Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Questo protocollo dimostra come visualizzare eventi dinamici nei primi embrioni di CL egan con ottica Norky DIC o fluorescenza facendo uso di microscopi ampiamente disponibili e software open source. Il protocollo inizia con la descrizione di come sezionare gli embrioni di CL gans e montarli per l'imaging. Quindi viene rivista la corretta configurazione del DIC né dell'ottica masky per garantire immagini ottimali con il massimo dettaglio.

Viene inoltre esaminata la calibrazione dell'epifluorescenza e dell'illuminazione ad ampio campo per la raccolta di buoni dati di immagini fluorescenti in combinazione con software open source. Una buona microscopia può visualizzare le dinamiche cellulari in un embrione in via di sviluppo. Le illustrazioni visive di questo metodo sono fondamentali in quanto impostare correttamente l'ottica D iic è difficile poiché la terminologia può creare confusione e la tecnica corretta è difficile da descrivere in forma scritta.

Inoltre, i ricercatori dovrebbero fare attenzione a ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante l'esecuzione di immagini fluorescenti. Al fine di limitare la fototossicità e il fotosbiancamento Per preparare gli embrioni per l'imaging, in primo luogo, realizzare due soluzioni di montaggio. Uno è vaselina fusa e l'altro è da due a 3% in tampone.

Si possono ottenere aros più densi se le strutture da fotografare sono molto fragili, facendo attenzione a evitare l'ebollizione. Entrambe le soluzioni madre vengono fuse nel microonde e quindi conservate in aliquote da quattro a cinque millilitri. Il giorno dell'imaging, sciogliere un'aliquota di soluzione di vaselina in un blocco di calore da 65 a 70 gradi Celsius e fondere un'aliquota di soluzione di rose nel microonde.

Ancora una volta, evitando l'ebollizione. Quindi, per mantenere queste soluzioni fuse, conservarle in un blocco termico. Quindi, coprire la parte superiore e inferiore di due vetrini con una striscia di nastro adesivo da laboratorio e posizionare un vetrino pulito tra i due vetrini nastrati.

Ora versa alcune gocce di aros fuso sul vetrino pulito e coprilo con un altro vetrino pulito. L'Aros si diffonde in un sottile cuscinetto quadrato con il tampone di vermi preparato. Utilizzare un cannocchiale da dissezione e un plettro di filo di platino per trasferire due vermi adulti in una goccia di tampone da nove a 12 microlitri su un vetrino coprioggetti da 18 x 18 millimetri.

Quindi tagliare. Apri i vermi con un ago o un bisturi per rilasciare gli embrioni con l'agarro rivolto verso il basso. Posizionare il tampone del verme sul vetrino coprinte da 18 x 18 millimetri e rimuovere con il rasoio l'agar sporgente.

Infine, per sigillare il vetrino coprioggetti, applicare la soluzione di vaselina fusa lungo il suo perimetro con un pennello o uno stuzzicadenti. Le cellule sono ora pronte per l'imaging. Quando si posiziona il vetrino sul microscopio, assicurarsi che i due polarizzatori siano allineati perpendicolarmente l'uno all'altro.

Assicurarsi che sia i muri che i prismi siano fuori dal percorso della luce. Se il campo non è scuro, ruotare il polarizzatore sotto il condensatore fino a quando non è presente. Trova gli embrioni utilizzando l'obiettivo 10 volte.

Cercare vicino ai corpi dei vermi gruppi di giovani embrioni per ottenere più embrioni all'interno del campo di imaging. Evita gli embrioni all'interno del verme per le migliori immagini. Con i migliori embrioni individuati, passa a un obiettivo di potenza più alta.

Ora cambia il cubo del filtro su DIC. Quindi, inserire il prisma di pietra dell'obiettivo superiore nel percorso della luce e ruotare la crostata sul condensatore per selezionare il prisma di pietra inferiore che corrisponde all'obiettivo. Con i prismi in posizione, regola il cursore sotto questa torretta in modo che corrisponda all'apertura numerica dell'obiettivo.

Per ottenere l'illuminazione ottimale di Kohler, focalizzare il condensatore fino a quando il bordo del diaframma del condensatore appare più nitido. Più nitido è quando il confine tra il nero chiaro è più nitido o a fuoco. Per ottenere un contrasto ottimale, regolare la parete della mela e il prisma ruotando la manopola sul cursore.

Ora il microscopio è quasi pronto per l'uso. È il momento di controllare ulteriori parametri di imaging sul computer con micromanager e software open source. Inizia impostando il guadagno della fotocamera su zero.

Quindi passa al salvataggio dei file come tiff a otto bit, non a 16 bit. I file TIFF possono essere successivamente analizzati da software open source come Image J.Successivamente, regola il livello di luce in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto dei livelli di saturazione. Se tutto è stato fatto correttamente, l'immagine apparirà in 3D con la luce che sembra brillare ad angolo.

Ora che l'immagine sembra brillante, seleziona gli embrioni che desideri visualizzare e disegna una regione di interesse. Se il microscopio è dotato di un motore di messa a fuoco, utilizzarlo per raccogliere più piani focali contemporaneamente. Aprire la finestra di acquisizione multidimensionale e impostare il piano superiore e inferiore dello stack Z regolando la manopola di messa a fuoco per trovare il primo e l'ultimo piano focale con alcuni granuli di giogo a fuoco.

Imposta la dimensione del passo. Questo definirà il numero di piani focali raccolti. Ora, imposta un intervallo di tempo sufficientemente lungo da acquisire tutti i piani focali.

I punti di tempo massimi possono essere impostati molto alti in modo che il software scatti le immagini fino a quando non viene arrestato manualmente. Impostare il software in modo che visualizzi solo l'ultima immagine acquisita in modo che il processo possa essere monitorato. Ora dai alle immagini un nome file e inizia ad acquisire le immagini.

L'analisi delle immagini verrà brevemente esaminata alla fine della sezione successiva. Costruire un filmato GFP è molto simile a fare quattro D né Musky DIC, ma viene utilizzato un file di configurazione che include il controllo software dello shatter fluorescente. Invece, con gli embrioni localizzati, assicurati che il prisma superiore del walstone non sia nel percorso della luce e cambia il cubo del filtro su F-I-T-C-G-F-P.

Se questa opzione non è stata impostata automaticamente all'avvio utilizzando il software, assicurarsi che il guadagno della fotocamera sia impostato su 255. Un file immagine è impostato sul formato tiff a 16 bit. Ora spegni la sorgente di luce trasmessa e fai clic su Live Imaging.

Regolare l'intensità della sorgente di luce UV e il tempo di esposizione per ottenere un buon rapporto segnale/rumore per il segnale di fluorescenza, tuttavia, mantenere l'esposizione alla luce al minimo per preservare le celle. Quindi, imposta l'intervallo di tempo. Il numero di punti temporali e il numero di piani focali procedono ora con l'acquisizione dell'immagine come descritto in precedenza.

Per analizzare i filmati, utilizzare un software open source. Image J con il plug-in micromanager installato È possibile importare anche filmati molto grandi in Image J utilizzando il plug-in loci. Questo è un embrione di tipo selvatico catturato con un'ottica DIC non masky.

La parte posteriore è in basso a destra e la ventrale è in basso a sinistra. Il filmato mostra una sequenza di immagini su un singolo piano focale raccolte ogni 15 secondi. La riproduzione è impostata su 14 fotogrammi al secondo.

Questo embrione esprime fluorescenza durante la prima divisione embrionale, qui la parte posteriore è in alto a destra. Questo filmato mostra i cambiamenti in un singolo piano focale ogni 10 secondi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare embrioni vivi utilizzando sia l'ottica DIC Naski che l'epifluorescenza per studiare gli eventi dinamici.

Ci auguriamo che tu abbia una migliore comprensione di come impostare l'ottica DIC Nomar per ottenere immagini ottimali e renderti conto che puoi ottenere dati fluorescenti di alta qualità utilizzando l'illuminazione a epifluorescenza e non sempre dipendi da microscopi più avanzati. Puoi anche applicare queste tecniche di imaging per esaminare embrioni privi di una funzione genica specifica per indagare ulteriormente i requisiti genetici per i tuoi eventi preferiti durante la divisione o lo sviluppo cellulare.