Una sonda di forza diretta per la misura di integrazione meccanica tra il nucleo e il citoscheletro

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanica nucleare. Ad esempio, qual è la forza necessaria per deformare il nucleo in una cellula? Quali sono i contributi dei componenti cellulari e nucleari alla resistenza nucleare alla deformazione?

Oppure, l'accoppiamento nucleare con le strutture cellulari varia con il tipo di cellula? Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di applicare la forza di sondaggio per deformare il nucleo-citoscheletro integrante in una cellula aderente vivente. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per fornire informazioni sulle proprietà meccaniche nucleari nelle celle NIH-3T3, può essere applicato anche a qualsiasi tipo di cellula aderente, come ad esempio sondare le proprietà meccaniche nucleari nelle cellule progeniche di Hutchinson-Gilford.

Per iniziare questa procedura, rivestire un piatto con fondo di vetro da 35 millimetri con 5 microgrammi per millilitro di fibronectina. Quindi, coltivare le cellule dei fibroblasti NIH 3T3 in DMEM integrate con il 10% di siero bovino del donatore e l'1% di penicillina-streptomicina sul piatto rivestito a 37 gradi Celsius fino alla confluenza desiderata. Immediatamente prima dell'esperimento, lavare le cellule due volte con PBS, seguito da un singolo lavaggio con terreno di crescita completo.

Successivamente, aggiungi tre millilitri di terreno di coltura completo in un piatto con fondo di vetro. In questa procedura, accendere il microiniettore. Utilizzando un contagocce per olio da immersione, applicare una goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo.

Quindi, fissare saldamente il piatto al portapiatti e caricare il portapiatti sul tavolino. Si prega di notare che le celle devono essere mantenute a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tutta la durata dell'esperimento. Quindi, regola l'altezza dell'obiettivo per mettere a fuoco le cellule.

Sposta il tavolino del microscopio per trovare una cella di interesse. Utilizzando il micromanipolatore, spostare il supporto della pipetta nella posizione più alta. Successivamente, caricare la micropipetta con un puntale di 0,5 micrometri di diametro sul supporto della pipetta.

Quindi sollevare il piano focale dell'obiettivo sopra il piano A e la parte superiore della cella sul piano B regolando il controllo di precisione. Quindi, impostare il micromanipolatore sulla posizione di controllo grossolana. Portare lentamente la micropipetta sul piano B osservando la sagoma della micropipetta fino a quando la micropipetta non è completamente a fuoco.

Una volta che la punta della micropipetta è a fuoco, impostare il micromanipolatore su un controllo di precisione. Successivamente, abbassare l'obiettivo sul piano equatoriale della cellula e abbassare la micropipetta a circa 15 micrometri al di sopra di tale livello. Impostare la pressione di compensazione sul microiniettore alla pressione desiderata.

Attendere alcuni secondi affinché la pressione si stabilizzi. È importante controllare se il puntale della pipetta è rotto o ostruito, altrimenti la misurazione della forza sarebbe imprecisa. Assicurarsi che la micropipetta non sia ostruita utilizzando l'impostazione di pulizia sul pannello del micromanipolatore e assicurarsi che le bolle d'aria fuoriescano dalla punta della micropipetta.

Quindi, inserire la punta della micropipetta nella cella fino a toccare leggermente la superficie nucleare. Creare una tenuta tra il puntale della micropipetta e la membrana nucleare scollegando il tubo di alimentazione a pressione dal sistema di microiniezione, aprendo così l'estremità della micropipetta all'atmosfera. Questo passaggio crea una pressione negativa pari alla pressione di compensazione sulla superficie nucleare.

Quindi, apri il software di raccolta delle immagini. Impostare un'acquisizione AVI per il video o un'acquisizione ND per le immagini nel software di raccolta delle immagini. Quindi, passare al canale di imaging fluorescente corrispondente e iniziare l'imaging.

Allontanare la punta della micropipetta dal corpo della cellula fino a quando il nucleo non si stacca dalla micropipetta. Questa figura mostra la forzatura di un nucleo di fibroblasto di topo NIH 3T3. Quando la punta della micropipetta si sposta verso destra, il nucleo si deforma e alla fine si stacca dalla punta della micropipetta.

Si vede che la deformazione in lunghezza del nucleo aumenta con l'aumentare della forza di aspirazione. Il bordo anteriore del nucleo forma una sporgenza nucleare e il bordo d'uscita viene spostato dalla sua posizione originale. La lunghezza della sporgenza è molto maggiore dello spostamento del bordo d'uscita, suggerendo una stretta integrazione tra il nucleo e il citoplasma circostante.

Le scale temporali sono brevi per il rilassamento del bordo anteriore nucleare e del bordo posteriore nucleare. La sonda a forza diretta è stata utilizzata per determinare il contributo delle strutture intranucleari e citoscheletriche alla resistenza del nucleo alla deformazione. Le immagini fluorescenti hanno mostrato la sovrapposizione del nucleo prima e dopo nella condizione indicata.

Sebbene non siano state riscontrate differenze significative nella deformazione o nella traduzione nucleare dopo la rottura della F-actina o la rottura dei microtubuli, la riduzione dell'espressione del menten attraverso il knockdown basato su siRNA ha comportato una traduzione e una deformazione nucleare significativamente maggiori. Ciò suggerisce che i filamenti intermedi menten nei fibroblasti sono il principale elemento citoscheletrico che ha aiutato il nucleo a resistere alla forza locale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare una forza controllata e nota al nucleo in una cellula aderente vivente.