Name: Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara l'imaging di embrioni di C. elegans con microscopia DIC ed epifluorescenza utilizzando software open source. Questo metodo consente di studiare la dinamica cellulare durante lo sviluppo embrionale in vivo.

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Interno fondi istituzionali e le scienze biologiche Programma studiosi della University of Michigan sostenuto questo lavoro.

Worm Preparazione <ol><li> Trasferimento L4 vermi larve di piatti appropriato 18-24 ore prima di imaging 22. Questo vi assicurerà uovo portante adulti per un ampia offerta di embrioni ai primi stadi. </li><li> Preparare i tubi di vaselina e agarosio. Prepariamo vari tubi falcon da 15 ml di fusione vaselina in un bicchiere nel forno a microonde e la distribuzione in aliquote 4-5 ml per provetta. Allo stesso modo si fondono 2-3% (w / v) in soluzione di agarosio (M9 o Egg Buffer) e un'aliquota 4-5 mL in tubi falco. Fare attenzione a non far bollire per eccesso al fine di ridurre al minimo l'evaporazione. Il giorno di imaging, si fondono 1 tubetto di vaselina in A ° 65-70 calore blocco C e sciogliere 1 tubo di agarosio nel forno a microonde, di nuovo fare attenzione a minimizzare bollente. Conservare le provette nel blocco di calore per mantenere la vaselina e la agarosio allo stato fuso. </li><li> Fai Agarose pad. Posizionare una nuova diapositiva microscopia tra 2 scivoli guida, che sono scivoli coperti da un singolo strato di nastro di laboratorio comune aderito alla parte superiore e inferiore di ciascuna unità di guida. Utilizzare una pipetta Pasteur con la fine rotto di mettere 2-3 gocce di fuso agarosio sulla nuova diapositiva. Coprire con un perpendicolare 2 ° diapositiva alla diapositiva originale, in modo da coprire e aiuta a diffondere la agarosio per creare un rilievo sottile quadrato. Il 2 ° scivolo deve poggiare sopra il nastro nelle diapositive guida. La concentrazione di agarosio può essere aumentato al 5% per più spessi cuscinetti. </li><li> Utilizzando un ambito sezionare e un filo di platino "pick", il trasferimento di due vermi adulti a 9-12μL goccia di tampone M9 o uovo su un mm 18 x 18 coprioggetto mm. </li><li> Tagliare worm apre con un ago (usiamo 27G1 / 2 aghi) o bisturi per liberare gli embrioni. Provate a tagliare a metà del worm. </li><li> Inferiore agarosio pad (con il lato agar verso il basso) sul coprioggetto 18x18 millimetri contenente gli embrioni. Agar Trim si estende dal bordo del vetrino con una lametta. </li><li> Coverslip sigillo utilizzando un pennello o sottile bastone di legno per applicare la vaselina fuso per tutti e quattro i bordi del coprioggetto. </li></ol> Alternative ai monti agar sono appesi gocce 23 se gli embrioni sono sensibili alla pressione (cioè se il guscio dell'uovo non si forma correttamente). L'imaging può essere eseguita anche in utero di seguire la fecondazione o eventi precoci come meiosi. Worms dovrebbe essere anestetizzato con Levamisolo 24. Al fine di aumentare il numero di embrioni da un particolare stadio di sviluppo, diversi worm può essere dissezionato in una sola volta e gli embrioni posizionato insieme delicatamente con un raffinato puntale o un pennello ciglia o pipette a bocca. 4D Nomarski DIC (Differential Interference Contrast) Video <ol start="8"><li> Accendere il microscopio Olympus BX61. Perché la fotocamera è sensibile alle onde EM emesse da altri dispositivi è acceso per ultimo, il bulbo di mercurio (se necessario per GFP o fluorescenza) per primo. Avviare Micro-Manager una volta che tutto è in funzione. Scegliere il file di configurazione appropriato per l'imaging DIC o fluorescenti. La differenza principale è che il file DIC non include il controllo di otturatore fluorescenti. Ogni file seleziona anche il cubo appropriato filtro e del guadagno della telecamera. </li><li> Trova embrioni sul microscopio con obiettivo 10x. Guarda nelle vicinanze di corpi senza fine per i gruppi di giovani embrioni al fine di ottenere più embrioni nel campo dell'imaging. Evitare di embrioni all'interno del worm per i migliori immagini. </li><li> Utilizzando l'interruttore software per un ingrandimento superiore (40x a 100x) e risoluzione (NA 0,9-1,4) obiettivo per l'imaging. </li><li> Regolare Nomarski Ottica DIC (I seguenti siti web contengono spiegazione utile di ottica DIC e la terminologia; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Sul nostro Olympus BX61 i componenti importanti sono: <ol><li> Polarizzatore - cursore sotto il condensatore </li><li> Prism condensatore Wollaston - torretta sul condensatore, proprio sotto il palco. </li><li> Obiettivo prisma Wollaston - cursore sotto i cubi filtro </li><li> 2 ° polarizzatore (Analyzer) - cubo filtro nella posizione DIC </li></ol></li><li> Passa Cubo Filtro per DIC per posizionare il Analyzer (2 polarizzatore nd) nel percorso della luce (programma dovrebbe fare questo in fase di start up). </li><li> Assicurarsi che i due polarizzatori sono allineati correttamente (incrociate). Quando entrambi i prismi di Wollaston sono fuori dal percorso della luce del campo di vista dovrebbe essere buio. Se necessario, ruotare il polarizzatore sotto il condensatore fino a quando questo è corretto. </li><li> Inserire il (superiore) Prisma obiettivo Wollaston nel percorso della luce. </li><li> Ruotare la torretta sul condensatore per selezionare il prisma Wollaston che corrisponde l'obiettivo si sta utilizzando. </li><li> Regolare il cursore di sotto di questa torretta per abbinare NA della lente. </li><li> Attenzione che il condensatore sia ottimale illuminazione Koehler. </li><li> Regolare il superiore Wollaston Prism per ottenere un contrasto ottimale ruotando la manopola sul cursore. </li><li> Altre impostazioni di avvio controllato da software includono guadagno della telecamera (impostato a 0) e passare al salvataggio dei file come 8-bit non 16-bit dei file tiff. </li></ol></li><li> Regolare il livello di luce per dare un'immagine piacevole. (Di solito usano 4,7 Volt) (controllato via software). Noi preferiamo per illuminare il campione in modo che i pixel più luminosi sono appena al di sotto dei livelli di saturazione. Buoni risultati DIC ottica in un'immagine con un 3-dimensionale guardare dove i granuli di tuorlo nell'embrione si distinguono chiaramente. In alternativa può essere descritto come se la luce che illumina il campione sembra brillare da un angolo in modo che una parte del campione (o caratteristiche del campione) è acceso vivaci e il lato opposto è in ombra e appare più scura. </li><li> Seleziona regione di interesse (ROI) per includere gli embrioni si vuole l'immagine, fare clic sul pulsante di ROI per ridurre la finestra. </li><li> Aprire il multi-dimensionale finestra di acquisizione. Seleziona Z-stack (fette) e punti di Tempo. </li><li> Usa manopola di focus microscopio per trovare il fondo dell'embrione (ultimo piano focale con alcuni granuli di tuorlo a fuoco). Clicca in basso su Seleziona. Ripetere l'operazione per identificare e impostare la parte superiore dell 'embrione. Noi di solito uso 1 passo micron e finisce con circa 20 piani focali. In genere raccogliere molteplici piani focali ad ogni punto di tempo, perché gli embrioni e le cellule sono relativamente spesso. Inoltre soprattutto quando le cellule cominciano a dividersi in diversi orientamenti che possono spostare le altre cellule nell'embrione intorno movimento dentro o fuori del piano focale originale. Se il microscopio non ha un motore a fuoco è possibile regolare manualmente la messa a fuoco di seguire il cellulare o il processo si è interessati. </li><li> Indicare il numero di punti di tempo e l'intervallo di tempo necessario. Noi di solito utilizzare intervallo di 15 secondi e impostare un max di 500 punti del tempo. Si comincia con gli intervalli di tempo più di quanto abbiamo bisogno e fermare l'acquisizione quando desiderato. Se siete di imaging più piani focali, assicurarsi che ci sia abbastanza tempo per acquisire tutti i piani focali nell'intervallo di tempo tra i punti. </li><li> Selezionare o creare un percorso per salvare i dati. Assicurarsi che il software sia impostato per visualizzare solo l'ultima immagine. Dare un nome al file e fare clic su Acquisisci. Monitorare l'acquisizione automatica delle immagini per i primi punti poco tempo per assicurarsi che funzioni correttamente. </li><li> Clicca fermare quando si desidera interrompere l'acquisizione, passare a obiettivo 10x e preparare diapositiva successiva. </li><li> Una volta fatto l'imaging rimuovere i componenti DIC dal percorso della luce. Olio pulito fuori obiettivo, se necessario. Spegnere tutto a partire con la fotocamera. </li></ol> GFP Film <ol start="20"><li> Avviare microscopio e trovare gli embrioni come sopra. Utilizzare file di configurazione che include software di controllo di otturatore fluorescenti. </li><li> Assicurarsi che il prisma superiore DIC (slider) non si trova nel percorso della luce. </li><li> Passa Cubo filtro per FITC / GFP (impostata automaticamente all'avvio) </li><li> Variazione del guadagno telecamera a 255 e file di immagine TIFF a 16 bit (impostato automaticamente all'avvio con questo file di configurazione). </li><li> Spegnere la luce bianca. </li><li> Fare clic su Live Imaging a immagine di anteprima. Lavorare velocemente per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. In alternativa utilizzare immagini Snap per raccogliere singola immagine. </li><li> La regolazione della potenza della lampadina Mercury / filtri a densità neutra, tempo di esposizione per ottenere una buona immagine. In generale, si consiglia di utilizzare la luce minima di raggiungere il campione di acquisire i dati che si desidera ridurre fotodanneggiamento alla cella e photobleaching dei segnali di fluorescenza. </li><li> Impostare l'intervallo di tempo, il numero di punti di tempo e numero di piani focali. Spesso usiamo gli intervalli di 50-10 secondi e 1-3 piano focale. </li><li> Seleziona il ROI e impostare i parametri per l'acquisizione dell'immagine come descritto in precedenza in Piazza di 13-19. </li></ol> Film analisi <ol start="29"><li> I dati verranno salvati nella cartella con il nome inserito e contengono una serie di file tiff per ogni immagine della pila 4D, un file di testo e un file XML contenente i metadati quali i livelli di esposizione e intervalli di tempo. </li><li> Le immagini TIFF possono essere aperti da ImageJ attraverso due metodi. Il primo (metodo a) è il più semplice e anche leggere i metadati di ogni file. Il secondo (metodo b) è in grado di utilizzare la memoria virtuale per aprire i file che sono più grandi rispetto alla quantità di memoria allocata per ImageJ, ma non include i metadati. <ol class="lalpha"><li> Utilizzando Micro-Plugin Manager <ol><li> Micro-Manager è costruito su e usa ImageJ (si installa una nuova versione di ImageJ, che sarà diverso da qualsiasi altra versione che potrebbe essere installato in precedenza) e include un plugin per aprire i dati. In alternativa è possibile copiare il contenuto della cartella Micro-Manager-1.3/plugins nella cartella plugins di un'altra versione di ImageJ. </li><li> Vai al menu Plugin, selezionare Micro-Manager e quindi Aprire Micro-File Manager. </li><li> Selezionare la cartella contenente i dati che si desidera visualizzare e fare clic su OK. </li><li> Gioca attraverso le dimensioni Z e T. </li></ol></li><li> Utilizzando LOCI plugin per aprire i filmati con Importatore BioFormats. <ol><li> Trasferire i file xml e txt dalla cartella contenente i file tiff e rinominare i due file che corrisponda al nome del set di dati. </li><li> All'interno di ImageJ, andare al Plugin menu a tendina, selezionare LOCI e poi o Browser dati o Bio-Formati Importatore. </li><li> Trovare la cartella con il tuo stack tiff. Fare clic sul primo file tiff, quindi aprire. </li><li> Visualizza stack con HyperStack. Sotto l'organizzazione del set di dati: selezionare i file di gruppo con dimensioni Swap nomi simili, e aperto tutte le serie. Sotto la gestione della memoria: Seleziona: Usa stack virtuale (in particolare per grandi insiemi di dati). Fare clic su OK </li><li> Il plugin determinare le dimensioni del set di dati (numero di punti di tempo e di piani focali) e visualizzare l'intervallo tra una serie di &lt;&gt; parentesi. Fare clic su OK o alterare il numero dei punti di tempo e / o piani focali per aprire. </li><li> Confermare quale dimensione corrisponde a ciascuna serie. </li><li> Gioca attraverso le dimensioni Z e T. </li></ol></li></ol></li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Stills Figura 1. Da un filmato che illustra Nomarski DIC normale eventi cellulari nei primi mesi del C. elegans sviluppo embrionale: la migrazione pronucleo (0-5:45), prima divisione asimmetrica (6:45-14:45) e asincroni seconda divisione (14:45-27:00). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. 20 piani focali ad intervalli di 1 micron, sono stati raccolti ogni 15 secondi con 40 ms di esposizione. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra e ventrale è in basso. Bar scala rappresentano il 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Stills da un film fluorescente che illustra i movimenti dinamici di una GFP-etichettata subunità del complesso passeggeri cromosoma (AIR-2) presenti sui cromosomi di metafase anafase a presto (dalla A alla C) prima di apparire sul midzone mandrino fino in anafase citocinesi completa (C a F). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. Un unico piano focale sono stati raccolti ogni 10 secondi con 50 l'esposizione msec. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra. Bar scala rappresentano il 10 micron. Movie 1 Movie Nomarski di Wild-Type Embryo. Film corrispondente alla figura 1. Posteriore è in fondo a destra e ventrale è in basso a sinistra. Mostra un unico piano focale di dati originale. Immagine è stato raccolto ogni 15 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Clicca qui per vedere video</a> Movie 2 Film fluorescente di Wild-Type embrione che esprimono GFP:: AIR-2. Film corrispondente alla Figura 2. Posteriore è in alto a destra. Film è stato raccolto come un unico piano focale. Immagine è stato raccolto ogni 10 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Clicca qui per vedere video</a>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una considerazione importante per vivere time-lapse imaging è quello di preservare l&#39;integrità e la vitalità della cellula e dell&#39;organismo. Microscopia DIC offre il vantaggio che il campione non è esposta alla luce ultravioletta e il riscaldamento eccessivo dalla fonte di illuminazione. Microscopia DIC ben si adatta a rilevare la migrazione cellulare e cambia la forma delle cellule, come citocinesi e di individuare alcune strutture subcellulari, come il fuso mitotico e la membrana nucleare. Imaging di fluorescenza di proteine ​​giornalista integra microscopia DIC identificando ulteriori compartimenti subcellulari e consentendo la visualizzazione di proteine ​​specifiche. Per mitigare i rischi di fototossicità e danni per l&#39;embrione durante imaging di fluorescenza, di solito aumentare il guadagno digitale della fotocamera per compensare la ridotta intensità della luce UV e la durata di illuminazione. Per i deboli giornalisti transgenici fluorescenti, gli algoritmi di deconvoluzione per riassegnare out-of-focus algoritmi di luce o deblurring per ridurre sfondo può migliorare la qualità delle immagini catturate. Mentre i microscopi avanzate come i sistemi confocale o multiphoton a volte sono necessarie, abbiamo trovato che molti giornalisti fluorescenti possono essere ripreso questa impostazione epifluorescente microscopio, producendo immagini di alta qualità. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), oltre ad essere gratuito, salva i file direttamente in formato tiff invece di formati di file proprietari di molti pacchetti software commerciali. Questo semplifica notevolmente le analisi dei nostri dati, eliminando la fase di conversione file necessario per leggere i file di immagine in ImageJ, Photoshop e altri software di editing delle immagini.

Olympus BX61 microscopio con Hamamatsu Orca-ER fotocamera. Piano di fluorite 10x (NA 0,3) e PlanAchromat 60x (NA 1,35) lenti dell&#39;obiettivo Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Immagine J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarosio - biologia molecolare / elettroforesi su gel di grado Fisher Superfrost / Plus preparati microscopici (Catalogo # 12-550-15) Laboratorio nastro (Fisher Catalogo # 15-901 Series) 18 millimetri x 18 mm # 1.5 Coprivetrini M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mm g NaCl, 19 mM di NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Uovo Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 HEPES mM, pH 7.3) 25. Vaselina Pennello / Stick Lamette da barba Calore blocco Microscopio da dissezione Worm 22 Filo di platino raccogliere 22 27G1 / 2 Precision Glide Ago (Beckton Dickinson) o un bisturi con lama piccola

imaging c. elegans gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e software open source

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Processi cellulari, come il montaggio dei cromosomi, segregazione e citocinesi, sono intrinsecamente dinamica. Time-lapse imaging di cellule viventi, mediante fluorescenza marcata proteine ​​reporter o contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopia, consente per l&#39;esame della progressione temporale di questi eventi dinamici che altrimenti è dedotto da analisi di campioni fisso 1,2. Inoltre, lo studio della normativa di sviluppo di processi cellulari rende necessario condurre esperimenti di time-lapse su un organismo intatto durante lo sviluppo. L&#39;embrione Caenorhabiditis elegans è leggero trasparente ed ha un rapido programma di sviluppo invariante con una cella conosciuto lignaggio 3, fornendo così un modello ideale esperimento per lo studio delle domande di biologia cellulare e dello sviluppo 4,5 6-9. C. elegans è modificabile alla manipolazione genetica in avanti genetica (sulla base di mutagenesi casuale 10,11) e genetica inversa per indirizzare geni specifici (sulla base di RNAi mediato da interferenze e mirati mutagenesi 12-15). Inoltre, gli animali transgenici possono essere facilmente create per esprimere proteine ​​fluorescenti tag o giornalisti 16,17. Queste caratteristiche si combinano per rendere più facile identificare i percorsi genetici che regolano processi cellulari fondamentali e dello sviluppo in vivo 18-21. In questo protocollo presenteremo i metodi per l&#39;imaging dal vivo di C. embrioni elegans utilizzando ottiche DIC o fluorescenza GFP su un microscopio composto epifluorescente. Dimostriamo la facilità con cui microscopi prontamente disponibili, tipicamente utilizzato per l&#39;imaging campione fisso, può essere applicato anche per time-lapse analisi utilizzando software open-source per automatizzare il processo di imaging.

Il<em&gt; C. elegans</emEmbrione&gt; è un potente sistema per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo. Vi presentiamo un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni utilizzando ottiche DIC o fluorescenza con microscopi epifluorescente facilmente disponibili e software open-source.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

I processi cellulari, quali l'assemblaggio dei cromosomi, la segregazione e la citocinesi, sono intrinsecamente dinamici. L'imaging time-lapse di cellule vive, utilizzando...

Questo protocollo illustra come ottenere immagini di eventi dinamici nelle prime fasi di sviluppo degli embrioni di CL egan utilizzando ottiche DIC Norky o la fluorescenza, sfruttando microscopi comunemente disponibili e software open source. Il protocollo inizia descrivendo come dissezionare gli embrioni di CL gans e montarli per l'acquisizione delle immagini. Successivamente, viene illustrata la corretta configurazione delle ottiche DIC con maschera Norky per garantire immagini ottimali con il massimo dettaglio.Viene inoltre esaminata la calibrazione dell'illuminazione epi fluorescente a campo largo e dell'illuminazione per raccogliere buoni dati di immagini fluorescenti, utilizzando software open source. Una buona microscopia permette di visualizzare la dinamica cellulare in un embrione in via di sviluppo. Le illustrazioni visive di questo metodo sono fondamentali, poiché configurare correttamente la D iic Optics è complesso, dato che la terminologia può risultare confusa e la tecnica corretta è difficile da descrivere per iscritto.Inoltre, i ricercatori dovrebbero prestare attenzione a minimizzare l'esposizione alla luce durante l'acquisizione di immagini fluorescenti. Per limitare la fototossicità e il fotobiancamento, per preparare gli embrioni all'acquisizione di immagini, preparare innanzitutto due soluzioni di montaggio: una è vaselina fusa e l'altra è aros al due-tre percento in tampone.È possibile preparare aros più densi se le strutture da osservare sono molto fragili, avendo cura di evitare l'ebollizione. Le due soluzioni stock vengono fuse nel microonde e quindi conservate in aliquote da quattro-cinque millilitri. Nel giorno dell'analisi, sciogliere un'aliquota di soluzione di Vaseline in un blocco termico a 65-70 gradi Celsius e sciogliere un' altra aliquota di soluzione di arose nel microonde.Di nuovo, evitando il bollore. Successivamente, per mantenere queste soluzioni fuse, conservarle in un blocco riscaldante. Poi, coprire la parte superiore e inferiore di due vetrini con una striscia di nastro da laboratorio e posizionare un vetrino pulito tra i due vetrini nastroati.Ora applicate alcune gocce dell'aros fuso su un vetrino pulito e coprite con un altro vetrino pulito. L'Aros si espande formando una matrice quadrata sottile insieme alla matrice per i vermi preparata. Utilizzate un microscopio stereoscopico e un bastoncino di platino per trasferire due vermi adulti in una goccia di tampone di nove-dodici microlitri su un coprioggetto di 18 per 18 millimetri.Quindi tagliare. Aprire i vermi con un ago o un bisturi per liberare gli embrioni con il lato in agarro rivolto verso il basso. Posizionare la guarnizione per vermi sul coprioggetto di 18 per 18 millimetri e rimuovere con un rasoio qualsiasi agarro in eccesso.Infine, per sigillare il vetrino, applicare la soluzione fusa di vaselina lungo il suo perimetro con un pennello o uno stuzzicadenti. Le cellule sono ora pronte per l'acquisizione delle immagini. Quando si posiziona il vetrino sul microscopio, assicurarsi che i due polarizzatori siano allineati perpendicolarmente l'uno rispetto all'altro.Assicurarsi che sia i diaframmi sia i prismi siano fuori dal percorso del raggio luminoso. Se il campo non è scuro, ruotare il polarizzatore al di sotto del condensatore finché non lo diventa. Individuare gli embrioni utilizzando l'obiettivo 10 volte.Cercare vicino ai corpi del verme gruppi di embrioni giovani per ottenere più embrioni all'interno del campo di imaging. Evitare gli embrioni all'interno del verme per ottenere le migliori immagini. Una volta individuati i migliori embrioni, passare a un obiettivo con ingrandimento maggiore.Ora passare al cubo filtro DIC. Successivamente, inserire il prisma walstone superiore dell'obiettivo nel percorso della luce e ruotare la ghiera sul condensatore per selezionare il prisma walstone inferiore corrispondente all'obiettivo. Con i prismi posizionati, regolare lo scorrimento sotto questa torretta in modo da abbinare l'apertura numerica della lente.Per ottenere un'illuminazione Köhler ottimale, mettere a fuoco il condensatore finché il bordo del diaframma del condensatore non appare più nitido. Il massimo della nitidezza corrisponde al momento in cui il confine tra la luce e il nero è più definito o a fuoco. Per ottenere un contrasto ottimale, regolare l'apparecchio a muro e il prisma ruotando la manopola sul cursore.Ora il microscopio è quasi pronto per l'uso. È il momento di regolare ulteriori parametri di acquisizione immagini sul computer mediante il software open source Micro-Manager. Iniziare impostando il guadagno della fotocamera a zero.Quindi passare al salvataggio dei file come tiff a otto bit, invece che a 16 bit. I file TIFF possono successivamente essere analizzati mediante software open source come Image J. Successivamente, regolare il livello di luce in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto dei livelli di saturazione. Se tutto è stato eseguito correttamente, l'immagine avrà un aspetto tridimensionale, con la luce che sembra provenire da un angolo.Ora che l'immagine appare eccellente, selezionare gli embrioni da acquisire e disegnare una regione di interesse. Se il microscopio è dotato di motore di messa a fuoco, utilizzarlo per acquisire più piani focali a ogni tempo. Aprire la finestra di acquisizione multidimensionale e impostare i piani superiore e inferiore dello stack Z regolando la manopola di messa a fuoco per individuare il primo e l'ultimo piano focale in cui si vedono granuli di tuorlo ben messi a fuoco.Impostare l'incremento. Questo definirà il numero di piani focali acquisiti. Ora, impostare un intervallo di tempo sufficientemente lungo da permettere l'acquisizione di tutti i piani focali.È possibile impostare i punti temporali massimi molto elevati, in modo che il software acquisisca immagini fino a quando non viene arrestato manualmente. Impostare il software in modo che visualizzi solo l'ultima immagine acquisita, in modo da poter monitorare il processo. Assegnare ora un nome file alle immagini e iniziare l'acquisizione.L'analisi delle immagini verrà brevemente rivista alla fine della prossima sezione. La costruzione di un filmato GFP è molto simile alla realizzazione di quattro D nor Musky DIC, ma si utilizza un file di configurazione che include il controllo software dello shatter fluorescente. Una volta localizzati gli embrioni, assicurarsi che il prisma walstone superiore non sia nel percorso della luce e commutare il cubo filtro su F-I-T-C-G-F-P.Se questa impostazione non è stata attivata automaticamente all'avvio tramite il software, assicurarsi che il guadagno della telecamera sia impostato a 255. Il file immagine deve essere in formato tiff a 16 bit. Ora spegnere la sorgente di luce trasmessa e fare clic su acquisizione in tempo reale.Regolare l'intensità della sorgente di luce UV e il tempo di esposizione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore per il segnale di fluorescenza; tuttavia, mantenere l'esposizione alla luce al minimo per preservare le cellule. Successivamente, impostare l'intervallo temporale. Il numero di punti temporali e il numero di piani focali procedono quindi con l'acquisizione delle immagini come descritto in precedenza.Per analizzare i filmati, utilizzare un software open source. ImageJ con il plugin micromanager installato. I filmati molto grandi possono essere importati anche in ImageJ utilizzando il plugin loci. Questo è un embrione di tipo selvatico acquisito con ottica DIC senza maschera.La parte posteriore è in basso a destra e quella ventrale è in basso a sinistra. Il filmato mostra una sequenza di immagini a singolo piano focale acquisite ogni 15 secondi. La riproduzione è impostata a 14 fotogrammi al secondo.Questo embrione esprime fluorescenza durante la prima divisione embrionale; qui, la parte posteriore si trova in alto a destra. Questo filmato mostra i cambiamenti in un singolo piano focale ogni 10 secondi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare l'immagine di embrioni vivi utilizzando sia l'ottica DIC Naski sia la fluorescenza in epifluorescenza per studiare eventi dinamici.Speriamo che ora abbiate una comprensione migliore di come configurare l'ottica DIC Nomar per ottenere immagini ottimali e che siate consapevoli di poter acquisire dati fluorescenti di alta qualità utilizzando l'illuminazione in fluorescenza in epifluorescenza, senza dover dipendere sempre da microscopi più avanzati. Potete inoltre applicare queste tecniche di imaging per esaminare embrioni privi della funzione di geni specifici, al fine di approfondire i requisiti genetici degli eventi di vostro interesse durante la divisione cellulare o lo sviluppo.

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