Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in

L'obiettivo generale dell'uso del software di analisi delle immagini e della biologia dello sviluppo è ottenere dati quantitativi per modelli meccanicistici dei processi biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come analizzare quantitativamente i fenotipi di mutante? Il principale vantaggio di questa metodologia è che fornisce ai ricercatori la capacità di identificare alterazioni nei processi biologici e nei fenomeni dello sviluppo in modo imparziale.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla morfogenesi di sea elegance, può anche essere applicato ad altri organismi modello come josepha. La ricostruzione della forma cellulare con IOD sarà dimostrata da CINA Leman, una studentessa di dottorato nel mio laboratorio. Dopo aver installato il programma IM MOD, aprire la shell eunuch e digitare Im mod nella finestra IM mod. Selezionare il file con i dati grezzi appropriati da cui generare un modello 3D e utilizzare la finestra delle informazioni per individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap.

Nella finestra delle informazioni, tracciare nuovamente i contorni delle cellule creando il primo contorno nel piano superiore di ogni cellula, avendo cura di creare un nuovo oggetto per ciascuna cellula. Successivamente, scorrere verso il basso lungo l'asse Z e creare un nuovo contorno per ogni piano Z, generando poi un nuovo oggetto per ogni cellula. Dopo aver delineato un numero adeguato di cellule per il modello, aprire la finestra di visualizzazione del modello per ispezionare gli oggetti e i loro contorni.

Quindi nella barra degli strumenti della vista del modello, selezionare modifica e oggetti. Si aprirà la rispettiva finestra di modifica per modellare tutte le cellule come oggetti chiusi e riempiti. Scegliere mesh come tipo di dati da disegnare e riempimento come stile di disegno.

Fare clic su meshing e selezionare l'opzione cap. Quindi selezionare quanti oggetti necessari e fare clic su mesh. Il programma genererà oggetti solidi a partire dagli stack di contorni.

Modificare la scala Z nella finestra di visualizzazione per regolare il fattore di campionamento Z secondo necessità. Quindi, nel menu modifica, selezionare la visualizzazione per ruotare gli oggetti tridimensionali, salvando istantanee o filmati delle cellule in modo appropriato per tracciare gli oggetti provenienti da registrazioni fluorescenti a intervalli di tempo. Utilizzando prima NDR, convertire i dati grezzi in un file TIFF.

Quindi aprire il file. Nella fine della goccia, selezionare l'icona della vista 2D e fare clic sull'icona dell'intervallo adatto per regolare l'istogramma nel menu dei dati.

Selezionare il file, il nome, l'immagine, il set, il canale e impostare la risoluzione X, Y, Z, quindi inserire i valori di X, Y e Z. Per annotare i nuclei, passare al piano di interesse e selezionare nuovamente il visualizzatore 2D. Quindi selezionare la linea cellulare dal menu a tendina e scegliere nuova linea cellulare.

Fare clic e trascinare sul nucleo di interesse da analizzare. Quindi fare clic con il tasto destro sul nucleo e scegliere "rinomina particella". Dal menu a discesa, inserire un nome per la particella e poi trascinare l'icona della freccia per modificare il diametro del cerchio.

Successivamente, fare clic sull'icona a destra per marcare il piano centrale del nucleo. Quindi, per avanzare nel tempo e nel piano, selezionare le opzioni frame e Z nella barra degli strumenti in basso e regolare la posizione o la dimensione del cerchio che delimita il nucleo di conseguenza, fino a quando la cellula tracciata si divide. Quando si osserva una divisione cellulare, marcare i nuclei figli e fare clic sull'icona delle finestre per passare al tracciamento della linea cellulare.

L'osservatore segna simultaneamente tutti e tre i nuclei e seleziona "associare al genitore" nell'opzione di linea discendente. Successivamente, quando tutte le cellule sono state tracciate, fare clic sul nome del file e passare al canale. Segnare il residuo della divisione cellulare per analizzare quantitativamente il flusso corticale mediante software di simmetria della velocità delle immagini delle particelle.

Caricare i nuovi file di immagine in pif lab e selezionare lo stile di sequenziamento. 1, 2, 2, 3. Successivamente, passare alla directory contenente la sequenza delle immagini desiderate.

Selezionare le immagini e fare clic su aggiungi per importarle. Quindi, nelle impostazioni di analisi, selezionare esclusioni. Maschera ROI e utilizzare il pulsante.

Disegnare maschere per il fotogramma corrente per disattivare la parte non desiderata delle immagini nelle impostazioni di analisi. Selezionare nuovamente le impostazioni PIF e scegliere la deformazione della finestra della trasformata di Fourier rapida come algoritmo PIF desiderato. Per il primo passaggio, inserire un valore dell'area di interrogazione di 64 pixel con un passo di 32 per il secondo passaggio.

Immettere un valore di area di interrogazione di 32 pixel con un passo di 16. Quindi selezionare "lineare" dal menu a tendina relativo alla deformazione della finestra e scegliere il metodo gaussiano 2x3 punti per la stima dello spostamento sub-pixel. A questo punto, selezionare "analizza" dal menu di analisi e scegliere "analizza tutti i fotogrammi" nell'elaborazione successiva; selezionare la validazione dei vettori dal menu di post-elaborazione e applicare una soglia del filtro per la deviazione standard pari a sette a tutti i fotogrammi dal menu del grafico.

Selezionare i parametri derivati. Modificare i dati seguiti dai vettori, i pixel per fotogramma e regolare la fluidità dei vettori e il filtro passa-alto. Dopo aver applicato queste regolazioni a tutti i fotogrammi, impostare i fotogrammi utilizzati su uno per terminare.

Infine, fare clic sul pulsante per calcolare i vettori medi per misurare i vettori medi di tutti i fotogrammi, concentrandosi sulla rotazione delle gonadi di adulti di tipo selvatico di C. elegans ripresi come appena illustrato. Un modello 3D delle cellule germinali viene generato a partire dai dati di microscopia, consentendo l'analisi delle variazioni dimensionali cellulari che si verificano mentre le cellule transitano dal braccio distale a quello prossimale del cus, mediante microscopia a due colori con acquisizione temporale. I modelli ottenuti mediante proteine di fusione con istone lineare e miosina non muscolare in NDR illustrano il modello stereotipato di ereditarietà dei residui della divisione cellulare.

Inoltre, dai dati delle linee, in questo esperimento possono essere ottenute le tracce per ogni cellula L e ogni residuo di divisione cellulare, nonché la correlazione con il momento della divisione cellulare. È stata eseguita una microscopia a intervalli brevi con elevata risoluzione temporale della miosina non muscolare corticale di tipo due per valutare le differenze nella dinamica del flusso corticale polarizzante tra embrioni di tipo selvaggio e embrioni privi della proteina attivante GTPasi RGA-3, come previsto. Il flusso negli embrioni di tipo selvaggio era prevalentemente lungo l'asse maggiore dell'embrione.

Mentre il flusso nell'embrione con interferenza dell'RNA di RGA tre era ortogonale a questo asse, come facilmente evidente dall'analisi PIP. Una volta acquisita padronanza, la segmentazione manuale di oggetti complessi e il tracciamento cellulare durante lo sviluppo embrionale possono essere eseguiti in poche ore in modo corretto, mentre si tenta di effettuare il tracciamento di cellule e oggetti. È importante ricordare di impostare una risoluzione temporale appropriata per non perdere l'oggetto durante l'analisi utilizzando i tre strumenti descritti qui.

È possibile eseguire anche un'analisi statistica per rispondere a domande sulla variabilità o semplicemente per confrontare diversi embrioni. L'utilizzo di software per l'analisi quantitativa delle immagini ci permette, insieme ad altri biologi dello sviluppo come noi, di esplorare i meccanismi morfogenetici dello sviluppo a un livello di dettaglio senza precedenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un'ampia gamma di strumenti software per eseguire l'analisi quantitativa delle immagini.