Name: Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Scopri come applicare forza controllata al nucleo di cellule aderenti viventi usando una micropipetta. Questo metodo misura le proprietà meccaniche nucleari e l'integrazione nucleo-citoschelatro in diversi tipi cellulari.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EB014869.

1. preparare le celle per l'Imaging
Nota: La sonda di forza diretta (DFP) può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula aderente. Qui, fibroblasti NIH 3T3 del mouse sono usati come la linea cellulare modello per questo protocollo.
<ol><li>Cellule di cultura NIH 3T3 del fibroblasto dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino di donatore e 1% penicillina-streptomicina su un fondo di 35 mm vetro piatto fino al confluency di desiderata. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO2.<ol>
<li>Assicurarsi di ricoprire tutti i piatti di fondo di vetro 35mm con 5 µ g/mL di fibronectina (o proteina simile ECM), prima della semina di cellule NIH 3T3 per l'imaging. Nota: Le cellule devono essere pienamente diffuso e aderente sul piatto per l'esperimento. Non ci sono vincoli in termini di confluenza per utilizzare il metodo DFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immediatamente prima dell'esperimento, lavare le cellule due volte con PBS, seguita da un lavaggio singolo con il mezzo di crescita completa.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di terreno di crescita completa il piatto di fondo di vetro.</li>
</ol>2. microscopia e acquisizione di immagini
Nota: Un invertito fluorescenza Microscopio (o equivalente) con micromanipolatore installato per il braccio di lato, secondo le raccomandazioni del produttore. Il microscopio deve anche essere dotato di una camera climatica per mantenere la temperatura a 37 ° C e il livello di CO2 al 5%. È necessario anche un micromanipolatore e microinjector collegato al microscopio. Un olio immersione 40x / 1.3 NA o 60x / 1,49 NA (o obiettivi equivalenti) sono raccomandati per gli esperimenti. Il microscopio deve essere montato su un tavolo di isolamento delle vibrazioni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> Figura 1 . Microscopio di messa a fuoco e di deformazione nucleare A. massima deformazione nucleare e rilassamento della deformazione nucleare. Prima di calcolare la deformazione massima nucleare, i bordi posteriori delle forme nucleare erano in primo luogo ha coinciso per correggere per la traduzione del nucleo deformato. La forma del nucleo al momento del distacco di punta della micropipetta è stata sovrapposta la forma nucleare iniziale prima di tirare. La differenza nell'area tra le due forme è stata misurata come Δun1. La massima deformazione nucleare è stata definita come ΔA1 diviso per l'area nucleare originale. Allo stesso modo, un secondo parametro, ΔA2, può essere definito mediante la sovrapposizione della forma nucleare finale allo stato stazionario dopo distacco micropipetta della forma nucleare originale. B. lo stato attivo della cella al piano A e quindi spostare il piano focale fino a piano B per trovare la punta di una micropipetta. Durante la formazione immagine, la micropipetta è stato tradotto a destra (direzione della freccia arancione). Questa figura è stata modificata da Neelam et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Accendere il microinjector secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Con un contagocce di olio di immersione, applicare una sola goccia di olio per immersione in cima la lente dell'obiettivo.</li>
	<li>Fissare saldamente il piatto nel titolare del piatto e caricare il titolare di piatto sul palco. Nota: Le celle devono essere mantenute a 37 ° C e 5% di CO2 in tutto l'esperimento.</li>
	<li>Regolare l'altezza dell'obiettivo di portare le cellule a fuoco (aereo A, Figura 1B).</li>
	<li>Spostare il tavolino del microscopio per trovare una cella di interesse.</li>
	<li>Ruotare il joystick sul micromanipolatore per spostare il supporto di dispensare alla posizione superiore. Caricare la micropipetta di punta di diametro 0,5 µm al supporto per dispensare.<ol>
<li>Per evitare l'adesione delle cellule per la micropipetta, pre-trattare la punta della micropipetta con 0,3 mg/mL di soluzione di PLL-g-PEG per 1 h a temperatura ambiente. Test per adesione toccando la micropipetta al nucleo senza alcuna pressione di aspirazione, e quindi tradurre la micropipetta dal nucleo. L'assenza di adesione possa essere individuata da una completa mancanza di deformazione nucleare e traduzione. Nota: Si prega di seguire suggerimenti di fabbricazione per aprire il pacchetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sollevare il piano focale obiettivo sopra A aereo e parte superiore della cella per piano B regolando il controllo fine (Figura 1B, vedere il punto 2.4).</li>
	<li>Impostare il micromanipolatore controllo grossolana . Portare lentamente la micropipetta giù per piano B guardando per la silhouette della micropipetta, fino a quando la micropipetta viene completamente messa a fuoco.</li>
	<li>Una volta che la punta della micropipetta è a fuoco, impostare il micromanipolatore controllo bene .</li>
	<li>Abbassare l'obiettivo per il piano equatoriale della cellula (aereo A, Figura 1B) e abbassare la micropipetta a circa 15 µm sopra piano A (Figura 1B, micropipetta tratteggiata).</li>
	<li>Impostare la pressione di compensazione (Pc) su microinjector alla pressione desiderata; attendere alcuni secondi per la pressione si stabilizzi. Nota: Il set point di pressione ottimale dipende dal tipo di cellula sia gli obiettivi specifici dell'esperimento. Per la maggior parte dei casi, 300 hPa sarebbe un buon punto di partenza.</li>
	<li>Garantire che la micropipetta non sia intasata utilizzando l'impostazione pulite sul pannello micromanipolatore e controllo per assicurarsi che le bolle d'aria emergere dalla punta della micropipetta.</li>
	<li>Inserire la punta nella cella abbassando gradualmente la micropipetta fino a quando la punta è leggermente toccando la superficie nucleare. Nota: Quando si abbassa la micropipetta, la silhouette della punta della micropipetta diventerà chiara come essa viene messa a fuoco. Prima la micropipetta tocca il nucleo, sollevare l'obiettivo messa a fuoco e allineare la punta della micropipetta con nucleo (stessa coordinata x-y, z-piano superiore). Tornare il fuoco al piano equatoriale del nucleo (aereo A, Figura 1B) e abbassare gradualmente la punta della micropipetta.</li>
	<li>Creare una guarnizione tra la punta della micropipetta e la membrana nucleare scollegando il tubo di alimentazione di pressione dal sistema di microiniezione, aprendo così l'estremità del tubo micropipetta all'atmosfera. Questo passaggio crea una pressione negativa uguale a Pc sulla superficie nucleare.</li>
	<li>Acquisire immagini con il software di raccolta immagini di microscopi. Impostare un'acquisizione avi (video) o nd-acquisizione (immagini) del software di raccolta di immagine. Nota: Per qualsiasi imaging l'acquisizione di software, è istituito da formazione immagine video in tempo reale o acquisizioni di time-lapse immagine con un intervallo di tempo breve.</li>
	<li>Attiva/disattiva per le fluorescenti corrispondente canale di imaging (cioè, GFP, RFP, ecc.) e iniziare la formazione immagine.</li>
	<li>Tradurre la punta della micropipetta lontano dal corpo della cella (a destra, Figura 1B) finché il nucleo non si stacca dalla micropipetta. Nota: Tirare la punta lungo la direzione x positiva (a destra nel campo visivo). Il tasso di trazione può essere programmato e controllato da computer o il joystick può essere spostato manualmente. Non abbiamo trovato alcuna correlazione tra la trazione tasso e deformazione nucleare15 suggerendo una risposta prevalentemente elastica per forzare.</li>
</ol>3. analisi dei dati
<ol><li>Eseguire l'analisi di immagine con qualsiasi software di elaborazione delle immagini base disponibile. L'entità della deformazione nucleare può essere quantificata dal ceppo di lunghezza (Ɛ) o il ceppo di zona (Figura 1A). Quantificare il ceppo di lunghezza utilizzando l'equazione 1, dove L e L0 rappresentano le lunghezze del nucleo a deformazione massima e la posizione iniziale, rispettivamente. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(Equazione 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'integrazione meccanica del nucleo con il citoscheletro di misura è una sfida per i metodi più attuali, ad esempio micropipetta aspirazione16, perché richiedono entrambi nuclei isolati (dove il nucleo è disaccoppiato dal citoscheletro) o nuclei in cellule sospese (dove le forze extracellulari, quali le forze di trazione, sono assenti). Vigore è stato applicato al nucleo applicando deformazione biassiale a aderente celle a una membrana17,18</sup...

Patologie come il cancro coinvolgono alterazioni nucleare forma e struttura1,2, che sono generalmente accompagnati da un 'addolcimento' del nucleo3,4. Nucleare resistenza alla deformazione meccanica è stata caratterizzata generalmente applicando una forza di nuclei isolati5.
Il nucleo in cellule è molecolarmente collegato al citoscheletro dal Linker di Nucleoskeleton e citoscheletro (LINC) complesso6,7,8,9. Di conseguenza, il nucleo è integrato meccanicamente con il citoscheletro e, attraverso le adesioni cellula-substrato, la matrice extracellulare. Meccanicamente sondando il nucleo all'interno di cellule aderenti può fornire la comprensione in questa integrazione meccanica. Metodi per manipolare i nuclei in cellule viventi includono micropipetta aspirazione10,11e a forza atomica microscopia12,13,14. Recentemente abbiamo descritto una sonda di forza diretta (DFP) che si applica forze meccaniche direttamente sul nucleo in un vivente cellulari aderenti15.
Qui, descriviamo la procedura per l'utilizzo di un sistema di microiniezione che è comunemente disponibile in strutture di microscopia di applicare una forza meccanica di nano-scala nota, direttamente al nucleo in una cellula aderente. Un femtotip (punta della micropipetta diametro di 0,5 µm) è montato e collegato al sistema di microiniezione di un tubo. La punta, posizionata ad un angolo di 45° rispetto alla superficie della piastra di coltura, si abbassa fino a adiacente alla superficie nucleare. Il tubo viene quindi disconnesso e aperto all'atmosfera, che crea una pressione negativa di aspirazione sulla superficie nucleare e sigilla la punta della micropipetta contro la superficie nucleare. Attraverso la traduzione della punta della micropipetta, il nucleo è deformato e alla fine (a seconda della grandezza della forza applicata), staccato dalla micropipetta. Questo distacco si verifica quando le forze antagoniste (resiste), esercitate dal nucleo e cella, uguale la forza di aspirazione applicata dalla micropipetta. Analisi può essere effettuata misurando lo spostamento del nucleo, il ceppo di lunghezza (equazione 1), o il ceppo di zona (Figura 1A).

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtopunte&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>fuori produzione, modello equivalente attuale: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Modello attuale FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor immersione in olio 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF immersione in olio 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Bovine Serum (DBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16030074</td><td>Siero NIH 3T3</td></tr><tr><td>Modifica di Dulbecco di Eagle (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 medium</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 integratore medio</td></tr><tr><td>Olio da immersione Tipo LDF Non fluorescente</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Olio da immersione per obiettivo</td></tr></tbody></table>

una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Le proprietà meccaniche del nucleo determinano la sua risposta a forze meccaniche generate nelle cellule. Poiché il nucleo è molecolarmente continuo con il citoscheletro, metodi sono necessari per sondare il suo comportamento meccanico in cellule aderenti. Qui, discutiamo la sonda di forza diretta (DFP) come strumento per applicare la forza direttamente al nucleo in una cellula aderente vivente. Noi attribuiamo una micropipetta stretta per la superficie nucleare con aspirazione. La micropipetta è traslata lontano il nucleo, che fa sì che il nucleo di deformare e tradurre. Quando la forza di ripristino è uguale alla forza di aspirazione, il nucleo si stacca e rilassa elasticamente. Poiché la pressione di aspirazione è noto con precisione, la forza sulla superficie nucleare è noto. Questo metodo ha rivelato che le forze su scala nanometrica sono sufficienti per deformare e tradurre il nucleo in cellule aderenti e identificati gli elementi del citoscheletro che consentono il nucleo resistere alle forze. La DFP può essere utilizzata per sezionare i contributi di componenti cellulari e nucleare nucleare proprietà meccaniche in cellule viventi.

La Figura 2A Mostra la forzatura di un nucleo di fibroblasto NIH 3T3 del mouse. Come la punta di una micropipetta è tradotto a destra, il nucleo si deforma e alla fine si stacca dalla punta della micropipetta. Il ceppo di lunghezza del nucleo è visto ad aumentare con l'aumento della forza di aspirazione (Figura 2B). Il bordo anteriore del nucleo (micropipetta tirando bordo) forma una protrusione nucleare ed il bordo d'uscita è sp...

In questo protocollo, descriviamo un metodo micropipetta per applicare direttamente una forza controllata al nucleo in una cellula vivente. Questo test permette di interrogatorio di proprietà meccaniche nucleari nella cellula viva, aderente.

Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanica nucleare. Ad esempio, qual è la forza necessaria per deformare il nucleo in una cellula? Quali sono i contributi dei componenti cellulari e nucleari alla resistenza nucleare alla deformazione?Oppure, l'accoppiamento nucleare con le strutture cellulari varia con il tipo di cellula? Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di applicare la forza di sondaggio per deformare il nucleo-citoscheletro integrante in una cellula aderente vivente. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per fornire informazioni sulle proprietà meccaniche nucleari nelle celle NIH-3T3, può essere applicato anche a qualsiasi tipo di cellula aderente, come ad esempio sondare le proprietà meccaniche nucleari nelle cellule progeniche di Hutchinson-Gilford.Per iniziare questa procedura, rivestire un piatto con fondo di vetro da 35 millimetri con 5 microgrammi per millilitro di fibronectina. Quindi, coltivare le cellule dei fibroblasti NIH 3T3 in DMEM integrate con il 10% di siero bovino del donatore e l'1% di penicillina-streptomicina sul piatto rivestito a 37 gradi Celsius fino alla confluenza desiderata. Immediatamente prima dell'esperimento, lavare le cellule due volte con PBS, seguito da un singolo lavaggio con terreno di crescita completo.Successivamente, aggiungi tre millilitri di terreno di coltura completo in un piatto con fondo di vetro. In questa procedura, accendere il microiniettore. Utilizzando un contagocce per olio da immersione, applicare una goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo.Quindi, fissare saldamente il piatto al portapiatti e caricare il portapiatti sul tavolino. Si prega di notare che le celle devono essere mantenute a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tutta la durata dell'esperimento. Quindi, regola l'altezza dell'obiettivo per mettere a fuoco le cellule.Sposta il tavolino del microscopio per trovare una cella di interesse. Utilizzando il micromanipolatore, spostare il supporto della pipetta nella posizione più alta. Successivamente, caricare la micropipetta con un puntale di 0,5 micrometri di diametro sul supporto della pipetta.Quindi sollevare il piano focale dell'obiettivo sopra il piano A e la parte superiore della cella sul piano B regolando il controllo di precisione. Quindi, impostare il micromanipolatore sulla posizione di controllo grossolana. Portare lentamente la micropipetta sul piano B osservando la sagoma della micropipetta fino a quando la micropipetta non è completamente a fuoco.Una volta che la punta della micropipetta è a fuoco, impostare il micromanipolatore su un controllo di precisione. Successivamente, abbassare l'obiettivo sul piano equatoriale della cellula e abbassare la micropipetta a circa 15 micrometri al di sopra di tale livello. Impostare la pressione di compensazione sul microiniettore alla pressione desiderata.Attendere alcuni secondi affinché la pressione si stabilizzi. È importante controllare se il puntale della pipetta è rotto o ostruito, altrimenti la misurazione della forza sarebbe imprecisa. Assicurarsi che la micropipetta non sia ostruita utilizzando l'impostazione di pulizia sul pannello del micromanipolatore e assicurarsi che le bolle d'aria fuoriescano dalla punta della micropipetta.Quindi, inserire la punta della micropipetta nella cella fino a toccare leggermente la superficie nucleare. Creare una tenuta tra il puntale della micropipetta e la membrana nucleare scollegando il tubo di alimentazione a pressione dal sistema di microiniezione, aprendo così l'estremità della micropipetta all'atmosfera. Questo passaggio crea una pressione negativa pari alla pressione di compensazione sulla superficie nucleare.Quindi, apri il software di raccolta delle immagini. Impostare un'acquisizione AVI per il video o un'acquisizione ND per le immagini nel software di raccolta delle immagini. Quindi, passare al canale di imaging fluorescente corrispondente e iniziare l'imaging.Allontanare la punta della micropipetta dal corpo della cellula fino a quando il nucleo non si stacca dalla micropipetta. Questa figura mostra la forzatura di un nucleo di fibroblasto di topo NIH 3T3. Quando la punta della micropipetta si sposta verso destra, il nucleo si deforma e alla fine si stacca dalla punta della micropipetta.Si vede che la deformazione in lunghezza del nucleo aumenta con l'aumentare della forza di aspirazione. Il bordo anteriore del nucleo forma una sporgenza nucleare e il bordo d'uscita viene spostato dalla sua posizione originale. La lunghezza della sporgenza è molto maggiore dello spostamento del bordo d'uscita, suggerendo una stretta integrazione tra il nucleo e il citoplasma circostante.Le scale temporali sono brevi per il rilassamento del bordo anteriore nucleare e del bordo posteriore nucleare. La sonda a forza diretta è stata utilizzata per determinare il contributo delle strutture intranucleari e citoscheletriche alla resistenza del nucleo alla deformazione. Le immagini fluorescenti hanno mostrato la sovrapposizione del nucleo prima e dopo nella condizione indicata.Sebbene non siano state riscontrate differenze significative nella deformazione o nella traduzione nucleare dopo la rottura della F-actina o la rottura dei microtubuli, la riduzione dell'espressione del menten attraverso il knockdown basato su siRNA ha comportato una traduzione e una deformazione nucleare significativamente maggiori. Ciò suggerisce che i filamenti intermedi menten nei fibroblasti sono il principale elemento citoscheletrico che ha aiutato il nucleo a resistere alla forza locale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare una forza controllata e nota al nucleo in una cellula aderente vivente.

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Biochimica

Vi presentiamo due indipendenti, microscopio a base di strumenti per misurare le deformazioni indotte nucleare e del citoscheletro in camere singole, cellule viventi aderenti in risposta alla applicazione dello sforzo globale o localizzato. Queste tecniche vengono utilizzate per determinare la rigidità nucleare (cioè, deformabilità) e di sondare la trasmissione intracellulare vigore tra il nucleo e il citoscheletro.

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali &gt;4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.

Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

L'interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Scopri come applicare forza controllata al nucleo di cellule aderenti viventi usando una micropipetta. Questo metodo misura le proprietà meccaniche nucleari e l'integrazione nucleo-citoschelatro in diversi tipi cellulari.

Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

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