elencato nella tabella 2.</li>
			<li>Evidenziare 'Valvola integrata Valco' e selezionare 'Posizione nome per passo 0' come A impostare 'B' come posizione per totale tempo 5,0 min. Anche impostare 'A' come posizione per totale tempo 70,0 min.</li>
			<li>Evidenziare 'Shimadzu LC sistema'. Selezionare la scheda 'Pompa' e impostare la modalità di pompaggio come flusso binario, flusso totale come 0,28 mL/min e massimo di limiti di pressione come 20.0 MPa. Selezionare la scheda 'Autocampionatore' e impostare il volume di risciacquo fino a 200 µ l, ago colpo come 52mm, risciacquo velocità come 35 µ l/s, velocità come 5,0 µ l/s di campionamento, eliminare tempo come 25,0 min, sciacquare tuffo tempo come 5 s e modalità di risciacquo come 'Prima e dopo l'aspirazione'.<ol>
<li>Inoltre, attivare il refrigeratore, impostare la temperatura di raffreddamento fino a 4 ° C e la corsa di ago flacone di controllo come 52 mm. Selezionare la scheda 'Forno', abilitare il forno e impostare la temperatura del forno e la temperatura massima di 50 ° C e 85 ° C, rispettivamente.</li>
				<li>Selezionare la scheda 'Controller' e spunta la casella 'Accendere'. Selezionare la scheda 'Time Program' e impostare come segue i gradienti di solventi: solventi A / B con un rapporto di 100/0 per 5 min, programma lineare alterazioni a 80/20 in 4 minuti, fino a 35/65 in 50 minuti e a 25/75 in seguito oltre 1 min. , li tengono a 25/75 per 10 min, poi linearmente a 100/0 oltre 4 min. Quindi salvare il metodo.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Creare file batch<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona 'Costruire acquisizione Batch', fare clic su 'Aggiungi Set', 'Aggiungi Samples', impostare il numero di nuovi campioni e fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante ' Method Editor' e selezionare il metodo da utilizzare. Se più metodi sono utilizzati in un file batch, selezionare la casella di 'Uso più metodi' e selezionare il metodo di acquisizione per ogni campione. Rinominare ' campione ', impostare il numero appropriato per 'Flaconcino posizione' e mettere la quantità di volume di iniezione. Quindi salvare il file batch.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ottenere il prodotto di3 MS ione spettri delle specie di interesse SM di analisi LC-ESI-MS3<ol>
<li>Selezionare la scheda 'Invia' in file batch, evidenziare la riga di campioni da analizzare e fare clic sul pulsante 'Invia'.</li>
			<li>Scegliere il ' vista que ', 'Equilibrato' icona, selezionare il metodo di acquisizione da utilizzare, impostare ora come 1 min e fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Disattivare 'Strumenti di riserva per Tuning' facendo clic sull'icona corrispondente. Quindi eseguire sequenza batch facendo clic sull'icona 'Avvia Sample'.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Assegnare ogni MS3 spettri di ioni prodotto della ESM confrontando la massa per caricare il rapporto (m/z) del prodotto spettri dello ione e la massa esatta della sfingoide LCB e N-frazione dell'acilico di interesse. Determinare il numero di atomi di carbonio e doppia obbligazioni nello sfingoide LCB e N-frazione di acil secondo gli ioni prodotto corrispondente.<ol>
<li>Verificare che sia selezionata la cartella appropriata sotto-progetto, quindi fare doppio clic sull'icona 'Apri File di dati' e selezionare i campioni da analizzare. Trascinare il picco nel cromatogramma per ogni specie di SM di destinazione e quindi fare doppio clic. Saranno presentati gli ottenuti spettri dello ione prodotto di3 MS entro l'area trascinata.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi quantitativa di SM da LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Impostare le fasi mobili e colonna HPLC come descritto al punto 2.1 e 2.2.1.</li>
		<li>Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupolo lineare trappola ionica per monitoraggio analisi (MRM) come indicato nella tabella 1 e tabella 2multiple della reazione e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Effettuare le procedure come descritto al punto 2.2.2.1 e 2.2.2.2.</li>
			<li>Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca l'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MRM', 'Positivo' la polarità. Impostare 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati. Impostare il m/z [M + H]+ e 184 come 'Q1 massa (Da)' e 'Q3 massa (Da)' del bersaglio specie di SM di interesse, rispettivamente. Impostare 'Tempo' come 10 ms e 'ID' come il nome della destinazione specie di SM.</li>
			<li>Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: entrambi la risoluzione Q1 e Q3 come 'Unit', soglia di intensità come 0, impostazione ora come 0 (ms) e pausa tra intervalli di massa come 5 ms.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare la scheda ' Origine/Gas' inserire il parametro di tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' mettere i parametri di declustering potenziale, ingresso potenziale, energia di collisione e potenziale di uscita di cella di collisione come elencato nella tabella 2.</li>
			<li>Impostare la valvola come descritto nel passaggio 2.2.2.6.</li>
			<li>Impostare la condizione di LC come descritto nel passaggio 2.2.2.7. Quindi salvare il metodo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Creare il file batch come descritto al punto 2.2.3.</li>
		<li>Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di ogni specie di SM da analisi LC-ESI-MS/MS come descritto al punto 2.2.4.</li>
		<li>Elaborare i dati di gestione record di messaggistica utilizzando il software per l'integrazione dei dati e ottenere i dati dell'area di picco per il cromatogramma di ioni estratti di ciascuna specie di SM.<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona del software per l'integrazione di dati in analisi quantitativa, fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare impostazioni predefinite utente integrazione. Impostare larghezza liscio gaussiana come 1,0 punto e fare clic su 'OK'. Fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare 'Nuova tabella risultati'. Selezionare il campione per essere integrato, fare clic su un pulsante freccia e fare clic su 'Avanti'. Selezionare 'Crea nuovo metodo', impostare il nome del metodo e fare clic su 'Avanti'. Fare clic su 'Avanti' e selezionare la casella di d18:1 /(D31)-16:0 SM così com'è, fare clic su 'Avanti' e fare clic su 'Fine'.</li>
			<li>Fare clic su 'Visualizza la recensione di picco' e confermare che i picchi del cromatogramma sono riconosciuti in modo appropriato. Va notato che il tempo di ritenzione di d18:1 /(D31)-16:0 SM è solitamente più piccolo di ~ min 0,3 rispetto a quella del MS 34-1 (di solito consiste di d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificare ogni specie di SM in base al rapporto del picco di ciascuna specie SM d18:1 /(D31)-16:0 standard interno di SM.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda 'File', selezionare 'Esporta', selezionare 'Risultati Table', confermare il formato come 'MultiQuant', 'Esporta tutte le colonne' di colonne, righe come 'Esporta tutte le righe ad eccezione di quelli esplicitamente nascosti' e quindi fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Aprire il file esportato nel software Excel. Normalizzare l'area del bersaglio specie SM per la zona di IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Quindi moltiplicare per l'importo teorico dell'IS nel campione iniettato per calcolare la quantità di bersaglio specie di SM nel campione iniettato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire la curva standard<ol>
<li>Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nei campioni per costruire la curva standard di analisi LC-ESI-MS/MS come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Ottenere i dati della zona di picco di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM come descritto al punto 2.3.5.</li>
		<li>Calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.6.</li>
		<li>Costruire la linea di tendenza impostando l'asse x e y come l'importo nominale e la quantità calcolata di d18:1 /(D9)-18:1 SM e ottenere la formula di linea di tendenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Convalida del metodo quantitativo utilizzando Excel software<ol>
<li>Per la convalida del metodo, quantificare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM in QC campioni analizzando ogni QC assaggiare almeno tre volte in un giorno e ripetere almeno 3 giorni come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Ottenere i dati di zona di picco e calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.5 e 2.3.6.</li>
		<li>Secondo la curva di calibrazione ottenuta, calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato.</li>
		<li>Valutazione di precisione<ol>
<li>Calcolare la media e la deviazione standard della quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM ottenuti nel passaggio 2.5.3 sul set di dati del giorno intra- e Inter-day utilizzando Excel software.</li>
			<li>La media ottenuta al passaggio 2.5.4.1 è divisa per la deviazione standard ed espresso in %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutazione dell'accuratezza<ol>
<li>Calcolare la precisione di ogni dati come segue: [(L'importo calcolato ottenuto nel passaggio 2.5.3.) / (Importo nominale) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calcolare la media del valore assoluto della precisione sul set di dati del intra- e Inter-giorno.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Nel presente metodo qualitativo, abbiamo ottenuto MS3 ioni prodotto di un SPC e un N-frazione di acil. È fondamentale per assegnare correttamente sia un SPC e un N-frazione di acil. A tal fine, si deve osservare che altre molecole contenenti fosforilcolina possono anche essere rilevati come gli ioni prodotto di3 MS. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e del plasmalogeno-PC sono abbondantemente presenti in cellule di mammifero, e loro idrofobicità è simile a quello della SM. Di conseguenza...

Sfingomielina (SM) è un comuni sfingolipidi in cellule di mammifero. SM è sintetizzato intracellulare1 e presente come precursore per altri sfingolipidi come un sfingosina-1-fosfato e una ceramide, che hanno un ruolo cruciale nella immunitario cellulare traffico e omeostasi della barriera, rispettivamente2, la pelle 3. Pertanto, l'analisi precisa del metabolismo SM è importante per chiarire i ruoli fisiologici e patologici degli sfingolipidi.
SM è composto di una ceramide e un fosforilcolina che è collegato al 1-idrossi gruppo di ceramide, che ulteriormente si compone di un sfingosina e un N-frazione di acil. Una varietà nei numeri carbonio e doppio legame nella sfingosina e N-frazione di acil risultati nelle specie numero di ceramide (e SM). Gli avanzamenti recenti nella LC-ESI-MS/MS ha permesso un'analisi quantitativa e qualitativa di SM4,5. Nell'analisi qualitativa, il numero di carbonio e doppi legami di un sfingoide LCB di SM è stati identificati tramite l'assegnazione di spettri di ioni prodotto di LCB. Tuttavia, informazioni strutturali della N-frazione di acil non è stata ottenuta direttamente perché non sono stati segnalati relativi ioni prodotto corrispondente e quindi N-moiety acil sono state dedotte da analisi differenziale tra ioni precursori e ioni di prodotto corrispondente a LCB in entrambi ioni positivi e negativi modalità4,5. In questo rapporto, presentiamo un metodo per rilevare gli ioni prodotto di LCB e di N-frazione di acil simultaneamente in modalità di3 MS utilizzando triplo quadrupolo e spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica, che facilita la precisa strutturale speculazioni di ogni specie di SM6.
Gli effetti di soppressione (o aumento) di ioni causati dalla matrice in campioni biologici ostacolano la quantificazione accurata in analisi LC-ESI-MS e pertanto, è auspicabile per costruire curve di calibrazione per tutti gli analiti di interesse nella matrice identica del campione biologico. Tuttavia, questa strategia non è fattibile perché è quasi impossibile preparare tutte le specie di SM nei campioni biologici, soprattutto in un'analisi completa. Così, è pratico costruire una curva di taratura e determinare l'intervallo quantitativa mediante una specie rappresentativa di SM a spillo nei campioni biologici. Abbiamo usato due specie di SM isotopicamente etichettato per costruire una curva di taratura; uno è stato usato per uno standard interno e l'altro per uno standard composto. Abbiamo rilevato una piccola quantità di specie di SM isotopicamente etichettato come un composto standard a spillo in campioni biologici e ottenuto con successo una curva di calibrazione e la gamma quantitativa6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale da 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Provetta siliconata da 2,0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Provetta</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a vite rivestito in teflon</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di vetro monouso</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro; m 1,5 mm D.I. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>La cartuccia di protezione viene inserita nel supporto della cartuccia e collegata alla colonna C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCCIA DI PROTEZIONE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Portacartuccia</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo (alcool isopropilico)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammoniaca acqua</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore (tipo da bagno)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice per provetta in vetro</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1,4 mL fiala di vetro</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>I campioni sono conservati in una fiala di vetro da 1,4 mL sigillata con tappo a vite e setto da 8 mm a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>8 mm setto</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Quando i campioni vengono analizzati, i tappi a vite vengono sostituiti con tappi a vite con setto fessurato</td></tr><tr><td>Tappo a vite per fiala di vetro da 1,4 mm</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a vite con setto fessurato</td><td>Shimadzu</td><td>GLC GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0,22 &; </td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometria di massa a triplo quadrupolo e a trappola ionica lineare a quadrupolo</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>Il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati degli spettri ionici del prodotto</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>Il software per l'integrazione dei dati nell'analisi quantitativa</td><td>Sistema HPLC SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di vetro</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sfingomielina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sfingosilfosforilcolina</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutammina</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s minimo essenziale medio</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante lc-ms utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Presentiamo un metodo di analisi di sfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente di liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). SM è un comuni sfingolipidi formato da un fosforilcolina e una ceramide come le componenti idrofile e idrofobe, rispettivamente. Un numero di specie di SM è presente in cellule di mammiferi a causa di una varietà della sfingoide lunga catena base (LCB) e un N-frazione di acil nella ceramide. In questo rapporto, indichiamo un metodo per stimare il numero di carbonio e legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto negli esperimenti di MS/MS/MS (MS3). Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l'intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie di SM in campioni biologici e prodotti industriali come cosmetici.

Sintetizzato chimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM in campioni di lipidi estratti da cellule HeLa (Figura 1B) sono stati analizzati da LC-ESI-MS che impiegano3 [M + HCOO]– e [M-CH3]- come ioni precursori di primo e secondo, rispettivamente. Si noti che l'intensità dello spettro di demetilato-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/...

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.

Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare con precisione la quantità e la struttura di ciascuna specie di sfingomielina in campioni biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo lipidico relative alla biologia dei lipidi e ai lipidi Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo caratterizzare una varietà di specie di sfingomielina in campioni biologici mediante sistema di spettrometria di massa cromatografica. Per iniziare, rimuovere i terreni di coltura da una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri contenente cellule HeLa e sciacquare le cellule due volte con sei millilitri di PBS ghiacciato.Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato nella piastra di coltura tissutale da 10 centimetri e utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule. Una volta tolte dalla superficie del piatto, trasferire le cellule in provette di plastica siliconata da due millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di metanolo a ciascun pellet cellulare.Quindi agitare brevemente i tubi. Quindi, posizionare i campioni in un sonicatore a bagno e sonicare a 200 watt per cinque minuti. Al termine, trasferire l'intero omogeneizzato di cella in provette dotate di tappi a vite rivestiti in teflon.Ora aggiungi un millilitro di metanolo, un millilitro di cloroformio, 0,8 millilitri di acqua distillata doppia in 50 microlitri di 10 micromolari di uno standard interno in ogni provetta. Tappare i tubi e farli vorticare energicamente a 2, 500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un ulteriore millilitro di cloroformio e un millilitro di acqua distillata doppia in ogni tubo.Ancora una volta, agitare vigorosamente i tubi a 2.500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare i campioni in modo da separare completamente la fase acquosa da quella organica. Trasferire la fase inferiore in provette di vetro monouso.Aggiungere due millilitri di cloroformio nelle provette. Quindi agitare vigorosamente i tubi a 2.500 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente per mescolarli sufficientemente con la fase superiore e la lanugine interfasica. Dopo una seconda centrifugazione, trasferire la fase inferiore modificata nelle provette di vetro monouso insieme alla fase inferiore iniziale.A questo punto, porre le provette di vetro sotto un flusso di azoto per circa 60 minuti e rimuovere completamente i solventi organici nella fase inferiore raccolta. Infine, ricostituire i campioni con 500 microlitri di metanolo o etanolo. Filtrare la miscela risultante con un filtro da 0,02 micron in fiale di vetro.Quindi conservare il campione a meno 20 gradi Celsius. Eseguire diluizioni seriali del composto standard e aggiungere 50 microlitri di ciascuna concentrazione in provette separate. Quindi, preparare tre campioni di controllo qualità aggiungendo al primo campione una quantità entro tre volte il limite inferiore della curva standard, una quantità vicino al centro della curva per il secondo campione e una quantità vicino al limite superiore della curva standard per il terzo campione.Quindi aggiungere l'omogeneizzato cellulare in un millilitro di metanolo in ciascuna provetta ed estrarre la frazione lipidica totale da ciascun campione utilizzando il metodo appena mostrato. Per iniziare, prepara la fase mobile. Mescolare insieme acetonitrile, metanolo e acqua distillata doppia in un rapporto di due a due a uno per la fase acquosa.Utilizzare isopropanolo per la fase organica in flaconi di vetro con tappi a vite rivestiti in teflon. Quindi sonicare entrambe le fasi mobili per cinque minuti in un sonicatore a bagno. Quindi aggiungere l'acido formico a una concentrazione finale di 26,4 millimolari e l'idrossido di ammonio a 14,9 millimolari in ciascuna fase mobile.Per l'analisi qualitativa, attivare il sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni. Inserire i tubi di ingresso nelle bottiglie di vetro che contengono le fasi mobili e spurgare le linee HPLC. Quindi collegare una colonna HPLC C18 al sistema HPLC.Mantenere la temperatura nel forno a colonna a 50 gradi Celsius e condizionare la colonna con la fase mobile acquosa a 100 microlitri al minuto. Durante la corsa, posizionare i campioni in un rack per campioni dell'autocampionatore. Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa a trappola ionica tripla quadrupla e quadrupla lineare per l'analisi della spettrometria di massa a tre stadi come elencato nella tabella uno e nella tabella due del protocollo di testo allegato.Inoltre, impostare i parametri per il primo e il secondo ione precursore della specie SM di interesse, come descritto più dettagliatamente nel protocollo di testo allegato. Crea un file batch e invia il file batch per ottenere i dati degli spettri ionici del prodotto MS tre di ciascuna specie di sfingomielina mediante cromatografia liquida, ionizzazione elettrospray, analisi spettrometrica di massa tandem. Ottenere gli spettri ionici trifase del prodotto MS delle specie di sfingomielina di interesse mediante cromatografia liquida, ionizzazione elettrospray, analisi di spettrometria di massa tandem.Quindi assegnare a ciascun MS tre spettri di ioni prodotto della sfingomielina confrontando il rapporto massa/carica degli spettri ionici del prodotto nella massa esatta della base a catena lunga sfingoide e della porzione n-acilica di interesse. Analizzare quantitativamente la sfingomielina utilizzando la cromatografia liquida, l'analisi della spettrometria di massa tandem con ionizzazione elettrospray come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi elaborare i dati di monitoraggio delle reazioni multiple utilizzando il software per l'integrazione dei dati per ottenere i dati dell'area del picco per il cromatogramma ionico estratto di ciascuna specie di sfingomielina.Quantificare ogni specie di sfingomielina e costruire le curve standard come descritto nel protocollo di testo allegato. Qui è mostrato lo spettro della sfingomielina e della sfingomielina sintetizzate chimicamente nei campioni lipidici estratti dalle cellule HeLa. Da notare che l'intensità dello spettro della sfingosilfosforilcolina demetilata è maggiore di quella della porzione SM n-acilica in entrambi i campioni.Di interesse è anche lo spettro corrispondente alla sfingosina-1-fosfato utile per speculare sul numero di carbonio e doppi legami della base sfingoide a catena lunga della Sfingomielina. Nell'attuale metodo quantitativo, è fondamentale preparare con precisione i campioni per la costruzione della curva di calibrazione nella convalida di questo metodo. L'adattamento della curva a bassa concentrazione è stato chiaramente migliorato utilizzando il fattore di ponderazione uguale a uno su x al quadrato rispetto a quello che utilizza il fattore di ponderazione di uno o uno su x.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e dell'industria per caratterizzare una varietà di specie di sfingomielina in campioni biologici e prodotti industriali come i cosmetici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare con precisione la quantità e la struttura di ciascuna specie di sfingomielina in campioni biologici. Non dimenticare che lavorare con gli assorbenti può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di un'adeguata usura del vetro.Inoltre, è importante indossare i guanti per prevenire la contaminazione dei lipidi derivati dalle mani.

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Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

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