Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

L'obiettivo generale di questo metodo è automatizzare l'analisi della linea germinale di Caenorhabditis elegans per studiarne i nuclei, le proteine e la distribuzione del citoscheletro. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo di C.Elegans sul numero di nuclei e spermatozoi, sulla distribuzione nucleare e sulla struttura citoscheletrica della linea germinale. I principali vantaggi di questa tecnica sono la riduzione dei tempi di analisi, l'aumento delle dimensioni del campione e l'eliminazione dell'errore umano associato all'analisi manuale.

Per visualizzare i campioni, posizionare i vetrini con linee germinali colorate nel supporto per vetrini sopra l'obiettivo 63X di un microscopio confocale e individuare una linea germinale. Metti a fuoco la parte superiore della linea germinale e contrassegnala con il software del microscopio confocale. Una volta stabilito lo spessore totale della linea germinale, definire lo spessore di ciascuna fetta fino a 0,5 micrometri e contrassegnare la linea germinale completa.

Quindi, avvia l'acquisizione, scansionando ogni fetta otto volte e calcolando la media dei valori per migliorare la qualità dell'immagine. Quando tutte le immagini sono state ottenute, importarle in un programma software di analisi delle immagini appropriato e utilizzare lo strumento funzione superficie per selezionare la regione mitotica. Apparirà un'immagine dell'estremità distale della linea germinale.

Annullare la procedura guidata di creazione automatica della superficie e disegnare manualmente una regione di interesse attorno alla regione mitotica in corrispondenza della prima e dell'ultima sezione dell'immagine dalla pila tridimensionale. Fate clic su Crea superficie (Create Surface), quindi su Maschera canale (Mask Channel) per mascherare tutti i canali ad eccezione del canale DAPI. Utilizzando lo strumento funzione spot, definire i parametri dimensionali della regione mitotica con un diametro XY di due micrometri e con il diametro Z non definito.

Fare clic su sottrai sfondo per sottrarre lo sfondo. Per definire la soglia minima, aumentare la soglia minima di rendering 3D su una linea germinale wild-type colorata DAPI fino a quando il primo punto non appare al di fuori della linea germinale e generare un modello 3D per ogni regione. Dopo aver salvato le immagini, fare clic sulla tabella per visualizzare il numero di nuclei, come generato automaticamente dal software, ed esportare le immagini come file TIFF.

Per la zona di transizione, create la superficie come descritto in precedenza. Quindi, fare clic su Maschera canale per mascherare tutti i canali tranne il canale DAPI. Utilizzando la funzione spot, definire un diametro XY di due micrometri e un diametro Z di 1,5 micrometri, quindi fare clic su Sottrai sfondo per sottrarre lo sfondo.

Per definire la soglia minima, aumentare la soglia minima di rendering 3D su una linea germinale wild-type colorata DAPI fino a quando il primo punto non appare al di fuori della linea germinale e generare un modello 3D per ogni regione. Dopo aver salvato le immagini, fare clic sulla tabella per visualizzare il numero di nuclei, come generato automaticamente dal software, ed esportare le immagini come file TIFF. Per valutare il numero di spermatozoi, selezionare la spermateca come regione di interesse, come dimostrato per le regioni dei nuclei, e utilizzare lo strumento della funzione spot per definire il diametro XY tra 0,75 e un micrometro con un diametro Z indefinito per rilevare ogni spermatozoo.

Selezionare la casella Sottrai sfondo e utilizzare i valori di correzione dello sfondo calcolati dal software per sottrarre lo sfondo. Quindi, regola la soglia di rendering 3D per rilevare tutti gli spermatozoi colorati con DPI nella spermateca. Per il conteggio dei cromosomi negli ovociti, selezionare gli ovociti e definire il diametro XY come inferiore a 0,75 micrometri, e definire la soglia prima di sviluppare i modelli 3D.

Quindi, salva le immagini per l'esportazione come file TIFF. Per la ricostruzione della linea germinale del citoscheletro, identificare la regione mitotica di interesse nella linea germinale e creare una maschera di superficie come precedentemente dimostrato. Fare clic su Maschera canali per mascherare tutti i canali tranne il canale della falloidina e utilizzare lo strumento funzione superficie per definire un dettaglio della superficie di 0,25 micrometri.

Dopo aver sottratto lo sfondo, regolare la soglia di rendering 3D per salvare l'immagine 3D sviluppata per l'esportazione come file TIFF. La distribuzione dei nuclei dipende dallo stadio di differenziazione. Ad esempio, nella regione mitotica, l'actina interna appare come una massa solida su cui sono organizzati i nuclei.

In una linea germinale wild-type, la regione mitotica contiene circa 250 nuclei ed è strettamente impacchettata con nuclei rispetto al resto della linea germinale. Man mano che i nuclei si allontanano dall'estremità distale, tuttavia, appaiono più vicini alla circonferenza della linea germinale, con il cambiamento nella distribuzione che inizia dalla zona di transizione e termina quando i nuclei entrano nel terzo stadio di profase nella meiosi. Nella zona di transizione, l'actina interna germinale assume una struttura più cilindrica, diventando un cilindro cavo quando raggiunge il pachitene.

Il secondo strato di actina ricopre lo strato interno, dando forma alla linea germinale. Questo cilindro all'interno di una struttura cilindrica di actina scompare verso la regione dell'ovocita, a quel punto l'actina appare come fibre spesse che coprono gli ovociti. Nella spermateca, l'actina si forma anche in spessi fasci di fibre, anche se queste fibre sembrano essere più vicine tra loro che nella regione dell'ovocita.

La rappresentazione tridimensionale dell'estremità prossimale della linea germinale, come dimostrato, rivela una media di 151 spermatozoi in ogni spermateca. Una volta padroneggiata, questa analisi può essere completata in 10 minuti per linea germinale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di definire i parametri di analisi in base all'ingrandimento dell'obiettivo utilizzato per visualizzare la linea germinale nell'esperimento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi automatica di una linea germinale e studiare la struttura del citoscheletro e valutare il numero di nuclei all'interno della linea germinale.