Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in C. elegans Utilizzo strumenti open-source

L'obiettivo generale dell'utilizzo di software di analisi delle immagini e della biologia dello sviluppo è quello di ottenere dati quantitativi per modelli meccanicistici dei processi biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, ad esempio come possono essere analizzati quantitativamente i fenotipi dei fenotipi mutanti? Il vantaggio principale di questa metodologia è che fornisce ai ricercatori la capacità di identificare le alterazioni nei processi biologici e nei fenomeni di sviluppo in modo imparziale.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sullo sviluppo e la morfogenesi dell'eleganza del mare, può anche essere applicato ad altri organismi modello come Josepha, A dimostrare la ricostruzione della forma cellulare con IOD sarà CINA Leman, uno studente di dottorato nel mio laboratorio. Dopo aver installato il programma IM MOD, apri la shell dell'eunuco e digita Im mod nella finestra di IM mod. Selezionare il file con i dati grezzi appropriati da cui generare un modello 3D e utilizzare la finestra delle informazioni per individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap.

Nella finestra informativa, di nuovo, traccia i contorni delle celle creando il primo contorno sul piano superiore di ogni cella e avendo cura di creare un nuovo oggetto per ogni cella. Quindi scorri verso il basso in Z e crea un nuovo contorno per ogni piano Z, quindi crea un nuovo oggetto per ogni cella. Dopo aver delineato il numero di celle appropriato per il modello, aprire la finestra della vista del modello per ispezionare gli oggetti e i relativi contorni.

Quindi, nella barra degli strumenti della vista modello, scegliere modifica e oggetti. Si aprirà la rispettiva finestra di modifica per modellare tutte le celle come oggetti riempiti e chiusi. Scegliere mesh come tipo di dati di disegno e riempimento come stile di disegno.

Fare clic su mesh e selezionare l'opzione cap. Quindi controlla tutti gli oggetti necessari e fai clic su mesh. Tutto il programma genererà oggetti solidi dalle pile di contorni.

Modificate la scala Z nella finestra della vista per regolare il fattore di campionamento Z in base alle esigenze. Quindi, nel menu di modifica, selezionare Visualizza per ruotare gli oggetti 3D, salvando istantanee o filmati delle celle a seconda dei casi per tracciare gli oggetti da registrazioni time-lapse fluorescenti. Utilizzando prima il rapporto di mancato recapito, convertire i dati non elaborati in un file TIFF.

Quindi apri il file. In caduta finale. Seleziona l'icona del visualizzatore 2D e fai clic sull'icona di adattamento dell'intervallo per regolare l'istogramma nel menu dei dati.

Selezionare file, nome, immagine, set, canale e impostare la risoluzione X, Y, Z e immettere i valori X, Y e Z. Per annotare i nuclei, spostarsi sul piano di interesse e selezionare nuovamente il visualizzatore 2D. Quindi seleziona la derivazione dal menu a discesa e scegli la nuova derivazione.

Fare clic e trascinare sul nucleo di interesse per il mercato. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sul nucleo e scegliere rinomina particella. Dal menu a discesa, inserisci un nome per la particella, quindi trascina l'icona della freccia per modificare il diametro del cerchio.

Quindi, fare clic sull'icona a destra per contrassegnare il piano centrale del nucleo. Quindi, per procedere nel tempo e nel piano, scegli le opzioni cornice e Z nella barra degli strumenti in basso e regola la posizione o la dimensione del cerchio che segna il nucleo di conseguenza fino a quando la cellula tracciata non si divide. Quando si osserva una divisione cellulare, contrassegnare i nuclei figli e fare clic sull'icona di Windows per passare al lignaggio.

Il visualizzatore contrassegna tutti e tre i nuclei contemporaneamente e seleziona associa genitore sotto l'opzione di derivazione. Quindi, quando tutte le celle sono state tracciate, fai clic sul nome del file e passa al canale. Marcatura del residuo di divisione cellulare per analizzare quantitativamente il flusso corticale utilizzando il software di simmetria della velocità dell'immagine delle particelle.

Carica i nuovi file immagine in pif lab e seleziona lo stile di sequenziamento. 1, 2, 2, 3. Quindi, vai alla directory contenente la sequenza di immagini desiderate.

Seleziona le immagini e fai clic su aggiungi per importare le immagini. Quindi, in Impostazioni analisi, selezionare Esclusioni. ROI e utilizzare il pulsante.

Disegna maschere per il fotogramma corrente per disattivare la parte indesiderata delle immagini nelle impostazioni di analisi. Ancora una volta, seleziona le impostazioni PIF e scegli la deformazione rapida della finestra di trasformazione di Fourier come algoritmo PIF desiderato. Per il primo passaggio, immettere un valore dell'area di interrogazione di 64 pixel con un passo di 32 al secondo passaggio.

Immettere un valore dell'area di interrogazione di 32 pixel con un passo di 16. Quindi selezionare lineare dal menu a discesa della deformazione della finestra e scegliere il metodo gaussiano a due punti per tre per la stima dello spostamento dei subpixel. Ora seleziona analizza dal menu di analisi e seleziona analizza tutti i fotogrammi in post-elaborazione, seleziona convalida vettoriale dal menu in post-elaborazione e applica una soglia di filtro di deviazione standard di sette a tutti i fotogrammi dal menu del grafico.

Selezionare i parametri derivati. Modifica i dati seguiti da vettori, pixel per fotogramma e regola l'uniformità dei vettori e del filtro passa-alto. Dopo aver applicato queste regolazioni a tutti i fotogrammi, impostate i fotogrammi utilizzati su uno per terminare.

Infine, fai clic sul pulsante calcola vettori medi per misurare i vettori medi di tutti i fotogrammi, concentrandoti sul giro della gonade degli adulti di eleganza selvatica di tipo C immaginati come appena dimostrato. Dai dati della microscopia viene generato un modello 3D delle cellule germinali, che consente l'analisi dei cambiamenti nelle dimensioni delle cellule che si verificano durante il transito delle cellule dal braccio distale a quello prossimale delle cellule utilizzando la microscopia time-lapse a due colori. I modelli ottenuti dalle proteine di fusione degli istoni di linea e dalla miosina non muscolare in NDR illustrano il modello stereotipato dell'ereditarietà del residuo di divisione cellulare.

Inoltre, dai dati di linea, si possono ottenere le tracce per ogni cella L e residuo di divisione cellulare e la correlazione con i tempi di divisione cellulare. La microscopia time-lapse a breve termine con alta risoluzione temporale della miosina corticale non muscolare due è stata eseguita per valutare le differenze nella dinamica del flusso di polarizzazione corticale tra embrioni wild type e impoveriti per la riga gtpa attivante la proteina RGA tre come previsto. Il flusso negli embrioni wild type era prevalentemente lungo l'asse lungo dell'embrione.

Mentre il flusso nell'embrione con interferenza a tre RNA RGA era ortogonale a questo asse, come facilmente evidente dall'analisi PIP. Una volta padroneggiata, la segmentazione manuale di oggetti complessi e il tracciamento delle cellule durante lo sviluppo embrionale possono essere eseguiti entro poche ore, se correttamente, mentre si tenta di eseguire il tracciamento di cellule e oggetti. È importante ricordarsi di impostare una risoluzione temporale appropriata per non perdere l'oggetto durante l'analisi utilizzando i tre strumenti qui descritti.

L'analisi statistica può anche essere eseguita per rispondere alle domande sulla variabilità o semplicemente per confrontare diversi embrioni. L'implementazione di un software di analisi quantitativa delle immagini consente a noi e ad altri biologi dello sviluppo come noi di esplorare i meccanismi morfogenetici dello sviluppo a un livello di dettaglio senza precedenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una serie diversificata di strumenti software per eseguire l'analisi quantitativa delle immagini.