Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo
10 agosto 2018
Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare lo sviluppo di cuori in zebrafish in 4 dimensioni (4D). Imaging 4D, tramite microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM), prende 3-dimensionale (3D) immagini nel corso del tempo, di ricostruire i cuori in via di sviluppo. Indichiamo qualitativamente e quantitativamente che lo shear stress attiva endocardial tacca di segnalazione durante lo sviluppo di camera, che promuove trabeculation cardiaco.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanobiologia cardiaca dello sviluppo, come la modulazione dello sforzo di taglio sulla trabecolazione cardiaca tramite segnalazione notch utilizzando un microscopio a foglio di luce 4D. Il vantaggio principale di questa tecnica è che illumina una sezione sottile del campione con un piano di cinque micron, portando a un minore sbiancamento e danneggiamento delle foto. Inoltre, il nostro algoritmo computazionale ci permette di ricostruire un cuore di pesce zebra che batte in 4D.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi delle malattie cardiache congenite in quanto consente la visualizzazione sequenziale invivo della trabecolazione cardiaca in una fase iniziale dello sviluppo fino al fenotipo successivo. In generale, le persone che sono nuove a questa tecnica scopriranno che pensare in tre dimensioni nel tempo è difficile da immaginare. Inoltre, ci vuole tempo per creare il sistema e allinearlo accuratamente.
Per iniziare, separa il maschio e la femmina di pesce zebra nelle vasche di riproduzione utilizzando un divisorio. Quindi, solleva il divisore e consenti al pesce zebra maschio e femmina di riprodursi. Raccogli gli embrioni di pesce zebra e inietta l'oligo morfolino nell'embrione per inibire la trabecolazione.
Quindi, prepara un gel di agarosio all'uno per cento aggiungendo un grammo di agarosio a 100 millilitri di acqua distillata e scaldalo fino a quando tutto l'agarosio non si sarà sciolto. Lasciare raffreddare l'agarosio e poi utilizzare una pipetta da 20 microlitri per caricare un piccolo tubo di plastica con uno degli embrioni preparati e l'agarosio. Fissare il tubo sul tavolino del microscopio e utilizzare l'obiettivo ten x.
Regolare l'obiettivo utilizzando la manopola in modo che la parte superiore dell'embrione sia a fuoco. Scatta immagini dell'intero embrione di pesce in più cicli di battito cardiaco utilizzando un foglio di spessore leggero di cinque micron. Raccogli 500 fotogrammi xy con un tempo di esposizione di dieci millisecondi.
Quindi, spostare lo stadio di un micron nell'accesso z a un nuovo strato e ripetere la procedura di imaging. Continua a immaginare 500 fotogrammi per piano z fino a quando l'intero cuore non è completamente ripreso. Quindi, apri il software di elaborazione delle immagini e inizia a impilare le immagini in 3D.
Per fare ciò, fai prima clic su dati aperti. Qui, seleziona tutte le immagini che devono essere impilate in 3D e quindi seleziona carica. Quindi aggiungi la dimensione del voxel di 0,65 per 0,65 per un micron e fai clic su ok.
L'inserimento della dimensione corretta del voxel è fondamentale per un'analisi accurata delle immagini 3D. Ora, fai clic sulla casella di visualizzazione del multiplatore e visualizza l'immagine 3D. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella tiff blu slice one dot, selezionare display, quindi fare clic su volran.
Nel menu di modifica, selezionare le opzioni, quindi modificare la mappa dei colori. Regola il colore utilizzando le caselle e quindi fai clic su ok. Mentre sei ancora nel software di elaborazione delle immagini, fai clic su file e apri i dati della serie temporale.
Seleziona i tiff 3D che sono stati appena creati facendo clic su carica e inserisci la stessa dimensione del voxel di prima. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella tiff blu Slice One Dot, quindi selezionare Display seguito da Volran. Ora, fai clic su modifica.
Seleziona le opzioni. E quindi seleziona modifica mappa colori. Regola il colore utilizzando le caselle e quindi fai clic su ok.
Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sul controllo della serie temporale, fai clic su Movie Maker e premi il pulsante di riproduzione per guardare il film. Per finire, aggiungi un nome file, la dimensione del fotogramma, la frequenza dei fotogrammi, una qualità uguale a uno e inserisci monoscopico. Quindi fare clic su Applica.
Infine, esporta il video. Le forze biomeccaniche, come lo stress da taglio emodinamico, sono intimamente coinvolte nella morfogenesi cardiaca. Qui, la microscopia a fluorescenza a foglio ottico è stata utilizzata per visualizzare le creste trabecolari che sporgono nel lume ventricolare a 75 ore dopo la fecondazione.
A 100 ore dalla fecondazione si può vedere chiaramente una rete trabecolare. In un embrione trattato con la microiniezione gata1aMO, l'emopoiesi e la viscosità sono ridotte del 90%. Questa diminuzione della viscosità ha attenuato lo stress di taglio emodinamico, con conseguente inizio ritardato e una rete trabecolare meno densa.
Questo ritardo e la densità della rete trabecolare sono stati recuperati regolando l'espressione genica correlata al notch, salvando la formazione trabecolare a 75 ore dopo la fecondazione e a 100 ore dopo la fecondazione. Pertanto, gli oligonucleotidi morfolino gata1a hanno ridotto le forze emodinamiche portando alla regolazione verso il basso della segnalazione notch, mentre l'mRNA Nrg1 recupera i geni correlati a notch regolati e ha riavviato la trabecolazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica di imaging può essere completata in circa due ore se eseguita correttamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo cardiaco per studiare i fattori nel gene notch, che sono responsabili della corretta formazione della trabecolazione nel pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire immagini utilizzando la microscopia a illuminazione selettiva del piano e creare file di immagine 4D. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso.
E le precauzioni, come indossare occhiali adeguati, dovrebbero sempre essere prese durante questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per visualizzare i cuori in via di sviluppo nei pesci rossi utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio di luce 4-D (LSFM). Il metodo permette la ricostruzione dello sviluppo cardiaco nel tempo, rivelando il ruolo dello stress da taglio nell'attivazione del segnale Notch endocardiale durante lo sviluppo delle camere.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dello sviluppo
- Mechanobiologia cardiaca
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo cardiaco è cruciale per diagnosticare le malattie cardiache congenite.
- Lo stress da taglio influenza la trabecolazione cardiaca attraverso il segnale Notch.
- L'imaging 4-D fornisce informazioni su processi biologici dinamici.
- La microscopia a foglio di luce minimizza lo sbiancamento fotochimico e i danni.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare lo sviluppo cardiaco nei pesci rossi in tempo reale.
- Investigare gli effetti dello stress da taglio sulla trabecolazione cardiaca.
- Sviluppare un algoritmo computazionale per la ricostruzione cardiaca 4-D.
Metodi utilizzati
- Microscopia a fluorescenza a foglio di luce 4-D (LSFM).
- Ricostruzione di cuori di pesci rossi battenti utilizzando algoritmi computazionali.
- Visualizzazione sequenziale delle fasi di sviluppo cardiaco.
- Analisi degli effetti dello stress da taglio sul segnale Notch.
Risultati principali
- Lo stress da taglio attiva il segnale Notch endocardiale durante lo sviluppo delle camere cardiache.
- La tecnica di imaging 4-D permette un'osservazione dettagliata della trabecolazione cardiaca.
- La riduzione dello sbiancamento fotochimico e dei danni migliora la qualità dell'imaging.
- Il metodo aiuta a comprendere i meccanismi delle malattie cardiache congenite.
Conclusioni
- La tecnica 4-D LSFM è uno strumento potente per studiare lo sviluppo cardiaco.
- Le intuizioni acquisite potrebbero portare a migliori metodi diagnostici per le malattie cardiache congenite.
- Le applicazioni future potrebbero estendersi ad altre aree della biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
