Name: Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Impara l'estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate con cromatografia liquida-spettrometria di massa e diluizione isotopica stabile. Questo metodo consente la quantificazione accurata dei metaboliti lipidici bioattivi.

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La maggior parte degli attuali metodi bioanalitici disponibili per la misurazione dei lipidi bioattivi non sono così estesi in quanto non includono la cromatografia chirale in fase normale o SID. La LC chirale in fase normale è fondamentale per la separazione degli enantiomeri e per essere in grado di distinguere tra metabolismo mediato da enzimi o ROS. L'uso della SID garantisce che l'errore umano o le complicanze che si verificano durante l'estrazione o l'analisi siano presi in considerazione durante la quantificazione. Questi componenti aggiunti, insieme a ECAPCI-MRM, lo rendono il metodo più sensibile e selettivo disponibile per l'analisi dei lipidi bioattivi.

1. Mix standard e standard interni
<ol>
	<li>Prima dell'estrazione dei lipidi, è necessario preparare una miscela standard (SM) e una miscela standard interna (ISM). Per l'SM, aliquotare il volume equivalente di 1 μg di ciascuno standard (25 in totale) elencato nella tabella dei reagenti sottostante, utilizzando una siringa calibrata, in un matraccio tarato da 10 mL. Essiccare gli standard sotto azoto e ricostituire in 10 mL di acetonitrile (ACN). La concentrazione finale della miscela standard sarà di 100 pg/μL. Dividere in aliquote da 1 mL e conservare a -80°C fino al momento del bisogno.</li>
	<li>Da questa miscela standard, è possibile effettuare 6 diluizioni standard per un totale di 7 standard di calibrazione (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL e 100 pg/ μL). Questi standard devono essere eseguiti con ogni lotto di campioni preparati per sviluppare la curva di calibrazione utilizzata nell'analisi quantitativa.</li>
	<li>Per l'ISM, aliquotare il volume equivalente di 1 μg di ciascun IS (14 in totale) elencato nella tabella dei reagenti sottostante in un matraccio tarato da 10 mL, utilizzando una siringa calibrata, e asciugare sotto azoto. Ricostituire l'ISM in 10 mL di ACN e dividerlo in aliquote da 1 mL. La concentrazione finale dell'ISM dovrebbe essere di 100 pg/μL. L'ISM è sufficiente per elaborare 1000 campioni.</li>
	<li>Conservare l'SM e l'ISM a -80°C.</li>
</ol>
2. Raccolta di terreni e lisato cellulare
<ol>
	<li>Per ogni piastra da 10 cm di cellule aderenti (~ 1 X 107), raccogliere 3 mL di terreno in una provetta da centrifuga in vetro da 10 mL. Successivamente, lavare le cellule 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 1 mL di PBS alla piastra, raschiare le cellule dalla piastra e pipettare in una seconda provetta da centrifuga in vetro da 10 mL. A questo punto le cellule e i terreni possono essere conservati se la procedura non viene continuata in questo momento. Conservare i campioni a -80°C per la conservazione a lungo termine o a -20°C per meno di una settimana.</li>
</ol>
3. Estrazione di lipidi dai terreni
<ol>
	<li>I lipidi bioattivi liberi si trovano nei terreni cellulari e questi possono essere facilmente estratti con una procedura di estrazione l-l in un'unica fase. Al terreno raccolto (2.1), aggiungere 10 μl di ISM. A questo punto, 8 provette da centrifuga in vetro da 10 mL aggiuntive dovrebbero essere etichettate #0-7 per gli standard di calibrazione. Aggiungere 3 mL di PBS a ciascuna di queste provette, quindi aggiungere 10 μL dell'SM appropriato alle provette 1-7 (1-7 da 1,1).</li>
	<li>Lasciare che l'ISM si equilibri in ogni standard di calibrazione e campione per 10 minuti, quindi aggiungere 5 mL di etere etilico. I campioni e gli standard di calibrazione vengono quindi posti nell'agitatore a bassa velocità per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'agitazione, tutti gli standard di calibrazione e i campioni vengono centrifugati a 1935 x g per 10 minuti. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire la fase superiore (organica) in una nuova provetta da centrifuga in vetro da 10 ml e asciugare sotto azoto.</li>
</ol>
4. Estrazione di lipidi dal lisato cellulare
<ol>
	<li>Centrifugare i campioni di cellule nelle provette da centrifuga di vetro a 1935 X g per 5 minuti. Smaltire il surnatante; aggiungere 2 mL di PBS a ciascuna provetta e agitare brevemente. Rimuovere 25 μl di campione per la quantificazione delle proteine. La proteina totale sarà utilizzata per la normalizzazione del lisato cellulare.</li>
	<li>Quindi, trasferire metà della miscela di lisato/PBS in una provetta da centrifuga di vetro da 10 ml separata. Aggiungere altri 2 mL di PBS insieme a 10 μL di ISM a ciascun campione. Seguire il processo di estrazione l-l descritto per i terreni nei punti 3.2 e 3.3. Questa aliquota verrà utilizzata per misurare i lipidi liberi nelle cellule ed evitare la degradazione alcalina dei lipidi, come le prostaglandine. Questa aliquota non subirà i passaggi 4.3 e 4.4 descritti di seguito.</li>
	<li>La prima fase del processo di estrazione del lipide l-l esterificato richiede l'aggiunta di 5 mL di CHCl3/MeOH (2:1) a ciascuno dei campioni. I campioni vengono posti in un agitatore a bassa velocità per 30 minuti. Dopo l'agitazione, i campioni vengono centrifugati a 1935 x g per 10 minuti. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire lo strato inferiore (organico) dell'estrazione l-l in una nuova provetta da centrifuga in vetro da 10 ml e asciugare il campione sotto azoto.</li>
	<li>I lipidi esterificati devono essere saponificati prima della quantificazione. Una volta che i campioni sono asciutti, aggiungere 0,5 mL di 0,4N KOH in 80% MeOH a ciascuna provetta. I campioni vengono quindi incubati a 60°C per 1 ora. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di PBS. Regolare il pH a 6 con acido HCl concentrato (~30 μL). Aggiungere 10 μl di ISM a ciascun campione. Il resto della procedura è lo stesso dell'estrazione dei lipidi dai terreni e può essere seguito nei punti 3.2 e 3.3.</li>
	<li>Se queste estrazioni vengono eseguite contemporaneamente ai campioni di terreno, gli stessi standard di calibrazione possono essere utilizzati per sviluppare una curva di calibrazione; tuttavia, se questi campioni vengono eseguiti in un altro momento, anche gli standard di calibrazione devono essere elaborati come descritto nei punti 3.1-3.3.</li>
</ol>
5. Derivatizzazione del pentafluorilbenzilbromuro (PFB)
<ol>
	<li>Ai campioni essiccati e agli standard di calibrazione, aggiungere 100 μL di diclorometano anidro (CH2Cl2) seguiti da 100 μL di N,N-diisopropiletilammina al 20% (v/v) in CH2Cl2 anidro e infine 100 μL di PFB al 20% (v/v) in CH2Cl2 anidro.</li>
	<li>Dopo l'aggiunta dei reagenti di derivatizzazione, i campioni vengono agitati, incubati a 60°C per 1 ora ed essiccati sotto azoto. I campioni e gli standard di calibrazione possono essere conservati a -80°C se non vengono analizzati immediatamente o a -20°C per un massimo di una settimana.</li>
</ol>
6. Diluizione di isotopi stabili, cromatografia liquida chirale, cattura di elettroni, pressione atmosferica, ionizzazione chimica, spettrometria di massa (SID-LC-ECAPCI-MS)
<ol>
	<li>I campioni essiccati e gli standard di calibrazione vengono ricostituiti in 100 μL di esano/etanolo (97:3). L'intero campione può quindi essere trasferito nella fiala HPLC con inserto. Posizionare i campioni nell'autocampionatore raffreddato (4°C) e creare una lista di campioni per l'analisi.</li>
	<li>Successivamente, impostare i metodi HPLC e MS utilizzando i parametri descritti nella Tabella 1 e nella Tabella 2 di seguito. La Tabella 3 contiene informazioni specifiche sui composti, tra cui l'energia di transizione e collisione (CE) MRM per ciascun lipide, nonché il tempo di ritenzione stimato dall'analisi Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. Il CE è determinato regolando ogni singolo lipide durante lo sviluppo del metodo.</li>
	<li>Per la normale separazione di fase viene utilizzata una colonna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) riscaldata a 30°C. La fase mobile iniziale è composta per il 98% da esano e per il 2% da metanolo/isopropanolo (1:1). Dopo la separazione HPLC, il metanolo viene aggiunto dopo la colonna (0,75 mL/min) per evitare la deposizione sull'ago Corona che causerebbe una diminuzione della sensibilità. L'MS è impostato in modalità ioni negativi utilizzando la sorgente APCI. Se la fonte deve essere cambiata da ESI a APCI, assicurati di inserire un ago Corona.</li>
	<li>Il primo campione che dovrebbe essere eseguito è sempre un bianco di esano. In questo modo la colonna sarà bilanciata e sarà possibile verificare la presenza di contaminazioni che potrebbero interferire con lo standard di taratura e l'analisi del campione.</li>
	<li>La successiva esecuzione dei campioni dovrebbe essere quella dei campioni standard di calibrazione nell'ordine di 0-7 (concentrazione SM crescente). Questi standard verranno utilizzati per creare una curva di calibrazione contenente il rapporto tra l'area standard/area IS sull'asse y e la concentrazione o massa standard sull'asse x. Dall'equazione y = mx + b derivata da questo grafico, il rapporto tra area del campione/area IS (y) può essere utilizzato per determinare la quantità di campione (sconosciuta) o la concentrazione (x).</li>
	<li>La quantità di lipidi bioattivi presenti nei terreni può essere normalizzata al volume totale dei terreni e la quantità di lipidi presenti nel lisato cellulare può essere normalizzata al numero totale di cellule/piastra o alla quantità totale di proteine/piastra. Durante il 4.1 del protocollo devono essere prese misure per garantire che le cellule siano contate o che le proteine siano quantificate.</li>
</ol>
7. Risultati rappresentativi:
I cromatogrammi nella Figura 1 sono rappresentativi di un profilo lipidomico mirato. Il primo pannello (Figura 1A) mostra il 13- e il 9-HODE insieme ai corrispondenti 13- e 9-oxoODE, derivati dall'acido linoleico. Inoltre, nel secondo pannello viene mostrato anche il 15-oxoETE, il metabolita ossidato del 15-HETE. I due pannelli inferiori mostrano il 20-HETE e il 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. La Figura 1B mostra la separazione e le transizioni uniche determinate per gli stereoisomeri HETE che derivano dall'ossidazione enzimatica di AA o dai ROS. La Figura 1C è una rappresentazione di PG, isoP e LTB4. Alcuni degli standard non hanno un IS deuterato disponibile in commercio; pertanto, per la quantificazione viene utilizzato un IS simile nel tempo di conservazione. Ad esempio, [2H8]-12(S)-HETE viene utilizzato per quantificare le specie di 11-HETE e 8-HETE oltre a 12(R)-HETE e 12(S)-HETE.
Dai cromatogrammi rappresentativi, è evidente che c'è un piccolo cambiamento nella ritenzione dell'IS deuterato rispetto allo standard non marcato. Questo passaggio a un tempo di ritenzione successivo è il risultato dell'interazione del deuterio con la colonna di fase normale. Il deuterio è più polare dell'idrogeno; Pertanto, c'è una maggiore interazione con la fase normale della colonna. Se questa separazione avvenisse utilizzando una colonna di fase invertita, lo spostamento avverrebbe a un tempo di ritenzione precedente poiché una porzione più polare avrebbe un'interazione più debole con la fase inversa.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Figura 1"> 
Figura 1. Questo dato è un esempio rappresentativo di analisi lipidomica mirata. La Figura 1A mostra i cromatogrammi ionici totali (TIC) per diversi metaboliti ossidati LA e AA, tra cui 13-oxoODE e 9-oxoODE nel primo pannello, 15-oxoETE nel secondo pannello, 13-HODE e 9-HODE (pannelli 3 e 5) e 20-HETE (pannello 7). Gli HODE e il 20-HETE hanno un corrispondente IS deuterato nel pannello sottostante (4, 6 e 8). Le TIC in Figura 2B mostrano la separazione e le transizioni uniche degli stereoisomeri HETE derivati dall'AA. La Figura 2C è una rappresentazione di PG, isoP e LT. L'energia di collisione (CE), le transizioni MRM e il tempo di ritenzione (RT, min) sono stati ottimizzati utilizzando un Waters 2695 LC accoppiato a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e sono elencati nella Tabella 3 per ciascun composto.
<bordo della tabella="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tempo (min)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>numero arabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>
			<td>numero arabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>96,4</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>
			<td>98</td>
			<td>numero arabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>98</td>
			<td>numero arabo</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabella 1. Condizioni di gradiente HPLC per la separazione lipidomica in fase normale chirale. Il solvente A è composto al 100% da esani e il solvente B è metanolo/isopropanolo (1:1).
<bordo della tabella="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametro della spettrometria di massa</td>
			<td>impostazione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fonte</td>
			<td>APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modo</td>
			<td>Ione negativo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lunghezza del metodo</td>
			<td>40 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larghezza di scansione MRM</td>
			<td>0,002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo di scansione MRM</td>
			<td>0,15 secondi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larghezza picco MRM</td>
			<td>0,70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lente tubolare</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fonte CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 Gas di collisione</td>
			<td>1,5 unità</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura del vaporizzatore</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura capillare</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrente di scarica</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressione del gas della guaina</td>
			<td>25 unità</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressione di spazzamento ionico</td>
			<td>3 unità</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressione ausiliaria del gas</td>
			<td>5 unità</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabella 2. Sopra sono elencati i parametri di spettrometria di massa ottimizzati per la misurazione dei lipidi bioattivi. Questi parametri sono presi da un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
<bordo della tabella="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>composto</td>
			<td>transizione</td>
			<td>CE (eV)</td>
			<td>RT (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-ossoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>9.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-ossoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ossoETE</td>
			<td>317,05 → 113,18</td>
			<td>18</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 198,12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 172,12</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETE</td>
			<td>319,03 → 289,10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325,03 → 295,10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327.04 → 116.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327,13 → 184,11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>15.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327,03 → 226,12</td>
			<td>13</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335,03 → 195,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339,03 → 197,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-ISO-PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>37,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33,1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>33,1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabella 3. Questa tabella elenca i composti rilevati nei cromatogrammi ionici totali della Figura 1A-C. La seconda colonna fornisce la transizione utilizzata per MRM/MS, la terza colonna elenca l'energia di collisione (CE, eV) e l'ultima colonna elenca il tempo di ritenzione (RT, min). I parametri sono stati ottimizzati utilizzando un modulo di separazione Waters 2695 accoppiato a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.</bordo></bordo></bordo>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Gli standard e gli standard interni utilizzati in questo protocollo forniscono una rappresentazione di un metodo di lipidomica mirato. Per l'analisi LC-MS sono stati utilizzati un modulo di separazione Waters 2695 e Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e le impostazioni ottimali dei parametri sono riportate nelle Tabelle 1 e 2. Inoltre, questo protocollo di estrazione è stato progettato per le cellule aderenti, ma può essere modificato per altri tipi di cellule e altre matrici biologiche tra ...

<table><tbody><tr><td>acido 5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-6,8,9,11,12,14,15-d7 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE Standard interno</td></tr><tr><td>5S-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE Standard interno</td></tr><tr><td>12S-idrossi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE Standard interno</td></tr><tr><td>15S-idrossi-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE Standard interno</td></tr><tr><td>20-idrossi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-16,16,17,17,18,18-d6 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE Standard interno</td></tr><tr><td>9S-idrossi-10E,12Z-ottadecadienoico-9,10,12,13-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE Standard interno</td></tr><tr><td>acido 13S-idrossi-9Z,11E-ottadecadienoico-9,10,12,13-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE Standard interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; Standard interno</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-triidrossi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Standard interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Standard interno</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-diidrossi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,acido 17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2 Standard interno</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-diidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 Standard interno</td></tr><tr><td>5S,12R-diidrossi-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoico-6,7,14,15-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Standard interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-triidrossi-tromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Standard interno</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>5R-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>5S-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acido Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8R-idrossi-5Z,9E,11Z, acido 14Z-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8S-idrossi-5Z, 9E,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11R-idrossi-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acido Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11S-idrossi-5Z,8Z,12E, acido 14Z-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12R-idrossi-5Z, 8Z,10E,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12S-idrossi-5Z,8Z,10E,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15R-idrossi-5Z,8Z,11Z, Acido 13E-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15S-idrossi-5Z,8Z,11Z,13E-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>20-idrossi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acido Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE Standard</td></tr><tr><td>9R-idrossi-10E,12Z-acido ottadedecadienoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38405</td><td>9(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9S-idrossi-10E,12Z-acido ottadecadienoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13R-idrossi-9Z,11E-acido ottadecadienoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13S-idrossi-9Z,11E-acido ottadecadienoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF2&alpha; Standard</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-triidrossi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alfa; Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-diidrossi-11-osso-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-diidrossi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-diidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico acido</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-diidrossi-6Z,8E,10E,14Z-acido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Standard</td></tr><tr><td>Acido 9&alfa;,11,15S-triidrossitromba-5Z,13E-dien-1-oico</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td> standard <td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>anidro</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorylbenzyl bromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>idrossido di potassio</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Esano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in vetro da 10 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Tappo a vite</td></tr><tr><td>fenolico Tappi a vite Kimble</td><td>Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Chiralcel ADH</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>Fiale HPLC</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Inserti HPLC</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Il metabolismo degli acidi grassi, come l'acido arachidonico (AA) e l'acido linoleico (LA), provoca la formazione di lipidi bioattivi ossidati, inclusi numerosi stereoisomeri1,2. Questi metaboliti possono essere formati da acidi grassi liberi o esterificati. Molti di questi metaboliti ossidati hanno attività biologica e sono stati implicati in varie malattie tra cui malattie cardiovascolari e neurodegenerative, asma e cancro3-7. I lipidi bioattivi ossidati possono essere formati enzimaticamente o da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Gli enzimi che metabolizzano gli acidi grassi includono la cicloossigenasi (COX), la lipossigenasi (LO) e i citocromi P450 (CYPs)1,8. Il metabolismo enzimatico provoca la formazione enantioselettiva mentre l'ossidazione dei ROS provoca la formazione racemica dei prodotti.
Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sull'analisi di AA- e di alcuni metaboliti bioattivi derivati da LA, potrebbe essere facilmente applicato ai metaboliti di altri acidi grassi. I lipidi bioattivi vengono estratti dal lisato cellulare o dal terreno mediante estrazione liquido-liquido (l-l). All'inizio del processo di estrazione l-l, vengono aggiunti gli standard interni degli isotopi stabili per tenere conto degli errori durante la preparazione del campione. La diluizione degli isotopi stabili (SID) tiene conto anche di eventuali differenze, come la soppressione ionica, che i metaboliti possono sperimentare durante l'analisi della spettrometria di massa (MS)9. Dopo l'estrazione, viene impiegata la derivatizzazione con un reagente a cattura elettronica (EC), il pentafluorilbenzil bromuro (PFB) per aumentare la sensibilità di rilevamento10,11. Il monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) viene utilizzato per aumentare la selettività dell'analisi MS. Prima dell'analisi MS, i lipidi vengono separati utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase normale chirale. Le condizioni HPLC sono ottimizzate per separare gli enantiomeri e vari stereoisomeri dei lipidi monitorati12. Questo specifico metodo LC-MS monitora le prostaglandine (PG), gli isoprostani (isoP), gli acidi idrossieicosatetraenoici (HETE), gli acidi idrossiottadecadienoici (HODE), gli acidi ossoeicosatetraenoici (oxoETE) e gli acidi oxoottadecadienoici (oxoODE); tuttavia, i parametri HPLC e MS possono essere ottimizzati per includere qualsiasi metabolita degli acidi grassi13.
La maggior parte dei metodi bioanalitici attualmente disponibili non tiene conto della quantificazione separata degli enantiomeri. Questo è estremamente importante quando si cerca di dedurre se i metaboliti si sono formati enzimaticamente o dai ROS. Inoltre, i rapporti degli enantiomeri possono fornire la prova di una specifica via enzimatica di formazione. L'uso della SID consente una quantificazione accurata dei metaboliti e tiene conto di eventuali perdite di campione durante la preparazione, nonché delle differenze riscontrate durante la ionizzazione. L'uso del reagente a cattura elettronica PFB aumenta la sensibilità di rilevamento di due ordini di grandezza rispetto ai metodi APCI convenzionali. Nel complesso, questo metodo, SID-LC-EC-ionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI-MRM/MS, è uno dei metodi più sensibili, selettivi e accurati di quantificazione dei lipidi bioattivi.

Questo protocollo dimostrerà l'estrazione e l'analisi di acidi grassi bioattivi liberi ed esterificati dalle cellule. Gli acidi grassi sono accuratamente quantificati utilizzando la diluizione degli isotopi stabili, la cromatografia liquida chirale, la cattura di elettroni, la ionizzazione chimica atmosferica, il monitoraggio delle reazioni multiple, la spettrometria di massa (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Il metodo mira a quantificare con precisione i metaboliti lipidici bioattivi cellulari mediante la combinazione di diluizione di isotopi stabili, fase cnor, cromatografia liquida, cattura elettronica, pressione atmosferica, ionizzazione chimica e spettrometria di massa. Iniziare raccogliendo sia i terreni che i campioni cellulari e aggiungere una miscela standard interna marcata con isotopi pesanti. Estrarre i lipidi bioattivi con solvente organico, quindi derivare i lipidi bioattivi con un reagente a cattura di elettroni e procedere a quantificare con precisione i lipidi bioattivi mediante cromatografia liquida.La spettrometria di massa attraverso l'analisi LCMS sia del lisato cellulare che dei risultati dei terreni determina con precisione la concentrazione di lipidi bioattivi mirati e i livelli dei singoli ER Anant. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la cromatografia liquida in fase inversa, la spettrometria di massa e altri metodi LCMS, è che i singoli e i palchi sono accuratamente quantificati attraverso l'uso della cromatografia in fase normale e della diluizione isotopica stabilizzata. I dati risultanti possono fornire preziose informazioni sui percorsi enzimatici che funzionano nella cellula.Per ogni piastra da 10 centimetri di un aderente, le cellule raccolgono tre millilitri di terreno in una provetta da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Quindi, lavare le celle due volte con PBS. Quindi aggiungere un millilitro di PBS, raschiare le cellule dalla piastra e trasferire il campione in una provetta da centrifuga in vetro da 10 millilitri.Preparare altre otto provette con tre millilitri di PBS per una curva di calibrazione. Quindi aggiungere 10 microlitri dello standard di calibrazione appropriato a ciascuna provetta. Allineare ciascun campione di prova dei tre millilitri di terreno di coltura cellulare raccolti per l'estrazione di lipidi bioattivi liberi.Aggiungere 10 microlitri di miscela standard interna a ciascuno standard di calibrazione e bilanciare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente per elaborare campioni a cinque millilitri di etere datilico e porre su un agitatore per 30 minuti. Centrifugare i campioni e trasferire la fase organica superiore in provette da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Continuare ad asciugare i campioni sotto azoto Innanzitutto, raccogliere i campioni di cellule raccolte mediante centrifugazione e risospendere ogni pallet in due millilitri di PBS by Vortex Reserve 25 microlitri di ciascun campione per la normalizzazione del lisato cellulare.Ora dividi equamente ogni lisato in provette da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Aggiungere altri due millilitri di PBS e 10 microlitri di ISM a ciascun campione per misurare i lipidi cellulari liberi ed evitare la degradazione alcalina dei lipidi come le prostaglandine, utilizzare uno di ciascun campione duplicato per eseguire estrazioni di etere datilico come mostrato in precedenza. Per estrarre i lipidi esterificati, aggiungere cinque millilitri di miscela di cloroformio metanolo a ciascuno dei campioni rimanenti.Mettere su uno shaker a bassa velocità per 30 minuti, quindi centrifugare per 10 minuti. A questo punto, raccogliere lo strato organico inferiore e asciugare i campioni sotto azoto per sificare i lipidi esterificati. Aggiungere 0,5 millilitri di idrossido di potassio normale 0,4 in metanolo all'80% in ogni provetta.Incubare i campioni a 60 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere due millilitri di PBS e regolare il pH due sei con acido cloridrico concentrato. Infine, aggiungere 10 microlitri di ISM a ciascun campione e procedere all'estrazione dell'etere datilico ai campioni essiccati e agli standard di calibrazione.Aggiungere i reagenti di derivatizzazione nell'ordine specificato. Quindi agitare i campioni e incubare a 60 gradi Celsius per un'ora. A questo punto, asciugare i campioni sotto azoto prima di conservarli e analizzarli.Questo metodo utilizza una combinazione di diluizione di isotopi stabili, chii, cromatografia liquida, cattura di elettroni, pressione atmosferica, ionizzazione chimica e analisi di spettrometria di massa. Ricostituire i campioni e gli standard di calibrazione in 100 microlitri di esano etanolo e trasferire gli interi campioni in fiale HPLC con inserto per posizionare i campioni nel campionatore automatico refrigerato. Creare un elenco di esempio per l'analisi.Successivamente, impostare i metodi HPLC e MS utilizzando i parametri descritti nella tabella uno e nella tabella due del protocollo scritto allegato per la normale separazione di fase. Un impacco chirale, una colonna DH a 30 gradi Celsius, inietta il campione e inizia la corsa. Ora impostate l'MS in modalità ioni negativi utilizzando la sorgente PCI A.Inizia con uno spazio vuoto in esano per equilibrare la colonna. Quindi, eseguire i campioni standard di calibrazione in ordine crescente di concentrazione SM. Continuare a elaborare campioni di prova di terreni di coltura dopo la separazione HBLC.Aggiungere la colonna del perno di metanolo per evitare la deposizione sull'ago corona. Utilizzando i dati generati dagli standard. Creare una curva di calibrazione tracciando l'area del campione sull'asse Y e la concentrazione standard sull'asse x ricava l'equazione Y uguale a MX più B.Infine, determinare le concentrazioni del campione di test di lipidi bioattivi per la cellula. Lisati. Normalizzare questi valori dividendo la concentrazione determinata di lipidi bioattivi per il numero di cellule per piastra o la proteina totale normalizzata nei passaggi precedenti. I dati provenienti dal monitoraggio di reazioni multiple indicano diversi acidi linoleico e arachidonico.I metaboliti ossidati. 13 e nove, insieme ai corrispondenti 13 e nove Oxo ode sono derivati dall'acido linoleico. Inoltre, come previsto, sono presenti anche i metaboliti del calore dell'acido arachidonico e i loro prodotti ossidati.C'è un piccolo cambiamento nel tempo di ritenzione dello standard interno declassato rispetto allo standard non etichettato. È importante sottolineare che questo protocollo separa anche il calore e le corna e determina transizioni uniche per gli isomeri stereo che possono derivare dall'ossidazione enzimatica di un acido arachidonico o dalla reazione con specie reattive dell'ossigeno. Ad esempio, questo cromatogramma mostra la separazione tra gli isomeri stereo r e s di cinque.L'analisi lipidomica termica è una tecnica potente per l'analisi di numerose specie lipidiche. Ad esempio, questo esperimento valuta e quantifica le prostaglandine, gli isop seni e il leucotriene B quattro. Oltre ai calori di cui si nutre Oxo e ai metaboliti omega idrossilati, questo metodo può essere ottimizzato per l'estrazione di lipidi bioattivi da altre matrici biologiche come plasma, urina e tessuti.In alcuni casi, i lipidi bioattivi sono stati utilizzati come biomarcatori di risposta allo stress ossidativo.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

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Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Qui viene presentato un protocollo per l'etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Qui viene presentato un metodo per lo screening delle strutture lipidiche attraverso la marcatura degli isotopi stabili utilizzando il loro tempo di ritenzione, mobilità e frammentazione.

Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

Descriviamo un metodo per l'utilizzo della ciclodestrina per mediare lo scambio tra i lipidi della membrana plasmatica con i lipidi esogeni. Questa tecnica può essere abbinata a esperimenti che studiano le proteine transmembrana, che si comportano in modo diverso in ambienti lipidici simili a zattere rispetto agli ambienti non simili a zattere.

Saggio di scambio lipidico in cellule viventi

Impara l'estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate con cromatografia liquida-spettrometria di massa e diluizione isotopica stabile. Questo metodo consente la quantificazione accurata dei metaboliti lipidici bioattivi.

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

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