Name: Di base Caenorhabditis elegans Metodi: sincronizzazione e di osservazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Impara a sincronizzare C. elegans allo stadio larvale L1 usando ipoclorito alcalino per isolare gli embrioni. Questo metodo standard facilita studi di biologia dello sviluppo con popolazioni uniformi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori ringraziano MICINN (PTA programma di sostegno Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Phd Fellowship a Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programma di sostegno Julián Cerón), e Marie Curie IRG, ISCIII e IDIBELL per il finanziamento il laboratorio.

1. Protocollo A: Worms coltura per Bleaching 11 Popolazioni di C. elegans può essere ottenuto coltivando loro o in terreni liquidi o su supporti solidi in piastre. Di solito sono cresciuti su un solido NGM (Media crescita nematodi) e alimentate con E. coli, che si aggiungono alle piastre sia vivo o morto (ucciso da UV 12, dal calore o dal freddo 13 14). La procedura più comune utilizza dal vivo OP50 E. coli, che è carente nella sintesi di uracile e non possono proliferare in uno strato spesso che oscurerebbe i vermi. <ol><li> Mescolare 3 g di NaCl, 17 g di agar e 2,5 g di peptone e aggiungere 975 ml di H 2 O. Autoclave per 50 min. </li><li> Raffreddare il pallone a 55 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 5 mg / ml in etanolo colesterolo, 1 ml di 1 M MgSO 4 e 25 ml di 1 M KPO 4 tampone (tutti ma colesterolo precedentemente autoclavabilendr). </li><li> Utilizzando procedure sterili erogare la soluzione NGM in piastre di Petri; riempire piastre fino a 2/3 del loro volume. </li><li> Una volta asciutto, è opportuno lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell&#39;uso per la rilevazione di contaminanti. Preparare una striscia di OP50 E. coli provenienti da uno stock di glicerolo (OP50 possono essere ottenute presso il Caenorhabditis Genetics Center). </li><li> Scegliere una singola colonia e crescere in LB notte a 37 ° C con agitazione. </li><li> Consentire eccesso di evaporazione dalle piastre rimuovendo il coperchio nel flusso laminare e aggiungere OP50 al centro delle piastre con una pipetta Pasteur sterile. </li><li> Lasciare che il E. OP50 prato coli di crescere durante la notte a temperatura ambiente oa 37 ° C per 8 ore. </li><li> Aggiungere la quantità desiderata di vermi alle piastre (se incubate a 37 ° C le piastre devono essere raffreddati a temperatura ambiente prima dell&#39;uso). </li></ol> TIPS: <ul><li> La colata della stessa quantità di mezzile piastre con una pipetta o un erogatore pompa assicura lo stesso volume di agar alle piastre e facilita lo spostamento della piastra, senza necessità di reindirizzare il stereomicroscopio. </li><li> Piastre (sia semi e non seminata con batteri) può essere utilizzato diverse settimane dopo preparata se conservata in un contenitore a temperatura ambiente o 4 ° C. </li><li> Evitare placcatura i batteri al bordo della piastra. Se il prato estende fino ai bordi della piastra dei vermi può strisciare i lati, asciugare e muoiono. </li><li> Worms vivono più a lungo se i batteri seminati sulle piastre sono già morti 15. </li></ul> 2. Protocollo B: Il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino (&quot;bleaching&quot;) 11 La tecnica sbiancante viene utilizzato per sincronizzare C. culture elegans nella prima fase larvale (L1). Il principio del metodo risiede nel fatto che i vermi sono sensibili alla candeggina mentre il guscio dell&#39;uovo e proteggembryos da esso. Dopo il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino, gli embrioni vengono incubati in mezzi liquidi senza cibo, che permette la schiusa, ma impedisce l&#39;ulteriore sviluppo. <ol><li> Lasciare vermi a crescere fino a stadio adulto. </li><li> Recupera adulti gravide a provette da 15 ml lavando piatti con tampone M9. </li><li> Vermi pellet mediante centrifugazione per 2 minuti a 400xg (~ 1500 rpm in una centrifuga da tavolo standard) a temperatura ambiente il surnatante. </li><li> Eseguire lavaggi 1-3 finché il buffer appare chiaro di batteri. </li><li> Aggiungere la soluzione desiderata sbianca (Tabella I) e agitare per alcuni minuti (distruzione del tessuto adulto devono essere monitorati sotto il microscopio da dissezione e la reazione ferma quando le tracce di adulti sono ancora visibili, che richiede in genere tra 3 e 9 minuti a seconda delle diverse questioni, come il volume del verme pellet, menzionato nella discussione) (Fig. 3). </li><li> Fermare la reazione aggiungendo M9 buffer per riempire il tubo. </li><li> Rapidamente centrifugare (poiché il trattamento può essere ancora attivo) per 1 minuto a 400 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Lavare a pellet altre tre volte riempiendo la provetta con il tampone M9. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone M9 al pellet, o mettere le uova a piastre NGM non teste di serie, e incubare alla temperatura desiderata con leggera agitazione. Aerazione adeguata dovrebbe essere fornita (Fig. 4). </li></ol> TIPS: <ul><li> Ci sono diverse soluzioni sbiancanti, scegliere quello che funziona meglio nelle vostre mani (Tabella 1, fig. 1). </li><li> Uova già previste sulle piastre possono essere recuperati dalla demolizione la superficie del agar con un materiale morbido, come un pezzo di una pellicola a raggi X. </li><li> Troppi resti di animali adulti, può compromettere la sincronizzazione poiché costituiscono un approvvigionamento di cibo per le larve di recente tratteggiato. </li><li> L&#39;aumento delle temperature un po &#39;accelerare lo sviluppo, che è scomodo if qualsiasi verme salta sincronizzazione perché la differenza di sviluppo tra vermi sincronizzate e sincronizzati sarà maggiore a temperature più elevate. </li><li> Soluzione di sbianca deve essere effettuata appena prima della sua utilizzazione. Inoltre, candeggina perde potenza dopo che è stato aperto per un po &#39;, in parte a causa della sua fotosensibilità. Si consiglia di aliquota ogni bottiglia nuovo in otri ambra piccoli per evitare la perdita e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li></ul> 3. Protocollo C: Placcatura Worm <ol><li> Attendere tra 12 e 24 ore (tempo per completare sviluppo embrionale dipende dalla temperatura) è stata eseguita dopo sbiancamento e recuperare vermi mediante centrifugazione (2 minuti a 400 xg). </li><li> Gettare il surnatante, worm seme sulle tavole che sono necessarie e lasciare asciugare il liquido restante. </li><li> Posizionare le piastre alla temperatura richiesta. </li></ol> TIPS: <ul><li> Larve L1 in M9 tampone può essere mantenuto a 15 ° C a dondolo almeno per una settimana wiThout alterazioni evidenti. </li><li> fare attenzione nel calcolo i vermi si seme perché troppi può esaurire il cibo più velocemente del previsto e rovinare il vostro esperimento. Circa 500 L1 può raggiungere l&#39;età adulta in una piastra 55 mm, senza rimanere a corto di cibo. </li></ul> 4. Protocollo D: C. elegans osservazione D.1 Nomarski osservazione Interferenza differenziale microscopia ottica di contrasto è una tecnica di microscopia di illuminazione utilizzati per migliorare il contrasto non colorati in campioni trasparenti. Il Nomarski parola si riferisce al prisma utilizzato, il nome del suo inventore. Osservando gli animali vivi, siamo in grado di esaminare la fisiologia dell&#39;animale con le alterazioni soli derivati ​​da immobilizzazione. Inoltre, poiché non viene aggiunto fissativo, marcatori fluorescenti possono essere osservato in vivo. Questo fatto e la possibilità di marcatori fluorescenti fusione ad un gene di interesse perché sia ​​possibile seguire processi which la proteina di studio possono essere coinvolti. Utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo, non solo i vermi vivi può essere osservato, ma possono anche essere recuperato e piastrate nuovamente. Agar preparazione pad (appena prima dell&#39;uso): <ol><li> Preparare agarosio 2% in acqua e si fondono. Mantenere fuso a 65 ° C. </li><li> Posizionare due vetrini con un pezzo di nastro su di essi su entrambi i lati di un terzo, vetrino pulito. </li><li> Usando una pipetta Pasteur luogo una goccia di agar sulla superficie pulita. </li><li> Coprire il agar con un altro vetrino pulito collocato su tre slitte perpendicolarmente. </li><li> Premere tal modo, l&#39;agar goccia è appiattita allo spessore dei distanziali a nastro. </li><li> Una volta che l&#39;agar si solidifica, estrarre delicatamente i vetrini nastrate e separare le due rimanenti diapositive facendo scorrere uno rispetto all&#39;altro. </li></ol> Montaggio animali vivi <ol start="7"><li> Porre una goccia (10 ul) di levamisole 1mm o di sodio azide 10-30 mm su tha centro del pad. </li><li> Di trasferire gli animali in calo con un pick worm. </li><li> Posizionare delicatamente il coprioggetto sugli animali e fissarlo su entrambi i lati con un po &#39;smalto o silicone. </li></ol> TIPS: <ul><li> Mantenere aliquote di agarosio 2% a 4 ° C. </li><li> Agarosio fuso può essere mantenuta a 65 ° C per almeno un giorno. </li><li> Nota: Levamisole è un agonista del recettore nicotinico che provoca la paralisi spastica dei muscoli 16. </li><li> Siate cauti, sodio azide è estremamente tossico! </li></ul> D.2 Etanolo fissazione e colorazione DAPI Il protocollo qui descritto rappresenta un modo veloce di tintura vermi con DAPI, tuttavia a causa della dissecation del worm alcune strutture possono presentare qualche alterazione. Ci sono molti altri metodi per fissare i vermi precedenti colorazione DAPI come la fissazione con la soluzione di Carnoy o formaldeide che meglio preservare l&#39;integrità del worm 17. Etanolo di fissaggio (modificato da 18) <ol><li> Inserire ~ 10 pl di tampone M9 (o acqua) su un vetrino da microscopio. </li><li> Utilizzando un worm scegliere attentamente trasferire 10-25 vermi alla goccia. </li><li> Utilizzando carta da filtro o di una micro-pipetta rimuovere il tampone M9 il più possibile, senza rimuovere i vermi o lasciarli asciugare. </li><li> Aggiungi ~ 10 pl del 90% di etanolo e lasciare asciugare. </li><li> Ripetere il punto 4 una o due volte. </li></ol> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione <ol start="6"><li> Mescolare DAPI con i mezzi di montaggio desiderata ad una concentrazione finale di 2 ng / pl. </li><li> Una volta che l&#39;etanolo è completamente evaporato, si aggiungono 7 microlitri della DAPI: montaggio miscela media. </li><li> Posizionare un vetrino e fissarlo su entrambi i lati con un po &#39;smalto o silicone. I vetrini sarà pronto per l&#39;osservazione circa 5 minuti dopo l&#39;aggiunta di DAPI. </li></ol> TIPS: <ul><li> Il montaggio media contiene glicerolo, quindi una piccola quantità è sufficiente a coprire l&#39;intera preparazione. </li><li> Esiste una vasta gamma di supporti di montaggio commerciali (Fluoromount o prolungare, per esempio), la loro qualità e il prezzo dipenderà da quanto tempo si desidera memorizzare il vostro campione. </li><li> Attenzione, DAPI è un noto agente mutageno che si lega fortemente ad AT regioni ricche di DNA. </li></ul> Ricette Nematode Medio Crescita (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM NaCl 0,25% (w / v) Peptone 1 mM CaCl 2 5 pg / ml Colesterolo 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9 tampone 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Soluzioni di sbianca testato <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> Ricetta # 1 </td><td> Ricetta # 2 </td><td> Ricetta # 3 </td><td> Ricetta # 4 </td><td> Ricetta # 5 </td></tr><tr><td> acqua (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> idrossido di sodio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> ipoclorito di sodio ~~~V 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> totale (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabella I. ricette diverse soluzioni sbiancanti testato per questo articolo. Ricette # 3 e # 4 sono 2x, e devono essere aggiunti allo stesso volume di M9. Ricette per # 1, # 2 e # 5 sono stati riportati in precedenza 2, 11, 19. Le concentrazioni finali: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl ~~~V 0,8%<html> , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Rappresentativi risultati <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Confronto tra cinque diverse soluzioni sbiancanti in due tempi diversi di incubazione. Vermi N2 lavato due volte con M9 sono stati divisi in cinque provette da 15 ml coniche contenenti ciascuna soluzione sbiancante. I tubi sono stati agitati vigorosamente e 1 ml trasferito in una nuova provetta con M9 per arrestare la reazione dopo il tempo specificato. Dopo lo sbiancamento vermi procedura sono stati incubati con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. In ogni caso, inferiore a foto è stata scattata subito dopo il candeggio, figura in alto dopo 24 ore. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura di soluzione di sbianca influenza l&#39;efficacia del trattamento. Volumi uguali di vermi N2 sono stati sbiancata con la stessa soluzione sbianca sia precedentemente raffreddata su ghiaccio per 20 minuti e mantenuta a 25 ° C per lo stesso tempo. Le due colonne sulla sinistra mostrano le immagini subito dopo lo sbiancamento. Dopo trattamento vermi sono state incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. Colonne sulle immagini sul display di destra 24 ore dopo. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Il rapporto verme pellet: tempo di incubazione ipoclorito alcalino influenza l&#39;efficacia del trattamento microlitri 50, 100, 250 e 500 della vite senza fine pellet sono stati incubati con 2 ml di soluzione di sbianca # 3 per 3 minuti, 6 e 9.. L1, gli embrioni nati morti e resti di frammenti adulti sono stati quantificati dopo incubazione a 20 ° C per 2<html> 4 ore in 15 ml provette coniche con 1 ml di tampone M9. Circa tre confluenti 55 mm con piastre di vermi adulti sono necessari per ottenere un 100 pl verme pellet. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La corretta aerazione è necessario per la schiusa e la sopravvivenza di C. embrioni elegans. pellet A 100 pl di vermi N2 sono stati sbiancata per 6 minuti e incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml, 5 o 10, come specificato, di M9 a 20 ° C per 24 ore. La parte superiore della figura mostra le immagini delle culture dopo 24 ore, ove le frecce indicano che le uova si schiudono non. Nella parte inferiore, vi è un grafico che illustra la quantità di larve (grigio chiaro) ed embrioni morti (grigio scuro) 48 ore dopo lo sbiancamento alle condizioni indicate. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo di vita di C. elegans. uno. Durata approssimativa dei vermi nelle diverse fasi. Ore necessarie per raggiungere ogni fase in funzione della temperatura (modificato da 20). B. Nomarski (in alto) e DAPI (in basso) le immagini di vermi diversi nelle fasi di sviluppo indicati. Caratteristiche più significative di ogni fase vengono ingranditi L1: freccia indica i precursori della gonade somatica e linea germinale precoce L4: freccia nera (Nomarski) indica la vulva di sviluppo; frecce bianche (DAPI) indicano i due bracci Mid-gonadici... tardo L4: freccia indica la vulva sviluppando la cosiddetta fase di albero di Natale adulti giovani:. freccia nera indica un embrione all&#39;interno dell&#39;utero, Arrowhead punti al spermateca, freccia bianca indica un ovocita Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) sottolinea embrioni fecondati. Arrow in DAPI immagine indica spermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Morfologia Vulva a L3, L4 e stadi adulti. Nella fase L3 solo un piccolo lume dove viene formata la vulva può essere osservato. A L4, questo lume espande formando il cosiddetto &quot;albero di Natale&quot;. Nell&#39;adulto la vulva è già chiuso. Le linee gialle indicano la posizione della vulva in queste tre fasi. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Colorazione DAPI a L3, L4 precoce, stadi più avanzati L4 e adulti. A L3, linea germinale è allungata. A L4, gonadi armi presenti a forma di U morfologia. Al fine-L4 spermatozoi stadio può essere osservato nella parte distale della gonade. Giovani Adulti presenti ovociti. La linea germinale Adult presenta ovociti ed embrioni. Le linee gialle delimitano linee germinali a thle e diverse fasi indicate. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. C. sviluppo elegans a 15 e 25 ° C. I vermi N2 erano sbiancata, incubate per una notte in M9 e agitazione a 15 ° C, trasferito a piatti e coltivate i tempi indicati alle temperature indicate.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+cell+death%3A+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li>
<li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li>
<li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li>
<li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+longevity%3A+lessons+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li>
<li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).</li>
<li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li>
<li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504(2007).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li>
<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Nematode sincronizzazione Varie soluzioni sono state descritte sbianca. Abbiamo provato cinque diverse ricette (Tabella I) e, nelle nostre mani, non hanno mostrato differenze significative nella sincronizzazione delle popolazioni a vite senza fine (Fig. 1). Tuttavia, i nostri esperimenti ha dimostrato che parametri quali la temperatura (Fig. 2), la soluzione rapporto di sbianca: volume di vermi (Fig. 3) e il volume di M9 con cu...

di base<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; metodi: sincronizzazione e di osservazione

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

La ricerca sulla biologia molecolare e dello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans è iniziata nei primi anni settanta da Sydney Brenner e da allora è stato ampiamente utilizzato come organismo modello 1. C. elegans possiede attributi chiave come la semplicità, la trasparenza e il breve ciclo di vita che ne hanno fatto un adeguato sistema sperimentale per studi biologici di base per molti anni 2. Scoperte di questo nematode avere vaste implicazioni, perché molti processi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo degli animali sono soggetti ad evoluzione conservate 3. C. elegans ciclo di vita passa attraverso uno stadio embrionale e quattro stadi larvali prima che l&#39;animale raggiunge l&#39;età adulta. Lo sviluppo può prendere da 2 a 4 giorni a seconda della temperatura. In ciascuno dei diversi stadi tratti caratteristici possono essere osservati. La conoscenza della sua linea cellulare completo di 4,5 insieme al annotat profondaione del suo genoma trasformare questo nematode in un grande modello in campi diversi come la neurobiologia 6, l&#39;invecchiamento 7,8, biologia delle cellule staminali 9 e biologia linea germinale 10. Una caratteristica aggiuntiva che rende C. elegans un modello attraente per lavorare con la possibilità di ottenere popolazioni di vermi sincronizzati in una fase specifica attraverso un protocollo di relativamente facile. La facilità di manutenzione e di moltiplicazione questo nematode aggiunta alla possibilità di sincronizzazione fornire un potente strumento per ottenere grandi quantità di vermi, che possono essere utilizzati per una varietà di piccoli esperimenti o ad alta resa come schermi RNAi, microarrays, sequenziamento di massa, immunoblot o ibridazione in situ, tra gli altri. A causa della sua trasparenza, C. elegans strutture possono essere distinti sotto il microscopio usando microscopia interferenza differenziale contrasto, noto anche come micro Nomarskicopiare. L&#39;impiego di un legante DNA fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo), per esempio, può portare alla identificazione specifica e la localizzazione delle singole celle, così come le strutture subcellulari / difetti ad essi associati.

La facilità di mantenere e diffondere il nematode<em&gt; C. elegans</em&gt; Ne fanno un organismo modello bello lavorare con. La possibilità di vermi sincronizzazione consente di lavorare con una quantità significativa di soggetti alla stessa fase di sviluppo, che facilita lo studio di un processo particolare in molti animali.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

La ricerca sulla biologia molecolare e dello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans è stata avviata all'inizio degli anni Settanta da Sydney Brenner e ha...

In questo video, ti mostreremo come sincronizzare C. elegans allo stadio di prima istar. Si tratta di un metodo semplice, ma molto comune, quindi sarà molto utile, specialmente se sei ancora un principiante.Se si è esperti in C, si possono trovare qui alcuni suggerimenti per ottimizzare questo protocollo. La base della sincronizzazione dei vermi risiede nella resistenza relativa dei larvacei ed embrioni rispetto alla soluzione alcalina di ipoclorito che uccide gli adulti. Gli adulti di questi vermi, contenenti molti embrioni al loro interno, vengono incubati con una soluzione di ipoclorito in modo da essere eliminati, lasciando soltanto gli embrioni.La seconda parte della sincronizzazione si ottiene attraverso la mancanza di cibo, in modo che, anche se gli embrioni si sviluppano in momenti diversi, non progrediscano oltre lo stadio L uno. Il primo passo per avviare un protocollo di blitzing è avere vermi allo stadio di deposizione delle uova, con diverse uova sparse sulla piastra. Utilizzare M nove per recuperare gli adulti al fine di raccoglierli.Inoltre, gli embrioni che hanno già raggiunto la superficie della piastra possono essere prelevati con un materiale morbido, come un pez

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, mostriamo un metodo per produrre una popolazione sincronizzata con lo sviluppo di C. elegans adulti sterili. Il protocollo di esempio sincronizza i vermi per studiare i tassi di consumo di ossigeno negli animali vivi.

Sincronizzazione dei nematodi: un metodo per ottenere popolazioni di vermi in identiche fasi di sviluppo

Per studiare la relazione tra omeostasi proteica, stress e invecchiamento, abbiamo monitorato i cambiamenti nel ripiegamento delle proteine seguendo la disfunzione proteica, la localizzazione delle proteine nella cellula e la stabilità delle proteine a livello di organismo, cellulare e proteico, utilizzando il metazoo geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans come sistema modello.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Qui, vengono presentati protocolli standardizzati per valutare l'induzione della risposta agli shock termici (HSR) in Caenorhabditis elegans utilizzando RT-qPCR a livello molecolare, reporter fluorescenti a livello cellulare e termorecupero a livello di organismo.

Metodi standardizzati per misurare l'induzione della risposta agli urti di calore in Caenorhabditis elegans

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell'attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Caenorhabditis elegans funge da eccellente sistema modello con metodi robusti e a basso costo per il rilevamento della durata della salute, della durata della vita e della resilienza allo stress.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

Questo è un metodo comunemente usato per la dissezione delle gonadi di C. elegans seguita da crack congelato, che produce campioni della linea germinale per l'immunofluorescenza tramite colorazione anticorpale o per la semplice colorazione DAPI per visualizzare il DNA. Questo protocollo ha avuto successo per gli studenti universitari in un laboratorio di ricerca e in un'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.

C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per l'imaging della morfologia mitocondriale in più tessuti di C. elegans durante l'invecchiamento .

Imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante l'invecchiamento

Questo studio esamina l'effetto dell'età sulla locomozione in C. elegans misurando il più grande esponente di Lyapunov (LLE). Con l'avanzare dell'età, C. elegans mostra un aumento e un conseguente declino del controllo motorio. I risultati mostrano un picco di LLE a cinque giorni, seguito da un calo con l'avanzare dell'età dei vermi.

Dinamica della locomozione età-dipendente in Caenorhabditis elegans: un'analisi dell'esponente di Lyapunov

Impara a sincronizzare C. elegans allo stadio larvale L1 usando ipoclorito alcalino per isolare gli embrioni. Questo metodo standard facilita studi di biologia dello sviluppo con popolazioni uniformi.

Di base

Esplora altri video