Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la cromatografia liquida, il monitoraggio di reazioni selezionate o L-C-S-R-M per quantificare l'abbondanza assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi. Dopo la selezione dei bersagli peptidici, gli standard di peptidi esterni grezzi vengono sintetizzati e utilizzati per sviluppare saggi SRM utilizzando la cromatografia liquida, la spettrometria di massa o LCM ms. I saggi risultanti vengono utilizzati per eseguire analisi qualitative lc, SRM di campioni biologici preparati.

Se viene rilevato il peptide bersaglio derivato da un campione biologico, i campioni biologici vengono analizzati utilizzando saggi quantitativi lc SRM aggiungendo una serie di diluizione di isotopi stabili di standard peptidici interni. In definitiva, lc SRM può essere utilizzato per quantificare con precisione le proteine da un'ampia varietà di campioni biologici e per supportare le indagini su un'ampia varietà di bersagli proteici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i test immunologici è che lo sviluppo del test è relativamente rapido ed economico e i test risultanti sono suscettibili di multiplexing e non vulnerabili alla reattività crociata degli anticorpi.

Per iniziare, preparare gli standard dei peptidi liofilizzati come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di acetonitrile di acido formico a ciascuna M di standard peptidico liofilizzato per produrre una concentrazione di peptidi di 10 micromolari. Agitare i campioni per due minuti e fare il bagno.

Sonicali per cinque minuti per assicurarti che la dissoluzione dei peptidi sia completa. Estrarre i peptidi disciolti e concentrare la miscela risultante in un concentratore sottovuoto fino a un volume finale di 80 microlitri. Aggiungere 20 microlitri di acetil nitrile per sciogliere qualsiasi peptide precipitato.

Il campione contiene ora 10 micromolari di ciascun peptide, oltre al 20% di nitrile acetil-volume in volume e può essere utilizzato Per preparare gli standard dei peptidi interni ed esterni, analizzare le miscele degli standard dei peptidi esterni a circa uno o 10 picomoli di ciascun peptide per iniezione mediante spettrometria di massa shotgun utilizzando un sistema HPLC a flusso nano accoppiato a uno spettrometro di massa triplo quadruplo. Come descritto nel protocollo di testo, assicurarsi che ogni esecuzione LCMS includa un gradiente lineare di 60 minuti, una fase di rigenerazione della colonna e una fase di equilibrio della colonna Ree. Analizzare i dati del fucile risultante utilizzando il database, ricercando le sequenze degli standard di peptidi esterni.

Esamina manualmente tutte le identificazioni dei peptidi per assicurarti che siano tutte inequivocabili, scartando qualsiasi identificazione ambigua dei peptidi. Usa le identificazioni del peptide Ms del fucile per costruire una libreria di spettro utilizzando un programma software come Skyline Line. Preparare un elenco di transizioni lc SRM utilizzando le tre o le 10 transizioni più intense per ione precursore.

Utilizzare gli elenchi di transizione risultanti per eseguire l'analisi lc SRM delle miscele degli standard dei peptidi esterni. Esamina manualmente i dati L-C-S-R-M risultanti ed elimina eventuali saggi con prestazioni scadenti. Preparare i campioni biologici.

Innanzitutto, raccogli le cellule come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 400 microlitri di tampone per la lisi dell'urea appena preparato e miscelare ogni campione con un pipettaggio delicato. Trasferire ogni campione in una provetta da due millilitri con tappo a vite con un O-ring contenente circa 100 microlitri di perle di silice di zirconia da 0,1 millimetri, celle di lice facendo vorticare i campioni per cinque minuti a bagno a piena velocità.

Sonicare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente per facilitare l'omogeneizzazione e la maturazione delle proteine. Quindi eseguire un saggio della concentrazione proteica dei lisati, come un saggio dell'acido bissy per l'analisi qualitativa. Preparare aliquote da 200 microgrammi di lisato cellulare per una serie di diluizione di isotopi stabili.

Aggiungere ai campioni la serie di diluizione dell'isotopo stabile della miscela ecomolare degli standard peptidici interni. Ridurre i residui di proteina cisteina aggiungendo 0,7 microlitri di DTT molare a ciascun campione e incubando i campioni a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Cistine proteiche alchilate aggiungendo sette microlitri di ITO acetamide tamponato a ciascun campione e incubando i campioni a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.

Per ciascuno dei campioni, aggiungere 482 microlitri di hees da 100 millimolari regolati con idrossido di sodio in modo che la concentrazione finale di urea sia di un molare. Successivamente, tre volte, digerire le proteine in peptidi. Aggiungere otto microlitri di tripsina di grado di sequenziamento da 0,5 microlitri per microlitro a ciascun campione che contiene lisato cellulare.

Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per 18 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 440 microlitri di acido formico al 2% in volume per centrifugare tutti i campioni a 21.000 G per 20 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali precipitati che ostruirebbero una cartuccia C 18 SPE in fase solida. Estrarre ciascuna delle natine SUP utilizzando una cartuccia monouso C 18 SPE burst.

Bagnare la colonna applicando un millilitro di tampone B ed equilibrarla applicando due volte un millilitro di tampone a. Forzare le fasi mobili attraverso la cartuccia C 18 SPE utilizzando una superficie piana su un bulbo di gomma e un collettore di estrazione. Applicare il campione e successivamente lavare la cartuccia con un millilitro di tampone A due volte eluire i peptidi applicando un millilitro di tampone B.Concentrare lentamente ogni ilu in un concentratore sottovuoto fino a un volume finale di 100 microlitri per far evaporare l'acetil nitrile.

Quindi aggiungere due microlitri, il 5% in volume di acido formico in acetil nitrile a ciascun campione. Analizzare i campioni utilizzando L-C-S-R-M qualitativo come prima. Per l'analisi quantitativa L-C-S-R-M, eseguire la serie di diluizione isotopica di ciascun campione biologico è stata utilizzata la spettrometria di massa shotgun per analizzare gli standard dei peptidi esterni.

Le prime 10 transizioni più intense per precursore sono state selezionate per L-C-S-R-M. L-C-S-R-M è stato quindi utilizzato per analizzare gli standard dei peptidi esterni. Le identificazioni peptidiche risultanti dovrebbero essere inequivocabili.

L'analisi qualitativa L-C-S-R-M dei campioni biologici ha tipicamente prodotto un segnale di fondo maggiore, ma la maggior parte dei bersagli peptidici è stata identificata con sicurezza. La L-C-S-R-M quantitativa è stata eseguita utilizzando standard peptidici interni aggiunti ai campioni biologici. I valori di abbondanza proteica risultanti erano coerenti tra le repliche biologiche e i due peptidi bersaglio per proteina bersaglio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare ed eseguire saggi L-C-S-R-M per quantificare l'abbondanza assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi.