Name: Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in C. elegans Utilizzo strumenti open-source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri metodi per monitorare e quantificare processi di sviluppo in C. elegans utilizzando strumenti open-source. Questa tecnica consente la ricostruzione di modelli 3D e l'analisi quantitativa della morfogenesi.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. Preparazione di C. elegans embrioni per time-lapse Microscopia utilizzando microsfere <ol><li> Trasferire vermi adulti gravide utilizzando un pick verme (filo di platino) in una goccia di tampone M9 e pulire i batteri prima vigorosamente agitando e poi trasferire ogni verme a un calo adiacente di M9 utilizzando una sferza occhio montato su un dente di prelievo / puntale o utilizzare un capillare di vetro appuntito. </li><li> Diluire la dispersione contenente 20 micron perline diametro polistirene 10 volte in tampone M9 (1 tampone L M9 contiene 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g di NaCl, e, dopo autoclavaggio (20 min, 120 ° C), aggiungere un ulteriore 1 ml di una soluzione di 4 1 M MgSO). </li><li> Effettuare una pipetta a bocca da qualsiasi tipo di sottile capillare di vetro (ad esempio, la fusione capillari puntiformi o capillari utilizzati per tirare aghi per iniezione), a circa 0,5 m di lunghezza pezzo di gomma, silicone o materiale simile tubo (meglio se trasparente), a 200 microlitripuntale, il coperchio di un tubo 200 microlitri PCR, un filtro idrofobico per piccole siringhe (ad es., un 0,2-0,45 micron dimensione dei pori e 15-50 mm di diametro nylon, PTFE o materiale simile filtro) punta, e una pipetta 1.000 ml . Questo tipo di bocca pipetta assicura che nessun materiale biologico può entrare in contatto con lo sperimentatore. </li><li> Assemblare la pipetta inserendo la punta della pipetta 200 microlitri con la punta prima nel tubo e collegarlo con il coperchio di un tubo di PCR che ha una foratura centrale che corrisponde al diametro del capillare utilizzato. Un ago punteruolo o preparazione molto rilevato può essere utilizzato per generare la perforazione. </li><li> Disegnare una capillare sottile e inserirla nella perforazione. Inserire il filtro nell&#39;altra estremità del tubo e inserire 1000 microlitri pipetta punta come boccaglio (Figura 1). </li><li> Sezionare adulti gravido tagliando vermi trasversalmente alla vulva con una lama di rasoio pulita o bisturi. NOTA: In genere, molti embrioni saranno postaxpulsed dopo il taglio. Tuttavia, se sono necessarie primi embrioni, a volte devono essere rilasciate dalla carcassa con un occhio sferza o un ago appuntito. </li><li> Pipettare una goccia della dispersione diluita in polistirolo (~ 4 microlitri) su un vetro di copertura 24x60 mm e di trasferimento embrioni in questo calo usando la pipetta bocca. </li><li> Posizionare con cura un piccolo (ad esempio, 18x18 o 20x20 mm) copertura di vetro sulla parte superiore della goccia e assicurarsi che il calo si è completamente estesa. NOTA: Il calo dovrebbe essere abbastanza piccolo da non toccare i bordi del piccolo vetro di copertura. </li><li> Sigillare il monte con vaselina liquefatto. Aggiungere una goccia di olio di immersione in copertina mm 24x60 lato antiscivolo e passare alla sezione &#39;Time-lapse Microscopia&#39;. </li></ol> 2. Preparazione di adulti C. elegans animali per time-lapse Microscopia utilizzando Nanobeads NOTA: In generale, il protocollo per il montaggio animali adulti è un adattamento del protocollo da rif. 18.Con questo protocollo, è possibile effettuare lungo termine microscopia time-lapse confocale di animali adulti. <ol><li> Preparare un 1,5% (w / v) di agarosio in tampone M9, bollire (1 min, 100 ° C a bagnomaria o microonde). L&#39;uso di elevate concentrazioni di agarosio non è raccomandato poiché questo può portare a estrusione del intestino e / o parti di gonade. </li><li> Stick giù 2-3 strati di nastro su due vetrini da microscopio ciascuno. Posizionare un vetrino senza nastro tra le due diapositive con nastro adesivo. </li><li> Utilizzare un puntale e mettere una goccia della soluzione di agarosio caldo al centro della slitta centrale. Introdurre rapidamente un&#39;altra vetrino sul goccia così che sia supportato dagli strati di nastro su ogni lato. Questo creerà un giro e pad agar piatta di circa 10 mm di diametro. </li><li> Mettere una goccia di soluzione di 100 nm tallone (non diluito, che è 2,6% (w / v)) sul pad. Trasferimento 1-10 vermi adulti puliti nel menu a tendina con un pick verme. Sigillare con 18x18 millimetri di vetro di copertura e di vaselina come spiegato in ProtOcol 1. </li></ol> 3. microscopia time-lapse <ol><li> Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino da microscopio o il panino vetro di copertura. Utilizzare campo chiaro a basso ingrandimento (5x o 10x lenti) per individuare il campione. NOTA: limitare l&#39;esposizione alla luce blu il più possibile (in particolare per C. elegans embrioni), ad esempio, non utilizzare la microscopia fluorescenza per trovare / focalizzare il provino ma utilizzare campo chiaro invece. </li><li> Passare alla maggiore ingrandimento (40x o 60x obiettivi), portare il campione a fuoco (o piano centrale o superiore / inferiore piani del campione, a seconda del software di acquisizione). </li><li> Impostare gli intervalli di campionamento a 30 aerei a 1 micron spaziatura registrato ogni 1min. Nel caso in cui un xy o xyz stadi automatica è disponibile, più punti possono essere registrati in un&#39;unica sessione. Passare a imaging di fluorescenza e controllare di nuovo la messa a fuoco. NOTA: cercare di evitare l&#39;uso di poteri alta del laser, piuttosto utilizzare tempi di esposizione leggermente più lungoa bassissime intensità. Misura immagini acquisite subito, sia nel programma di acquisizione immagini o in ImageJ per evitare la saturazione, che colture variano le dinamiche e significa anche un&#39;eccessiva esposizione alle radiazioni. </li><li> Avviare la registrazione della serie time-lapse. NOTA: Per escludere l&#39;analisi artefatti, iniziare con lunghi intervalli (3-10 min) tempo tra la scansione del campione e aumentare gradualmente campionamento temporale agli intervalli desiderati. Tempi di sviluppo così come i punti finali in entrambi i casi dovrebbero essere simili quando si effettua una analisi statistica. Inoltre, è spesso necessario valutare i tassi di sopravvivenza e fototossicità. Pertanto, recuperare campione dal monte dopo-lungo termine microscopia time-lapse e controllare se continuano a sviluppare / live. </li></ol> 4. Ricostruire un modello delle cellule di figura 3D con IMOD NOTA: Il software IMOD è disponibile dalla pagina web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L&#39;installazione del software è descrittod lì. Quando si utilizza il sistema operativo Windows, un toolkit Unix deve essere installata, che può anche essere trovato come un pacchetto sul sito IMOD. Inoltre, vi è un&#39;introduzione 3dmod ottimamente compilato disponibili sulla pagina web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Aprire la shell Unix e digitare &quot;imod&quot;. La finestra MDI si aprirà. Selezionare il file con i dati grezzi (idealmente un tif impilati o simili) da cui generare un modello 3D. </li><li> Individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap utilizzando la finestra delle informazioni (su e giù strumento scorrimento). </li><li> Avviare l&#39;analisi i contorni delle cellule. È importante sottolineare che, in modo che ogni cella è un oggetto. Inizia con il piano superiore di ogni cella e creare il primo contorno si utilizza la finestra delle informazioni. Scorrere verso il basso in z e creare un nuovo profilo per ogni piano z. </li><li> Fare lo stesso per tutte le celle come necessario per modellare in 3D. Non dimenticare di creare un nuovo oggetto quando si inizia con una nuova cellula. NOTA: Ci sono molti modi diversi per contorno tracciamento e diversi plugin utile. Si prega di visitare la pagina web IMOD e tutorial online per i dettagli. Nel caso qui illustrato, è stata usata l&#39;impostazione predefinita. </li><li> Aprire la finestra &quot;Modello View&quot; per ispezionare gli oggetti e le loro contorni. </li><li> Nella barra degli strumenti &quot;Model View&quot; scegliere &quot;Modifica&quot; - &quot;Oggetti&quot;. La rispettiva finestra di modifica si aprirà. </li><li> Per modellare cellule come oggetti pieni e chiusi, scegliere &quot;Mesh&quot; come &quot;Draw tipo di dati&quot; e &quot;Fill&quot; come &quot;stile di disegno&quot;. Clicca su &quot;mesh&quot; nella selezione scorrimento in basso a sinistra della finestra. Controllare l&#39;opzione &quot;Cap&quot; nella selezione in basso a destra. Controllare il numero di oggetti come necessario e fare clic su &quot;Mesh All&quot;. Il programma genererà oggetti solidi dalle pile di contorni. Il fattore-z campionamento può essere regolata cambiando &quot;Z-scale&quot; nella finestra &quot;View&quot;. </li><li> Sposta / ruotare l&#39;obiet 3Dt (&quot;Edit&quot; - &quot;Vista&quot;) e salvare le istantanee o filmati (&quot;File&quot; - &quot;Snap Tiff con nome ...&quot; o &quot;Movie / Montaggio&quot;). </li></ol> 5. Monitoraggio fluorescente Strutture etichettati con Endrov NOTA: Al fine di tenere traccia di resti divisione cellulare, utilizzare un ceppo con un pennarello membrana nucleare o al plasma per l&#39;identificazione delle cellule (ad esempio, H2B, PH-PLC-d1) e una divisione cellulare marcatore residuo (ad esempio, NMY-2, ZEN-4 ). Il marcatore membrana nucleare o del plasma è importante per determinare quale cella eredita il rimanente divisione cellulare. <ol><li> Per caricamento veloce e facilità d&#39;uso, i dati grezzi deve essere convertito in un file TIFF (ad esempio, in ImageJ). Avanti, aperto Endrov e caricare il file da analizzare, scegliendo l&#39;opzione &quot;Carica file&quot; dal menu file. Fare clic sull&#39;icona &quot;Visualizzatore 2D&quot; nella barra degli strumenti. </li><li> Regolare l&#39;istogramma facendo clic sull&#39;icona &quot;gamma Fit&quot; (l&#39;icona blu nell&#39;angolo in basso a destradello schermo Endrov). Impostare la XYZ risoluzione andando su &quot;dati&quot; - &quot;nomefile&quot; - &quot;ImageSet&quot; - &quot;Canale&quot; - &quot;Set XYZ-risoluzione&quot;. Digitare valori X, Y, e Z, per esempio, 5, 5, 1 se la risoluzione X e Y è di 0.2 micron e campionare ogni 1 micron di Z. </li><li> Per annotare i nuclei, passare al piano di interesse e cliccare su &quot;visore 2D&quot;. Selezionare &quot;Lineage&quot; dal menu a discesa e scegliere &quot;Nuovo stirpe&quot;. </li><li> Cliccando e trascinando sul nucleo, può essere marcato. Per assegnare un nome al nucleo, fare clic destro e scegliere &quot;Rinomina particella&quot; dal menu a discesa. Per aumentare o diminuire il diametro del cerchio, trascinare la freccia che appare sulla sinistra del cerchio marcato. Per celebrare il piano centrale del nucleo, fare clic sull&#39;icona a destra. Quando si utilizza un marcatore membrana plasmatica, una grande sfera può trarre che coprirà la maggior parte della cellula. </li><li> Per continuare nel tempo e piano, scegliere il &quot;Frame&quot; e &quot;Z&quot;i pasti presso la barra degli strumenti in basso. Dopo essere andato al successivo punto di tempo, regolare la posizione o la dimensione del cerchio che segna il nucleo di conseguenza. Ripetere questa operazione fino a quando la cellula si divide cingolati. </li><li> Quando c&#39;è una divisione cellulare, segnare i nuclei figli e passare a &quot;spettatore Lineage&quot;. Questo può essere selezionata facendo clic sull&#39;icona &quot;Windows&quot; sulla barra degli strumenti superiore. Segna tutti e tre i nuclei contemporaneamente, passare all&#39;opzione &quot;Lineage&quot; nella barra degli strumenti in alto e selezionare &quot;genitore Associate&quot;. </li><li> Quando il monitoraggio delle cellule è terminata, passare alla marcatura il resto della divisione cellulare per il monitoraggio dei canali. Per cambiare canale, fare clic sul nome del file nell&#39;angolo in basso a sinistra della barra degli strumenti. Il residuo divisione cellulare (o qualsiasi altra struttura) possono essere monitorati come descritto sopra per il nucleo. </li><li> Quando si ritorna al software dopo la chiusura, è necessario andare a &quot;2D Viewer&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Modifica&quot; e cliccare sul numero di stirpe che verrà modificato. </li&gt; </ol> 6. Analizzando corticale actomiosina flusso con PIVlab NOTA: PIVlab è un software disponibile gratuitamente da: http://pivlab.blogspot.de/; esso può essere richiamato all&#39;interno dell&#39;ambiente riga di comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Quando si lavora con PIVlab, si raccomanda di salvare la serie di immagini in una cartella separata. <ol><li> Avviare una nuova sessione dal menu &quot;File&quot;. Caricare i file di immagine, fare clic sul pulsante &quot;Carica immagini&quot;. </li><li> Selezionare lo stile sequenza 1-2, 2-3, ... e passare alla directory che contiene la sequenza delle immagini desiderate. Selezionare le immagini e fare clic sul pulsante &quot;Aggiungi&quot; e di importazione. </li><li> Vai su &quot;Impostazioni&quot; Analisi e selezionare &quot;Esclusioni (ROI, Maschera)&quot;. In alternativa, premere il tasto &quot;Ctrl + E&quot;. Utilizzare il pulsante &quot;Disegna maschera (s) per fotogramma corrente&quot; per disattivare la parte indesiderata delle immagini / s (cioè, al di fuori dell&#39;area embrione). </li><li> Selezionare &quot;Impostazioni PIV&quot; from il menu &quot;Impostazioni Analisi&quot;. In alternativa, premere il tasto &quot;Ctrl + S&quot;. Scegliere &quot;finestra deformazione FFT&quot;, come l&#39;algoritmo di PIV desiderato. NOTA: trasformazione rapida di Fourier (FFT) riduce il costo computazionale ma è consigliata solo il segnale è ben al di sopra del rumore e se lo spostamento delle particelle studiati non supera la metà della superficie passaggio analizzato (vedi 6.5). </li><li> Inserire i seguenti valori per le tre passaggi, che sono la zona di interrogazione per incrociata intensità correlazione tra immagini successive: Passo 1: interrogazione un&#39;area di 64 pixel con un passo di 32. Passo 2: interrogazione superficie di 32 pixel con un passo di 16 . Selezionare &quot;lineare&quot; dalla deformazione finestra menu a discesa. Scegli il metodo 2 * 3 punti di Gauss per lo spostamento stima sub-pixel. </li><li> Selezionare &quot;Analyze!&quot; dal menu Analysis e utilizzare il pulsante &quot;Analizza tutti i frame&quot; per iniziare un&#39;analisi. </li><li> Per la post-elaborazione selezionare &quot;convalida Vector&quot; da &quot;; Menù post trattamento &quot;e impostare la deviazione standard (Stdev) Soglia di filtro a 7 e si applicano a tutti i fotogrammi. </li><li> Scegliere &quot;Derivare parametri / modificare i dati&quot; dal menu &quot;Plot&quot;. Selezionare &quot;vettori [px / telaio]&quot; dal menu a discesa. Regolare la scorrevolezza dei vettori e filtro passa alto e si applicano a tutti i fotogrammi. </li><li> Per calcolare i vettori medi di tutti i fotogrammi, impostare i &quot;fotogrammi usati&quot; a 1: fine e fare clic sul pulsante &quot;Calcola i vettori medi&quot;. </li></ol>

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<li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li>
<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

La ricerca nel laboratorio di CP è finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) e il cluster di ricerca LOEWE Ubiquitin Networks. CP è inoltre supportato dal Programma Quadro 7 dell'Unione Europea (Progetto Azioni Marie Curie 326632).

Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi 1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo 10. Per molti mutanti, tuttavia, l&#39;esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui descr...

Con i miglioramenti costanti di proteine ​​fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all&#39;hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche. Tracking cellule e strutture subcellulari ha permesso di ricavare modelli quantitativi dello sviluppo embrionale, l&#39;attività del sistema nervoso, o divisione cellulare 1-12. Tracciando resti divisione cellulare durante lo sviluppo iniziale del C. elegans embrione, potremmo recentemente rivelare che seguono un impianto stereodigitato il percorso e costituiscono importanti fattori di polarizzazione 13,14. Qui, i protocolli vengono presentate che rendono la biologia dello sviluppo quantitativo approcci accessibili per i non esperti. L&#39;attenzione si concentra su tre straight-forward, strumenti liberamente disponibili che sono implementabili in qualsiasi laboratorio che ha accesso a microscopia confocale standard ed i computer. Tra questi, un protocollo per generare forme di cellule 3D, un protocollo per monitorare resti divisione cellulare, e un protocollo per descrivere quantitativamente le dinamiche actomyosin corticali. Il nematode C. elegans è usato come un caso esemplare, tuttavia, i metodi e gli strumenti qui descritti adatti per una serie di domande in altri modelli biologici, per esempio, cellule coltivate, espianti di tessuto, organoidi o sferoidi, altri embrioni, etc. In generale, alcune delle analisi indicati qui possono essere eseguite anche con il popolare strumento di ImageJ open source (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, le &quot;batterie incluse &#39;versione di ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) per i quali sono disponibili molti plugin per diversi analisi quantitative. Tuttavia, i programmi qui discussi sono progettati per affrontare i problemi specifici. In primo luogo, MDI, l&#39;elaborazione delle immagini, la modellazione e le suite display può essere utilizzato per le ricostruzioni 3D di sezioni seriali di elettrone o microscopia ottica 15. IMOD contiene anche strumenti per la visualizzazione dei dati 3D da qualsiasi orientamento. In secondo luogo, Endrov, un programma Java progettato per eseguire l&#39;analisi delle immagini, l&#39;elaborazione dei dati, e l&#39;annotazione di reti o brani (tra gli altri), sulla base di una architettura a plugin esteso, con ImageJ compatibilità plug-16. Esso contiene più di 140 operazioni di elaborazione delle immagini e un&#39;interfaccia utente estendibile, in cui il modello ei dati grezzi vengono visualizzati separatamente. Il suo codice sorgente può essere trovato alla https://github.com/mahogny/Endrov. In terzo luogo, PIVlab, un MStrumento Atlab per particella digitale immagine velocimetria, che permette all&#39;utente di analizzare quantitativamente e qualitativamente i campi di flusso di particelle 17. L&#39;utilizzo di questo programma richiede una licenza MATLAB che include l&#39;Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab è un programma progettato per descrivere quantitativamente il flusso. Calcola la distribuzione di velocità, ampiezza, vorticità, divergenza, o tranciare in coppie di immagini o serie. Per questo, cross-correla piccole aree di immagini (chiamati &#39;pass&#39; nella sezione protocollo) di una coppia di immagini per ricavare lo spostamento delle particelle più probabile. Questa correlazione incrociata produce una matrice di correlazione che può essere analizzato nel dominio spaziale o la frequenza utilizzando cross-correlazione diretta o una trasformazione rapida di Fourier (FFT), rispettivamente. L&#39;apparecchiatura utilizzata è un microscopio rovesciato dotato di Nipkow (&#39;spinning&#39;) del disco, un EMCCD, 488 e 561 nm solido-serielaser a stato, e 20x o 40x o aria 60x piano / apochromat obiettivi di petrolio o di acqua-immersion. Tuttavia, è anche possibile effettuare l&#39;imaging time-lapse con altre modalità di imaging, ad esempio, point, LINE o laser-based microscopia foglio di scansione, microscopia multi-fotoni, così come la microscopia fluorescenza combinata con deconvoluzione o strutturato illuminazione. Il vantaggio di utilizzare un sistema a disco Nipkow è l&#39;acquisizione immagine estremamente veloce, specialmente se una modalità di streaming (movimento continuo e scansione dell&#39;oggetto nella dimensione z) è disponibile. Inoltre, per migliorare la risoluzione, un ingrandimento di 1,5 volte extender davanti alla EMCCD può essere utilizzato.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Stereomicroscopio per la dissezione e il montaggio</td></tr><tr><td>di microsfere di polistirene Polybeads,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Montaggio embrionale</td></tr><tr><td>20 &; micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsfere di polistirene Polybead,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Montaggio animale adulto</td></tr><tr><td>0.1 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Montaggio su animale adulto</td></tr><tr><td>Vetro di copertura 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Montaggio su embrione/adulto</td></tr><tr><td>Vetro di copertura 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Montaggio su embrione</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Dissezione di embrioni</td></tr><tr><td>Tubo in silicone</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Tubo per pipetta orale</td></tr><tr><td>Filtro a membrana in PTFE da 30 mm</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filtro per pipetta orale</td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Puntale per pipetta orale</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Montaggio embrione/adulto</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Montaggio animale adulto</td></tr><tr><td>Potassio-di-idrogenofosfato</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>Tampone M9</td></tr><tr><td>Di-sodio-idrogenofosfato</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>Tampone M9</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>M9 VisiScope Disco rotante Sistema confocale</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Microscopia confocale</td></tr></tbody></table>

monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; c. elegans</em&gt; utilizzo strumenti open-source

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un&#39;analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.

Utilizzando i protocolli 2, 3, e 4, time-lapse di imaging di gonadi a selvaggio tipo C. elegans adulti viene eseguita (ceppo OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), che esprime un marcatore di membrana da un promotore della linea germinale ). Concentrandosi sulla volta della gonade, un modello 3D delle cellule germinali è generato dai dati microscopia (Figura 2). Questo modello permette di analizzare variazioni di dimensione della cella, mentre il...

Qui viene mostrato come tracciare e quantificare i processi di sviluppo in C. elegans. I metodi presentati si basano su strumenti open source che possono essere facilmente implementati. Viene dimostrato come ricostruire modelli 3D di forma cellulare, come tracciare manualmente le strutture subcellulari e come analizzare il flusso contrattile corticale.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

L'obiettivo generale dell'uso del software di analisi delle immagini e della biologia dello sviluppo è ottenere dati quantitativi per modelli meccanicistici dei processi biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come analizzare quantitativamente i fenotipi di mutante? Il principale vantaggio di questa metodologia è che fornisce ai ricercatori la capacità di identificare alterazioni nei processi biologici e nei fenomeni dello sviluppo in modo imparziale.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla morfogenesi di sea elegance, può anche essere applicato ad altri organismi modello come josepha. La ricostruzione della forma cellulare con IOD sarà dimostrata da CINA Leman, una studentessa di dottorato nel mio laboratorio. Dopo aver installato il programma IM MOD, aprire la shell eunuch e digitare Im mod nella finestra IM mod. Selezionare il file con i dati grezzi appropriati da cui generare un modello 3D e utilizzare la finestra delle informazioni per individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap.Nella finestra delle informazioni,

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Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Abbiamo sviluppato un sistema di tassi di video-microscopio di monitoraggio in grado di registrare e...

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

Questo video descrive l'uso di video e software di tracciamento per registrare il movimento dei vermi in un'arena. Il protocollo di esempio misura l'effetto dell'esposizione all'etanolo sulla locomozione dei vermi.

C. elegans Tracciamento del movimento: un metodo per valutare la locomozione nei vermi

Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione...

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

La propagazione di aggregati proteici simile ai prioni è recentemente emersa come implicata in molte malattie neurodegenerative. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare il nematode C. elegans come sistema modello per monitorare la diffusione delle proteine e per studiare fenomeni simili ai prioni.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Una metodologia efficace e semplice per l'analisi computer basato su un comportamento nuoto nematode in un liquido è descritto. Il metodo richiede poco o nessun investimento per C. elegans laboratori. L'hardware utilizzato è standard, e il software per l'analisi comportamentale (Celest) è un open source uno.

Analisi automatizzata di<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Utilizzando Celest Software

Qui, presentiamo un quadro per correlare la restrizione dietetica di ampio spettro di espressione genica e la durata della vita. Descriviamo i protocolli per la restrizione dietetica di ampio spettro e imaging quantitativo di espressione genica in questo paradigma. Abbiamo ulteriormente delineare analisi computazionali per rivelare alla base di funzionalità di elaborazione di informazioni dei circuiti genetici coinvolti nel rilevamento di cibo.

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Descriviamo i protocolli per l'utilizzo della piattaforma di tracking del nematode ampio campo di vista (WF-NTP), che consente velocità effettiva elevata caratterizzazione fenotipica di grandi popolazioni di Caenorhabditis elegans. Questi protocolli possono essere utilizzati per caratterizzare i sottili cambiamenti comportamentali in ceppi mutanti o in risposta al trattamento farmacologico in modo altamente scalabile.

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell'attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Scopri metodi per monitorare e quantificare processi di sviluppo in C. elegans utilizzando strumenti open-source. Questa tecnica consente la ricostruzione di modelli 3D e l'analisi quantitativa della morfogenesi.

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