Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare gradienti adesivi e solubili per studiare la migrazione cellulare. Ciò si ottiene mediante la prima passivazione, una superficie per prevenire l'adesione di cellule aspecifiche. Il secondo passo è quello di fabbricare timbri dalla stampa a micro contatto.

Successivamente, la superficie decorata viene modellata con linee streptococciche mediante micro stampa a contatto. Il din può anche essere stampato come punti utilizzando la litografia a penna a immersione attaccata al fondo di un dispositivo microfluidico. La superficie modificata fungerà da base per un gradiente adesivo di biotina RGD.

Il passaggio finale consiste nel caricare le celle sulla superficie con il segnale adesivo in presenza di un gradiente chemio-attrattivo solubile. In definitiva, la microscopia su cellule vive viene utilizzata per mostrare la migrazione cellulare in risposta a segnali sia adesivi che solubili. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il saggio transwell o void chamber e una configurazione microfluidica convenzionale è che il sistema disintegrato del modello di superficie Il dispositivo microfluidico consente l'osservazione delle risposte delle cellule a segnali adesivi spazialmente controllati e al gradiente adesivo e a un gradiente solubile allo stesso tempo.

Bene, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della migrazione cellulare, come l'importanza dell'adesione cellulare e causare ictus tra i recettori della chemio Texas come il recettore visto chinasi G-proteina accoppiati recettori e recettori di adesione come RIN To ate glass cover slips. Per prima cosa, pulisci i vetrini di copertura immergendoli in una rastrelliera in etanolo al 100% e mettendo la rastrelliera in un bagnomaria per 30 minuti. Asciugare il coperchio in vetro scivola all'aria.

Successivamente, sonicare i vetri di copertura per 30 minuti in un molare di idrossido di sodio. Successivamente, sciacquare le superfici in vetro inclinando accuratamente la griglia in un bicchiere riempito con un litro e mezzo di acqua milli cube. Ripetere il processo di risciacquo tre volte utilizzando ogni volta acqua fresca milli cube.

Dopo il terzo risciacquo, asciugare, il coperchio in vetro, scivolare in forno a 60 gradi per circa mezz'ora. Posizionare metà dei vetrini di copertura puliti singolarmente in una camera umida costituita da una piastra a 24 pozzetti, parzialmente riempita d'acqua. I pozzetti vengono riempiti d'acqua e i vetrini coprioggetto vengono posati sopra i pozzetti per l'azione, viene utilizzato un copolimero di polilisina e polietilenglicole in cui il 20% delle molecole di peg sono innestate nella biotina.

Abbreviato in PLL Peg biotina goccia 15 microlitri di PLL Peg biotina in PBS su ogni vetrino coprioggetto. Prendi l'altra metà dei vetrini di vetro puliti rimanenti e inserisci con cura la soluzione PEG. Lasciare i vetrini coprioggetti per un'ora nella camera umida.

Dopo un'ora di scorrimento, il coperchio a sandwich scivola delicatamente l'uno dall'altro senza raschiare la superficie rivestita in PEG e sciacquarli con acqua UE. L'acqua dovrebbe scivolare via facilmente sul lato trattato con il piolo. Se necessario.

Asciugare all'aria le scivolate di copertura in vetro su un tovagliolo di carta con la superficie trattata rivolta verso l'alto riporlo. Il coperchio di vetro scivola sotto vuoto essiccato fino a nuovo utilizzo. Il master di silicio necessario per questa procedura viene fabbricato mediante fotolitografia per fondere il timbro A-P-D-M-S per l'elastomero PDMS sul Silicon Master all'interno di una capsula di Petri a circa un centimetro di altezza e polimerizzare la miscela master e PDMS in un forno a 70 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, il timbro PDMS viene rimosso dal master in silicone e tagliato a misura per stampare modelli proteici utilizzando la tecnica di stampa a micro contatto prima pulito e per rendere i timbri PDMS più idrofili trattando il lato del modello in un detergente UV e ozono per un'ora e mezza subito dopo il trattamento con ozono. E spalmare 10 microlitri di adin spellato sui timbri PDMS. Se le tracce devono essere visibili al microscopio a fluorescenza, utilizzare Aden spogliato che è coniugato a un fluoro quattro, come avid stripato e LOR tre 50.

Lasciare riposare per un'ora in una camera umida. Rimuovere l'eccesso di strep din dal timbro con un fazzoletto, carta e aria. Asciugare il timbro per circa un minuto.

Premere leggermente il timbro sul vetrino in vetro rivestito di biotina PLL peg. Se è stato utilizzato lo streptococco fluorescente, esaminare il modello al microscopio a epifluorescenza. I modelli proteici possono anche essere stampati utilizzando la litografia a penna a immersione.

Per prima cosa mescolare una parte di un milligrammo per millilitro, strippin o striped avidan elif tre 50 con 10 parti di glicerolo e caricare cinque microlitri della miscela sul cantilever. Regolare la velocità di stampa. Tempo di contatto del cantilever sulla superficie o una distanza verticale del cantilever dalla superficie per ridurre la dimensione dello spot.

Circa cinque micrometri iniziano il processo di stampa come descritto nel manuale operativo del negozio di strumenti per litografia a penna a immersione. Tutte le superfici stampate in un essiccato. Un dispositivo microfluidico disponibile in commercio viene utilizzato per creare gradienti di superficie.

Far aderire questi vetrini di copertura rivestiti di tritina o motivi sul lato adesivo del dispositivo per garantire che non vi siano perdite per diverse ore. Sigillare i bordi del dispositivo con il sottile strato di vaselina riscaldata e con un secondo strato di una miscela di una parte di vaselina e una parte di cera di paraffina. Riempi il canale del dispositivo con sei microlitri di PBS per creare due gradienti opposti.

Riempire i due serbatoi, uno con 70 microlitri di biotina, quattro di fluoresceina e l'altro con 70 microlitri di biotina coniugata al peptide biotinilato, arginina, glicina, acido spartico o RGD, incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per un'ora. Il risciacquo della biotina, dell'RGD e della biotina del dispositivo microfluidico è l'aspetto più difficile di questa procedura perché c'è il rischio di intrappolare le bolle d'aria e disturbare le tracce stampate a micro contatto. Per garantire il successo, la biotina e il PBS devono essere rimossi con attenzione e lentamente.

Rimuovere le soluzioni di biotina e sciacquare accuratamente la superficie due volte con PBS mentre è ancora attaccata al dispositivo microfluidico. Segnare la direzione del gradiente adesivo prima di caricare le cellule marcate in fluorescenza nel dispositivo microfluidico. Conta le cellule e dividile in due provette di uguale numero di cellule.

Lavare e risus. Sospendi una provetta di cellule con terreni contenenti l'attrattivo chemioterapico, come DMEM a basso contenuto di glucosio con lavaggio FBS al 10% e l'altra provetta di cellule in terreno. Senza l'attrattivo chemioterapico come il DMEM con lo 0% di FBS, la concentrazione finale di cellule in ciascuna provetta dovrebbe essere cinque volte 10 delle quinte cellule per millilitro.

Rimuovere tutte le soluzioni dal dispositivo microfluidico e posizionarlo sul microscopio preriscaldato. Carico dello stadio 70 microlitri di celle risospese in 0% F-B-S-D-M-E-M in un unico serbatoio. Caricare 70 microlitri di celle risospese in 10% F-B-S-D-M-E-M in un altro serbatoio.

Posizionare del nastro adesivo sui serbatoi per evitare l'evaporazione. Assicurarsi che il canale del dispositivo microfluidico si trovi nel campo visivo e che le cellule siano a fuoco. Selezionare i parametri di acquisizione delle immagini, come i tempi di esposizione e i filtri fluorescenti.

Sequenza di immagini di campo chiaro e fluorescenza che le celle e le tracce, nonché i punti temporali e la lunghezza di registrazione avviano il programma di acquisizione delle immagini. Questo video mostra un metodo per l'imaging di cellule vive di cellule che migrano in un ambiente con gradienti adesivi e solubili concorrenti. Le tracce adesive che contengono strippin fluorescente e RGD biotinilato sono state create con la stampa a micro contatto o la litografia a penna a immersione.

Il successo della stampa a micro contatto è indicato dal profilo lineare dell'intensità della fluorescenza attraverso le piste, dove è possibile distinguere chiaramente le tracce adesive e le regioni antivegetative. I punti stampati con la litografia a penna a immersione appaiono arrotondati, non a forma di lacrima, indicando un processo di stampa di successo. In questo esempio, i punti sono stati stampati in una linea con separazione di righe e colonne impostata su 10-15 micrometri.

Questa distanza è sufficiente per evitare che i punti si fondano l'uno nell'altro, ma consente la visualizzazione di più punti in un unico campo visivo. Con la maggior parte delle impostazioni del microscopio, con il semplice dispositivo microfluidico è stato creato un Grady di spunti adesivi sulla traccia stampata. Caricando la biotina quattro, la fluoresceina e la biotina RGD nei lati opposti di un pannello a camera microfluidica.

A mostra 60 immagini a mosaico scattate con una lunghezza totale dell'immagine di 3072 micrometri. Nel pannello B, l'intensità della fluorescenza è stata misurata per tutta la lunghezza dell'intero mosaico. Le linee di tendenza lineari sono state adattate all'intensità della fluorescenza per indicare il gradiente RGD nel canale.

Dopo aver rimosso la biotina, la soluzione di biotina RGD, la stessa camera può essere utilizzata per introdurre un gradiente solubile. Il pannello A mostra l'intensità fluorescente del colorante fluoresceina vicino al PBS e ai serbatoi riempiti di fluoresceina e attraverso il canale a T uguale a zero. Il pannello B mostra l'intensità fluorescente dei segnali solubili.

Dopo un'incubazione di 16 ore, i risultati comparabili indicano che il gradiente è rimasto stabile per almeno 16 ore. Con questo metodo è stata osservata una migrazione cellulare in una camera microfluidica con gradienti opposti e qui viene mostrato un filmato rappresentativo. Il gradiente adesivo è stato immobilizzato RGD su tracce di strep avidan e il gradiente solubile era da zero a 10% FBS.

Le immagini sono state scattate ogni 15 minuti per un totale di 20 ore. La transizione dell'immagine mostrata è di otto fotogrammi al secondo. Questo secondo filmato è di una singola cella elicotterica che migra verso la sorgente FBS.

La transizione dell'immagine mostrata è di otto fotogrammi al secondo. La linea blu che rappresenta la traiettoria cellulare è stata ottenuta tramite un software di tracciamento cellulare. Quest'ultimo grafico mostra le traiettorie cellulari dalle immagini del primo filmato.

Le traiettorie cellulari che sono migrate verso la più alta concentrazione di FPS solubile sono mostrate in nero. Queste traiettorie hanno mostrato che più cellule hela migravano verso la fonte del chemioattrattivo rispetto a concentrazioni più elevate di RGD aderente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di evitare l'evaporazione di PBS o di fluidi nel dispositivo microfluidico durante la preparazione del gradiente adesivo e l'imaging dello stile di vita, utilizzare del nastro adesivo se necessario per coprire tutti gli ingressi del dispositivo microfluidico Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la trasfezione e la microscopia in soluzione ibrida possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come la biomeccanica del citoscheletro che agisce per proteina, proteine di adesione focale e recettori durante la migrazione cellulare.