Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanobiologia cardiaca dello sviluppo, come la modulazione dello sforzo di taglio sulla trabecolazione cardiaca tramite segnalazione notch utilizzando un microscopio a foglio di luce 4D. Il vantaggio principale di questa tecnica è che illumina una sezione sottile del campione con un piano di cinque micron, portando a un minore sbiancamento e danneggiamento delle foto. Inoltre, il nostro algoritmo computazionale ci permette di ricostruire un cuore di pesce zebra che batte in 4D.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi delle malattie cardiache congenite in quanto consente la visualizzazione sequenziale invivo della trabecolazione cardiaca in una fase iniziale dello sviluppo fino al fenotipo successivo. In generale, le persone che sono nuove a questa tecnica scopriranno che pensare in tre dimensioni nel tempo è difficile da immaginare. Inoltre, ci vuole tempo per creare il sistema e allinearlo accuratamente.

Per iniziare, separa il maschio e la femmina di pesce zebra nelle vasche di riproduzione utilizzando un divisorio. Quindi, solleva il divisore e consenti al pesce zebra maschio e femmina di riprodursi. Raccogli gli embrioni di pesce zebra e inietta l'oligo morfolino nell'embrione per inibire la trabecolazione.

Quindi, prepara un gel di agarosio all'uno per cento aggiungendo un grammo di agarosio a 100 millilitri di acqua distillata e scaldalo fino a quando tutto l'agarosio non si sarà sciolto. Lasciare raffreddare l'agarosio e poi utilizzare una pipetta da 20 microlitri per caricare un piccolo tubo di plastica con uno degli embrioni preparati e l'agarosio. Fissare il tubo sul tavolino del microscopio e utilizzare l'obiettivo ten x.

Regolare l'obiettivo utilizzando la manopola in modo che la parte superiore dell'embrione sia a fuoco. Scatta immagini dell'intero embrione di pesce in più cicli di battito cardiaco utilizzando un foglio di spessore leggero di cinque micron. Raccogli 500 fotogrammi xy con un tempo di esposizione di dieci millisecondi.

Quindi, spostare lo stadio di un micron nell'accesso z a un nuovo strato e ripetere la procedura di imaging. Continua a immaginare 500 fotogrammi per piano z fino a quando l'intero cuore non è completamente ripreso. Quindi, apri il software di elaborazione delle immagini e inizia a impilare le immagini in 3D.

Per fare ciò, fai prima clic su dati aperti. Qui, seleziona tutte le immagini che devono essere impilate in 3D e quindi seleziona carica. Quindi aggiungi la dimensione del voxel di 0,65 per 0,65 per un micron e fai clic su ok.

L'inserimento della dimensione corretta del voxel è fondamentale per un'analisi accurata delle immagini 3D. Ora, fai clic sulla casella di visualizzazione del multiplatore e visualizza l'immagine 3D. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella tiff blu slice one dot, selezionare display, quindi fare clic su volran.

Nel menu di modifica, selezionare le opzioni, quindi modificare la mappa dei colori. Regola il colore utilizzando le caselle e quindi fai clic su ok. Mentre sei ancora nel software di elaborazione delle immagini, fai clic su file e apri i dati della serie temporale.

Seleziona i tiff 3D che sono stati appena creati facendo clic su carica e inserisci la stessa dimensione del voxel di prima. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla casella tiff blu Slice One Dot, quindi selezionare Display seguito da Volran. Ora, fai clic su modifica.

Seleziona le opzioni. E quindi seleziona modifica mappa colori. Regola il colore utilizzando le caselle e quindi fai clic su ok.

Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sul controllo della serie temporale, fai clic su Movie Maker e premi il pulsante di riproduzione per guardare il film. Per finire, aggiungi un nome file, la dimensione del fotogramma, la frequenza dei fotogrammi, una qualità uguale a uno e inserisci monoscopico. Quindi fare clic su Applica.

Infine, esporta il video. Le forze biomeccaniche, come lo stress da taglio emodinamico, sono intimamente coinvolte nella morfogenesi cardiaca. Qui, la microscopia a fluorescenza a foglio ottico è stata utilizzata per visualizzare le creste trabecolari che sporgono nel lume ventricolare a 75 ore dopo la fecondazione.

A 100 ore dalla fecondazione si può vedere chiaramente una rete trabecolare. In un embrione trattato con la microiniezione gata1aMO, l'emopoiesi e la viscosità sono ridotte del 90%. Questa diminuzione della viscosità ha attenuato lo stress di taglio emodinamico, con conseguente inizio ritardato e una rete trabecolare meno densa.

Questo ritardo e la densità della rete trabecolare sono stati recuperati regolando l'espressione genica correlata al notch, salvando la formazione trabecolare a 75 ore dopo la fecondazione e a 100 ore dopo la fecondazione. Pertanto, gli oligonucleotidi morfolino gata1a hanno ridotto le forze emodinamiche portando alla regolazione verso il basso della segnalazione notch, mentre l'mRNA Nrg1 recupera i geni correlati a notch regolati e ha riavviato la trabecolazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica di imaging può essere completata in circa due ore se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo cardiaco per studiare i fattori nel gene notch, che sono responsabili della corretta formazione della trabecolazione nel pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire immagini utilizzando la microscopia a illuminazione selettiva del piano e creare file di immagine 4D. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso.

E le precauzioni, come indossare occhiali adeguati, dovrebbero sempre essere prese durante questa procedura.