Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

Il metodo mira a quantificare con precisione i metaboliti lipidici bioattivi cellulari mediante la combinazione di diluizione di isotopi stabili, fase cnor, cromatografia liquida, cattura elettronica, pressione atmosferica, ionizzazione chimica e spettrometria di massa. Iniziare raccogliendo sia i terreni che i campioni cellulari e aggiungere una miscela standard interna marcata con isotopi pesanti. Estrarre i lipidi bioattivi con solvente organico, quindi derivare i lipidi bioattivi con un reagente a cattura di elettroni e procedere a quantificare con precisione i lipidi bioattivi mediante cromatografia liquida.

La spettrometria di massa attraverso l'analisi LCMS sia del lisato cellulare che dei risultati dei terreni determina con precisione la concentrazione di lipidi bioattivi mirati e i livelli dei singoli ER Anant. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la cromatografia liquida in fase inversa, la spettrometria di massa e altri metodi LCMS, è che i singoli e i palchi sono accuratamente quantificati attraverso l'uso della cromatografia in fase normale e della diluizione isotopica stabilizzata. I dati risultanti possono fornire preziose informazioni sui percorsi enzimatici che funzionano nella cellula.

Per ogni piastra da 10 centimetri di un aderente, le cellule raccolgono tre millilitri di terreno in una provetta da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Quindi, lavare le celle due volte con PBS. Quindi aggiungere un millilitro di PBS, raschiare le cellule dalla piastra e trasferire il campione in una provetta da centrifuga in vetro da 10 millilitri.

Preparare altre otto provette con tre millilitri di PBS per una curva di calibrazione. Quindi aggiungere 10 microlitri dello standard di calibrazione appropriato a ciascuna provetta. Allineare ciascun campione di prova dei tre millilitri di terreno di coltura cellulare raccolti per l'estrazione di lipidi bioattivi liberi.

Aggiungere 10 microlitri di miscela standard interna a ciascuno standard di calibrazione e bilanciare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente per elaborare campioni a cinque millilitri di etere datilico e porre su un agitatore per 30 minuti. Centrifugare i campioni e trasferire la fase organica superiore in provette da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Continuare ad asciugare i campioni sotto azoto Innanzitutto, raccogliere i campioni di cellule raccolte mediante centrifugazione e risospendere ogni pallet in due millilitri di PBS by Vortex Reserve 25 microlitri di ciascun campione per la normalizzazione del lisato cellulare.

Ora dividi equamente ogni lisato in provette da centrifuga di vetro da 10 millilitri. Aggiungere altri due millilitri di PBS e 10 microlitri di ISM a ciascun campione per misurare i lipidi cellulari liberi ed evitare la degradazione alcalina dei lipidi come le prostaglandine, utilizzare uno di ciascun campione duplicato per eseguire estrazioni di etere datilico come mostrato in precedenza. Per estrarre i lipidi esterificati, aggiungere cinque millilitri di miscela di cloroformio metanolo a ciascuno dei campioni rimanenti.

Mettere su uno shaker a bassa velocità per 30 minuti, quindi centrifugare per 10 minuti. A questo punto, raccogliere lo strato organico inferiore e asciugare i campioni sotto azoto per sificare i lipidi esterificati. Aggiungere 0,5 millilitri di idrossido di potassio normale 0,4 in metanolo all'80% in ogni provetta.

Incubare i campioni a 60 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere due millilitri di PBS e regolare il pH due sei con acido cloridrico concentrato. Infine, aggiungere 10 microlitri di ISM a ciascun campione e procedere all'estrazione dell'etere datilico ai campioni essiccati e agli standard di calibrazione.

Aggiungere i reagenti di derivatizzazione nell'ordine specificato. Quindi agitare i campioni e incubare a 60 gradi Celsius per un'ora. A questo punto, asciugare i campioni sotto azoto prima di conservarli e analizzarli.

Questo metodo utilizza una combinazione di diluizione di isotopi stabili, chii, cromatografia liquida, cattura di elettroni, pressione atmosferica, ionizzazione chimica e analisi di spettrometria di massa. Ricostituire i campioni e gli standard di calibrazione in 100 microlitri di esano etanolo e trasferire gli interi campioni in fiale HPLC con inserto per posizionare i campioni nel campionatore automatico refrigerato. Creare un elenco di esempio per l'analisi.

Successivamente, impostare i metodi HPLC e MS utilizzando i parametri descritti nella tabella uno e nella tabella due del protocollo scritto allegato per la normale separazione di fase. Un impacco chirale, una colonna DH a 30 gradi Celsius, inietta il campione e inizia la corsa. Ora impostate l'MS in modalità ioni negativi utilizzando la sorgente PCI A.

Inizia con uno spazio vuoto in esano per equilibrare la colonna. Quindi, eseguire i campioni standard di calibrazione in ordine crescente di concentrazione SM. Continuare a elaborare campioni di prova di terreni di coltura dopo la separazione HBLC.

Aggiungere la colonna del perno di metanolo per evitare la deposizione sull'ago corona. Utilizzando i dati generati dagli standard. Creare una curva di calibrazione tracciando l'area del campione sull'asse Y e la concentrazione standard sull'asse x ricava l'equazione Y uguale a MX più B.

Infine, determinare le concentrazioni del campione di test di lipidi bioattivi per la cellula. Lisati. Normalizzare questi valori dividendo la concentrazione determinata di lipidi bioattivi per il numero di cellule per piastra o la proteina totale normalizzata nei passaggi precedenti. I dati provenienti dal monitoraggio di reazioni multiple indicano diversi acidi linoleico e arachidonico.

I metaboliti ossidati. 13 e nove, insieme ai corrispondenti 13 e nove Oxo ode sono derivati dall'acido linoleico. Inoltre, come previsto, sono presenti anche i metaboliti del calore dell'acido arachidonico e i loro prodotti ossidati.

C'è un piccolo cambiamento nel tempo di ritenzione dello standard interno declassato rispetto allo standard non etichettato. È importante sottolineare che questo protocollo separa anche il calore e le corna e determina transizioni uniche per gli isomeri stereo che possono derivare dall'ossidazione enzimatica di un acido arachidonico o dalla reazione con specie reattive dell'ossigeno. Ad esempio, questo cromatogramma mostra la separazione tra gli isomeri stereo r e s di cinque.

L'analisi lipidomica termica è una tecnica potente per l'analisi di numerose specie lipidiche. Ad esempio, questo esperimento valuta e quantifica le prostaglandine, gli isop seni e il leucotriene B quattro. Oltre ai calori di cui si nutre Oxo e ai metaboliti omega idrossilati, questo metodo può essere ottimizzato per l'estrazione di lipidi bioattivi da altre matrici biologiche come plasma, urina e tessuti.

In alcuni casi, i lipidi bioattivi sono stati utilizzati come biomarcatori di risposta allo stress ossidativo.