Name: Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Impara la quantificazione assoluta delle proteine con spettrometria di massa SRM in campioni biologici complessi. Questo metodo offre un'alternativa rapida ed economica agli immunoassay tradizionali.

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Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NIH, Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Proteina assoluta quantificazione è essenziale per una gamma molto diversificata di applicazioni biomediche, come la convalida biomarker e trasduzione del segnale modellazione via. Recentemente, la proteomica mirati utilizzando LC-SRM ha beneficiato di miglioramenti a numerose tecnologie, tra cui il peptide preparazione standard HPLC, QQQ-MS e LC-SRM analisi dei dati. Di conseguenza, è diventato un potente alternativa a immunodosaggi. Immunoassays possono essere estremamente sensibili e high-throughput, ma lo sviluppo d...

Esperimenti di proteomica che utilizzano la spettrometria di massa (MS) possono essere progettati per utilizzare non mirati (shotgun) o metodi mirati. Proteomica Discovery genere si basa su fucile bottom-up MS, sia utilizzando una tradizionale modalità di acquisizione dati dipendente, oppure utilizzando una delle tecniche di dati indipendenti recentemente sviluppati (ad esempio, MS E, SWATH) 1,2. Proteomica Shotgun è un potente strumento per l&#39;identificazione peptide high-throughput e relativa quantificazione, ma è generalmente adatto per la quantificazione assoluta o per il targeting piccoli insiemi definiti (~ decine) di proteine. Il metodo MS più spesso utilizzato per proteomica mirati è selezionato monitoraggio reazione (SRM) a causa della sua elevata sensibilità, velocità e gamma dinamica 3-5. Alternative al SRM comprendono il monitoraggio reazione parallela, che sfrutta ad alta risoluzione, scansione MS pieno 6. SRM è di solito eseguita con un rever nano-flowsed fase cromatografia liquida ad alte prestazioni (nano-RP-LC) strumento accoppiato ad un ionizzazione nano-elettrospray (nano-ESI) sorgente di ioni collegato a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ-MS). In un esperimento tipico, proteine ​​del campione sono proteolytically digeriti, e peptidi risultanti vengono cromatograficamente separati, desorbiti e ionizzati. Gli ioni precursori risultanti sono m / z filtrato dal primo quadrupolo (Q1) e frammentata nel secondo quadrupolo (q2) da loro collisione con un gas di collisione. Gli ioni frammento risultante sono m / z filtrata nel terzo quadrupolo (Q3) e quantificata da un dinodi. Ogni coppia precursore e frammento di ioni viene indicato come una transizione, e ogni transizione viene monitorato per un determinato periodo di tempo (il tempo di sosta, in genere 2-50 msec). Durante LC-SRM, i cicli QQQ-MS tramite un elenco predefinito di transizioni (duty cycle è tipicamente ≤3 sec), e un cromatogramma di ogni transizione è prodotto. Strateg Alternativei per le proteine ​​quantificazione utilizzano in genere saggi immunologici, come macchie di punti, macchie occidentali, ELISA, microarrays dell&#39;anticorpo, di microarrays della proteina di fase inversa, immunodosaggi microfluidica, ELISA digitali e immunologici basati microsfere-7. I migliori immunodosaggi possono essere significativamente più sensibile LC-SRM, e la produttività del campione di immunodosaggi possono essere significativamente superiore a quello di LC-SRM 5. Tuttavia, immunodosaggi sviluppo possono essere costosi e / o di tempo, e le analisi risultanti possono essere vulnerabile a cross-reattività e / o interferenze, compatibile con la cellula / tessuto lisi / metodi di omogeneizzazione, e / o non suscettibili di multiplexing 5,8. Alcuni di questi problemi possono essere affrontati con l&#39;accoppiamento di tecniche anticorpo-e basate su MS. Per esempio, le proteine ​​bersaglio possono essere arricchiti con immunoprecipitazione prima proteolisi e LC-SRM 9-12. In alternativa, la tecnica SISCAPA impiega immunoprecipitazione successiva alla proteolisi al leve peptidel 13,14. Oltre a immunoenrichment strategie, immunodeplezione di proteine ​​elevate abbondanza può essere impiegato per aumentare la sensibilità LC-SRM riducendo interferenze da coeluiscono analiti 15,16. Proteina quantificazione basata su MS può essere diviso in quantificazione relativa e assoluta, e anche in etichettatura isotopo stabile e priva di etichetta (ad esempio, in materia di etichettatura del metabolismo, l&#39;etichettatura chimica, e proteine ​​pesante marcati e peptide standard interni). Tecniche senza etichetta può essere utile per la proteina relativa quantificazione, ma non sono adatti per un accurato quantificazione assoluta. In confronto, le tecniche di etichettatura hanno ridotto errore associato con la preparazione del campione e MS varianza, e sono spesso utilizzati per la proteina relativa quantificazione 17. Ad esempio, gli standard degli isotopi stabili proteoma marcati (SILAP) preparati con una linea di cellule umane in coltura permesso quantificazione relativa dei potenziali biomarcatori tramite LC-SRM di siero umano 18. Accurate proteina quantificazione assoluta da MS è necessario che le norme interne purificato, quantificato, proteine ​​o peptidi isotopi marcati venire addizionate-in campioni biologici prima della SM. L&#39;incorporazione di isotopo pesante standard interni marcati in un flusso di lavoro LC-SRM consente una quantificazione assoluta che ha dimostrato di essere altamente riproducibile e trasferibili tra i laboratori 16,19. Isotopo stabile etichettati standard interni per le proteine ​​quantificazione assoluta da MS sono gli standard di peptide preparati con solida sintesi in fase 20, proteine ​​composte da concatenati standard peptide proteasi cleavable 21, e full-length standard proteina 22. Obiettivo modifica proteine ​​covalente e preparazione dei campioni incompleti (vale a dire, la lisi incompleta del campione e l&#39;omogeneizzazione, e incompleta delle proteine ​​solubilizzazione, denaturazione, alchilazione e proteolisi) può minare la quantificazione accurata. P internonorme rotein sono i meno probabilità di essere colpiti dalla maggior parte di questi potenziali problemi, ma di solito sono le più difficili da preparare. Un&#39;alternativa è quella di analizzare ogni proteina bersaglio utilizzando più standard peptide interni che sono progettati per includere i residui di nativi di accompagnamento amino e carbossi-terminale. Indipendentemente da quale è impiegato il tipo di standard interno, occorre spillo-nei campioni biologici fin dalle prime punto durante la preparazione del campione possibile. Inoltre, le tecniche di preparazione dei campioni multipli (ad esempio, diverse condizioni di denaturazione) devono essere testati. L&#39;uso di molteplici tecniche sperimentali ortogonali (cross-validazione sperimentale) è una strategia praticabile per superare più potenziale quantificazione sfide 23-25. LC-SRM quantificazione delle proteine ​​è una tecnica estremamente flessibile che è stato utilizzato in un&#39;ampia varietà di applicazioni. In particolare, è stato utilizzato per studiare peptidi e proteine ​​biomarker all&#39;internocampioni clinici quali siero, biopsie, e aspirati con ago sottile 5. LC-SRM è stato utilizzato anche per misurare la stechiometria di complessi proteici 5,26, per rilevare neurotossine botuliniche 27, per quantificare la dinamica delle proteine ​​di fosforilazione in vie di segnalazione 5, e di quantificare i cambiamenti di conformazione proteica 28. Il nostro laboratorio sta usando LC-SRM per quantificare le proteine ​​di segnalazione che mediano la chemiotassi macrofagi per sostenere lo sviluppo di simulazioni chemiotassi pathway. Lo schema generale del protocollo (Figura 1) inizia con classifica i timidi peptidi di destinazione. Successivamente, gli standard di peptide esterni grezzi vengono sintetizzati e utilizzati per sviluppare test LC-SRM per le analisi qualitative dei campioni biologici. Se viene rilevato il biologico campione di derivazione bersaglio peptide, peptide norme interne pesanti marcato purificate sono preparati per quantitativa LC-SRM. Questo protocollo può essere utilizzato per acaccurata- quantificare proteine ​​da un&#39;ampia varietà di campioni biologici, e di agevolare le indagini di un&#39;ampia varietà di proteine ​​target.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN), kit</td> per il dosaggio delle proteine Fisher <td>A955-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA (acido bicinconninico)</td> di grado <td>LC-MS Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Perline per la battitura delle perline, zirconia-silice, 0,1 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di bestatina</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare DMEM (con glucosio, senza L-glutammina)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare Trypan Blue viability color, 0,4% p/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro Contatore di cellule T4 automatico</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometro T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro Auto T4 camere di conteggio monouso</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico, grado LC-MS, fiale Fisher</td><td></td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro, Neubauer-migliorato, 0,1 mm di profondità</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 37% p/p</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2,5LG</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette basato su laser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC capillare in silice rivestito, 50 &; micro; Flacone</td> LC <td>1068150017</td><td></td><td>Polymicro Technologies</td></tr><tr><td>, autocampionatore, 12 mm x 32 mm</td> polipropilene <td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC tappo a vite, autocampionatore, PTFE/silicone pre-fessurato</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luciferasi, da Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Strisce pH colorpHast (pH 0,0-6,0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi PhosStop</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml cartuccia da 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, collettore di estrazione, 20 posizioni</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, bulbo in gomma a superficie piatta</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Concentratore sottovuoto Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Acido</td><td></td> trifluoroacetico Fisher SPD111V <td></td></tr><tr><td>(TFA), grado LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado di sequenziamento,</td><td>provetta Promega</td><td>V5113</td><td></td>modificata</tr><tr><td> decapsulatore per provette Micronic</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Prostanze, 2 ml microcentrifuga, o-ring tappo a vite, sterile</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, grado LC-MS</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

reazione selezionato monitoraggio spettrometria di massa per absolute protein quantificazione

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

La quantificazione assoluta delle proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi è fondamentale per un'ampia gamma di applicazioni cliniche e di ricerca. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per lo sviluppo e l'applicazione di saggi quantitativi utilizzando la spettrometria di massa (MS) con monitoraggio a reazione selezionata (SRM). In primo luogo, i probabili peptidi bersaglio quantotipici vengono identificati sulla base di numerosi criteri. Ciò include l'identificazione dei peptidi proteotipici, l'evitare i siti di modifica post-traduzionale e l'analisi dell'unicità del peptide bersaglio rispetto alla proteina bersaglio. Successivamente, gli standard di peptidi esterni grezzi vengono sintetizzati e utilizzati per sviluppare saggi SRM e i saggi risultanti vengono utilizzati per eseguire analisi qualitative dei campioni biologici. Infine, vengono preparati standard di peptidi interni purificati, quantificati e marcati con isotopi pesanti e utilizzati per eseguire saggi SRM in serie di diluizione isotopica. Viene presentata l'analisi di tutti i dati MS risultanti. Questo protocollo è stato utilizzato per analizzare con precisione l'abbondanza assoluta di proteine della via di segnalazione della chemiotassi all'interno di cellule RAW 264.7 (una linea cellulare di monociti/macrofagi di topo). La quantificazione di Gi2 (una α-subunità eterotrimerica della proteina G) è descritta in dettaglio.

Lo sviluppo di modelli computazionali predittivi di trasduzione del segnale è uno degli obiettivi fondamentali della biologia dei sistemi 53. Purtroppo, anche per vie di segnalazione che sono stati studiati estesamente e hanno un alto significato clinico, non è ancora generalmente possibile predire quantitativamente il comportamento percorso in risposta a perturbazioni (ad esempio, questo è vero per la MAPK / ERK 54). Recentemente, una ricerca impiegato proteomica mirati, trascrittomica e ...

Questo protocollo descrive come eseguire saggi di quantificazione assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi utilizzando il monitoraggio di reazioni selezionate. È stato utilizzato per quantificare con precisione le proteine della via di segnalazione della chemiotassi dei macrofagi di topo. La selezione dei peptidi target, lo sviluppo del saggio e i saggi qualitativi e quantitativi sono descritti in dettaglio.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la cromatografia liquida, il monitoraggio della reazione selezionata o L-C-S-R-M, per quantificare l'abbondanza assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi. Dopo la selezione dei peptidi bersaglio, vengono sintetizzati standard peptidici esterni grezzi e utilizzati per sviluppare saggi SRM mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa, o LCM ms. I saggi ottenuti vengono quindi impiegati per eseguire analisi qualitativa di lc e SRM su campioni biologici preparati.Se viene rilevato il peptide bersaglio derivato dal campione biologico, i campioni biologici vengono analizzati mediante saggi quantitativi lc SRM aggiungendo una serie di diluizione con isotopi stabili di standard peptidici interni. In definitiva, la lc SRM può essere utilizzata per quantificare con precisione le proteine provenienti da una vasta gamma di campioni biologici e per supportare indagini su una grande varietà di bersagli proteici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi immunologici, è che lo sviluppo del saggio è relativamente rapido ed economico, e i saggi risultanti sono

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Biologia

Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Presentiamo un protocollo per identificare e quantificare i componenti in miscele di specie che possiedono proteine simili. La spettrometria di massa rileva i peptidi per l'identificazione e fornisce una quantificazione relativa in base ai rapporti delle aree di picco. Come strumento alimentare per il rilevamento delle frodi, il metodo può rilevare l'1% di cavallo nella carne bovina.

Specie determinazione e la quantificazione in miscele Utilizzando MRM Spettrometria di massa dei peptidi applicata per l&#39;autenticazione a base di carne

Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

Viene presentato un protocollo per l'estrazione totale dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine ​​dai tessuti biologici utilizzando un campione.

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

Viene presentato un protocollo per la determinazione di biomarcatori a bassa abbondanza da campioni di siero essiccati esemplificati con il peptide di rilascio della progastrina biomarcatore (ProGRP). Le sfere magnetiche rivestite di anticorpi sono utilizzate per la pulizia selettiva e l'arricchimento di un peptide ProGRP proteotipico. Il peptide catturato viene successivamente analizzato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza

Impara la quantificazione assoluta delle proteine con spettrometria di massa SRM in campioni biologici complessi. Questo metodo offre un'alternativa rapida ed economica agli immunoassay tradizionali.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

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