Name: Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Scopri come creare gradienti adesivi e solubili per studiare la migrazione cellulare con microscopia a fluorescenza. Questo metodo combina microcontact printing e microfluidica per analizzare le risposte cellulari a segnali di guida.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori riconoscono il finanziamento della Australian Research Council e National Health and Medical Research Council of Australia e anche ringraziare la Australian National impianto di produzione per il SU-8 master per la stampa microcontatto. SHN è sostenuta dal Ministero dell&#39;Istruzione Superiore e Malesia Universiti Sains Malaysia.

1. Passivazione di vetrini con PLL-PEG-biotina Questa fase ha lo scopo di passivazione della superficie in modo che le cellule aderiscono e migrare su regioni specifiche sul vetrino di vetro che vengono creati con la stampa microcontract (Fase 2-3a) o litografia dip penna (Step 3b). Per la passivazione, un co-polimero di poli-L-lisina (PLL) e polietilene glicole (PEG) viene utilizzato in cui il 20% delle molecole di PEG sono stati innestati biotina (PLL-PEG-biotina). <ol><li> Per la pulizia coprioggetto di vetro (18 mm x 18 mm), immergere in un rack in 100% di etanolo e la cremagliera in un bagno sonicating per 30 minuti. Asciugare i vetrini in aria o in corrente di azoto. </li><li> Successivamente, i vetrini sonicazione per 30 min in 1 M NaOH. Successivamente sciacquare le superfici in vetro con cautela immergendo il rack in un bicchiere pieno di 1.5 L Milli-Q H 2 O. Ripetere il processo di risciacquo tre volte utilizzando fresco Milli-Q H 2 O di volta in volta. Asciugare i vetrini inun forno a 60 ° C. </li><li> Mezzo posto del vetro pulito coprioggetti singolarmente in una camera umida, che è fatto di una piastra a 24 pozzetti parzialmente riempito con H 2 O. Goccia 15 ml di PLL biotina-PEG-(1 mg / ml) in PBS su ciascun vetrino coprioggetto. Prendere l&#39;altra metà dei restanti coprioggetto di vetro pulito e con attenzione a sandwich la soluzione PEG. Lasciare i vetrini per 1 ora nella camera umida. Far scorrere i coprioggetti sandwich delicatamente distanza l&#39;uno dall&#39;altro, senza raschiare il PEG superficie verniciata e sciacquarle con Milli-Q H 2 O. L&#39;acqua deve scorrere via facilmente sul lato PEG-trattati. Se necessario, asciugare i vetrini su carta assorbente con la superficie trattata rivolta verso l&#39;alto. Conservare i vetrini in un essiccatore sotto vuoto fino all&#39;uso successivo. </li></ol> 2. Fabbricazione di francobolli per la stampa microcontatto Descriviamo due processi alle tracce streptavidina modello sui vetrini passivati. Il primo, microfonorocontact stampa, tipicamente richiede la realizzazione di un master di silicio da cui viene colato un timbro PDMS. Nel nostro caso, il modello del timbro PDMS sono 100 um livello linee che sono distanziati 290 micron da centro a centro con un&#39;altezza caratteristica di 25 micron. Qui di seguito, si descrive brevemente come fabbricare un maestro adatto al silicio (Step 2,1-2,3) e timbro PDMS (Fase 2.4). Tuttavia, ci sono più protocolli per la stampa microcontatto descritti in letteratura 19-23, che sono adatti per la stampa su modelli proteici coprioggetto. Master può anche essere fatta su misura e acquistati da fonti commerciali. <ol><li> Prima, pulire il wafer di silicio (4 &quot;di diametro) incubando in soluzione Piranha (3:1 v: v di acido solforico e perossido di idrogeno al 30%). Per 20 min Sciacquare accuratamente il wafer 10 volte con MilliQ H 2 O. Essiccare il wafer in un forno a 150 ° CO / N. </li><li> Risciacquare il wafer di silicio pulita ed essiccata con il 100% di acetone, seguito da 100% di alcol isopropilico. Prossimospin-coat 2 ml di GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) sul wafer a 3.100 rpm per 40 secondi per creare un 25 spesso strato micron. Il campione viene quindi cotta su una piastra calda a 65 ° C per 5 minuti seguiti da un ulteriore 5 min a 95 ° C. </li><li> Esporre il SU-8 fotosensibile ai raggi UV per 60 secondi sotto un fotomaschera con il modello desiderato (ad esempio utilizzando un Quintel Q6000 maschera allineatore) e ripetere il processo di cottura descritto al punto 2.2. Allora il campione è sviluppato immergendo il wafer in SU-8 developer (Gersteltec Sarl) per 4 min, sciacquati in 100% alcool isopropilico ed essiccato sotto flusso di azoto. L&#39;area del SU-8 photoresist che non è stato esposto a luce UV viene quindi rimosso, creando il pattern inverso del timbro PDMS. </li><li> Il passo successivo è quello di lanciare un timbro PDMS dal master silicio. Primo, mescolare 1 parte (w / w) del catalizzatore con 10 parti di prepolimero elastomero (Sylgard 184). Per eliminare eventuali bolle d&#39;aria, la miscela degas in un essiccatore collegato a una linea di vuotoper 1 ora. Successivamente, versare l&#39;elastomero PDMS sul master silicio all&#39;interno una capsula di Petri a circa 1 cm di altezza e curare la miscela master e PDMS in un forno a 70 ° C per 1 ora. Infine, il timbro PDMS viene rimosso dal master silicio e tagliato a misura. </li></ol> 3. Patterning streptavidina o Cue adesivi sul coprioggetto di vetro passivato Dopo passivante vetrini, profili proteici sono stampate con stampa microcontact (3a Fase) o dip-pen litografia (Step 3b). Nel nostro caso, streptavidina viene stampato come linee, che costituiscono la base per gradienti RGD (Passaggio 4). La stessa procedura può essere utilizzata anche per la stampa di proteine ​​di matrice per creare modelli adesivi. Un metodo alternativo per la stampa microcontatto per il patterning di biomolecole su superfici è litografia dip penna. In litografia dip penna, un cantilever viene utilizzato per trasferire un piccolo volume di soluzione sulla superficie. Le dimensioni dei cantilever, viscosità della soluzione, il tempo di contatto del cantilever sulla superficie, idrofobicità della superficie e l&#39;umidità nella camera di stampa determina la dimensione delle caratteristiche stampati. Il vantaggio di questo metodo è che diversi modelli possono essere stampati per ogni esperimento, in quanto non vi è alcuna necessità di fabbricare maestri e timbri. Lo svantaggio è che ci vuole più tempo per stampare un dato modello e che litografia dip penna necessita di uno strumento specializzato che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori. La penna strumento tuffo litografia che abbiamo usato era l&#39;NanoeNabler da Bioforce nanoscienze. Qui, abbiamo stampato piccoli punti che erano &lt;10 micron di diametro, per il quale abbiamo usato SPT10 cantilever. 3a. Microcontact Stampa (μCP) Tecnica <ol><li> Per pulire e rendere il timbro PDMS più idrofila, trattare lato modellato dei francobolli PDMS in un UV e ozono (per esempio, Procleaner ozono UV Bioforce da Nanoscience) per 1,5 ore. In alternativa, utilizzare un plasmapulitore per un tempo più breve per lo stesso scopo. Questo processo crea una superficie ossidata PDMS 24, che migliora il processo di stampa. </li><li> Immediatamente dopo il trattamento con ozono o plasma, luogo e diffondere 10 microlitri di streptavidina (1 mg / ml in PBS) sui francobolli PDMS e lasciare per 1 ora in una camera umida (come parzialmente riempito piastra da 6 pozzetti, vedere il punto 1.3) . Se le tracce dovrebbero essere visibili al microscopio a fluorescenza, utilizzare streptavidina che è coniugato ad un fluorocromo come streptavidina-AlexaFluor350. </li><li> Rimuovere streptavidina in eccesso dal timbro con carta velina e asciugare all&#39;aria il timbro per circa 1 min. Premere leggermente il timbro sul PLL-PEG-biotina-rivestite coprioggetto di vetro. </li><li> Se streptavidina fluorescente è stata utilizzata in 3.a2 Passo, esaminare lo schema usando sotto un microscopio a epifluorescenza. Conservare le superfici stampate in un essiccatore. </li></ol> 3b. Dip Pen Litografia <ol><li> Primo, miscelare 1 parte di 1 mg / ml o streptavidina Streptavidin-AlexaFluor350 con 10 parti di glicerolo (v / v) e caricare 5 microlitri della miscela sulla cantilever. Poi inizia il processo di stampa come descritto nel manuale di istruzioni dello strumento litografia dip penna. Per ridurre la dimensione del punto di circa 5 micron, regolare la velocità di stampa, il tempo di contatto del cantilever sulla distanza o superficie verticale del cantilever alla superficie. Nell&#39;esempio illustrato in figura 2c, puntini sono stati stampati in una linea con riga e colonna di separazione impostato a 10-15 micron. Questa distanza è sufficiente per evitare punti di fusione in loro ma permette la visualizzazione di punti multipli in un unico campo di vista con impostazioni maggior microscopio. </li><li> Conservare le superfici stampate in un essiccatore. </li></ol> 4. Creazione di sfumature adesivo sul streptavidina-modello Superfici Creiamo gradienti adesive di biotina-RGD su vetrini rivestiti con streptavidina (Figura 3) o contain modelli streptavidina su vetrini passivato (Figura 5). Per creare un gradiente di superficie, è stato utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (chiamato sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) che crea un gradiente stabile soluzione per diffusione passiva. Competere per i siti di legame streptavidina, abbiamo impiegato due opposti gradienti di biotina-RGD e biotina che non era coniugato RGD (vedi Figura 1). <ol><li> Rispettare le streptavidina rivestite coprioggetto di vetro o con motivi sul lato adesivo del appiccicoso-Slide dispositivo chemiotassi 3D. Per garantire che non vi siano perdite per diverse ore, i bordi del dispositivo sono sigillate con un sottile strato di vaselina riscaldato e con un secondo strato di una miscela di 1 parte di vaselina 1 parte di paraffina (w / w). </li><li> Riempire il canale del dispositivo con 6 microlitri PBS nel canale. Quindi riempire i due serbatoi con 70 microlitri di 0,03 mg / pl biotina-4-fluoresceina in PBS e 70 &amp; mu; l di 0,03 mg / pl biotina-RGD in PBS, rispettivamente. Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per 1 ora. </li><li> Rimuovere la biotina soluzioni e risciacquare accuratamente la superficie mentre è ancora collegata al dispositivo microfluidico due volte con PBS. Segnare la direzione del gradiente adesivo e, se necessario, lasciare il dispositivo riempito con PBS a 4 ° C per ma assicurare che il dispositivo non si asciughi. Se necessario, analizzare il gradiente adesivo con un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Etichettatura di celle con fluorofori per l&#39;imaging cellulare in diretta Le cellule sono etichettati con coloranti fluorescenti che aiutano il monitoraggio delle cellule sotto il microscopio a fluorescenza. Sonde comuni sono marcatori fluorescenti organelli, come Syto 64 Rosso, che etichetta il nucleo cellulare. Per fare ciò, le cellule vengono prima lavati tre volte con PBS e poi incubate con 1 pM Syto 64 Rosso in terreni di coltura per 45 min ed infine lavato altre tre volte con PBS. Si prega di notare che le cellule non deve esseremantenuto in PBS per lunghi periodi di tempo. Coloranti alternativi per il monitoraggio delle cellule sono serie CellTracker che macchia il citoplasma e vengono mantenuti durante la migrazione e la divisione cellulare. Trasfezione di cellule con proteina di fusione fluorescente è particolarmente utile per registrare la distribuzione subcellulare di una proteina di interesse durante la migrazione. Tuttavia, proteine ​​fluorescenti tipicamente foto-bleach veloce di coloranti organici così che osservazioni a lungo termine può non essere possibile. 6. Caricamento di celle con una sfumatura solubile nel dispositivo microfluidica <ol><li> Contare fluorescente cellule marcate e divise in due provette di numero di cellule uguali. Lavare e risospendere un tubo di cellule con supporti contenenti il ​​fattore chemiotattico, come il basso glucosio Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 10% di siero bovino fetale (FBS). Lavare e risospendere l&#39;altro tubo di cellule nei media senza il chemiotattico, cioè DMEM con 0% FBS. La concentrazione finaledi cellule in ciascun tubo deve essere di 5 x 10 5 cellule / ml. </li><li> Rimuovere tutte le soluzioni dal dispositivo microfluidica (dal punto 4.3) e posizionarlo sul palco microscopio (vedi punto 7). Carico 70 microlitri di cellule (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 0% FBS) in un serbatoio e 70 microlitri di cellule HeLa (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 10% FBS) in un altro. Liberamente inserire un nastro sopra i serbatoi per evitare l&#39;evaporazione. Se le cellule sulla superficie sono pre-incubato prima imaging, è opportuno che le cellule vengono caricate nel dispositivo in terreni di coltura senza il gradiente. Il dispositivo viene quindi posto sul piatto microscopio e mezzi sostituito con gradiente supporti cioè DMEM senza FBS in un serbatoio e DMEM con 10% FBS nell&#39;altro. </li></ol> 7. Vivo imaging cellulare e analisi dei dati <ol><li> Accendere il microscopio (Nikon Ti-E) e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l&#39;esperimento. </li><li> Assicurarsi che il canale del micrDispositivo ofluidic è nel campo di vista e cellule sono a fuoco. Selezionare il parametro di acquisizione immagine, come i tempi di esposizione e filtri fluorescenti, sequenza di immagini del campo chiaro e fluorescenza in grado di catturare le cellule e le tracce così come i punti di tempo e la durata di registrazione (ad esempio ogni 15 minuti per 16 ore). </li><li> Analizzare i dati con i software appropriati quali ImageJ Allineamento manuale o Ibidi chemiotassi e strumento di migrazione. </li></ol>

<ol><li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+BioChem%22%5BJournal%5D)">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sensing+through+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li>
<li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cells+make+decisions%3A+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).</li>
<li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li>
<li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+%28GPCR%29-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271(2007).</li>
<li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients%3A+role+of+intracellular+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li>
<li>Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.ibidi.com/service/faq.html">http://www.ibidi.com/service/faq.html</a> (2010).</li>
<li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li>
<li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+micropatterns+for+cells%3A+a+microcontact+printing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).</li>
<li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li>
<li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin%2C+VEGF%2C+or+Both+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leukocyte+response+to+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li>
<li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li>
<li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing%3A+Limitations+and+Achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+dip-pen+nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithography+and+nanochemistry%3A+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li>
<li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li>
<li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li>
</ol>

Noi non abbiamo interessi commerciali da dichiarare.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) per studiare gli effetti delle superfici chimicamente modificati e le sfumature chemoattractant sulla migrazione delle cellule. Questa configurazione microfluidica non richiede un flusso perché il gradiente è stabilito per diffusione lungo la lunghezza del canale. Questo è importante perché il flusso differenziale potrebbe influenzare le cellule migrano lentamente come i fibroblas...

Migrazione cellulare Regia è una proprietà fondamentale di molte cellule ed è un aspetto fondamentale di molti processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la difesa contro le infezioni e guarigione della ferita. Inoltre, la migrazione cellulare gioca anche un ruolo importante in molte malattie quali malattia vascolare, cellule tumorali e metastasi 1,2 infiammazione cronica. Mentre gli stati classici della migrazione cellulare - polarizzazione, estensione protrusione, la formazione di adesione, la generazione di forza e retrazione posteriore - sono generalmente accettate 3,4, la delucidazione dei meccanismi spazio-temporali da cui esso è coordinato integrazione del segnale è stato più impegnativo. La matrice extracellulare (ECM) serve come substrato per l&#39;adesione cellulare, e attraverso chimica e fisica inerente 5 6 diversità, fornisce indicazioni direzionali per cella 7,8 navigazione. In aggiunta a questi segnali adesive 9, fattori solubili 10-12 &lt;/ Sup&gt;, come chemochine e fattori di crescita in grado di indurre la migrazione delle cellule attraverso i recettori chemiotattico diretto e la loro segnalazione a valle motogenic. Attualmente, non è noto se l&#39;impegno e segnalamento attraverso recettori di adesione integrine (cioè) o recettori chemoattraente, come recettore tirosina chinasi (RTK), sono dominanti. Non è neppure noto se gerarchie di sistemi recettoriali sono tipo specifico delle cellule. Microscopia di cellule in diretta dà una ricchezza di informazioni che non è accessibile nei test di massa e può essere combinato con dispositivi microfluidici per generare gradienti immobilizzati di spunti 13,14 e solubile 15 16. Il metodo qui descritto utilizza una serie di semplici passaggi e consolidata per modificazione superficiale in combinazione con una camera disponibile in commercio microfluidica per creare un saggio di imaging per la migrazione cellulare che può essere facilmente implementato in un laboratorio di biologia cellulare (Figura 1). L&#39;assemblatodispositivo a microfluidi ha qualità ottiche che sono paragonabili al vetro 17 e il gradiente di molecole diffusibili sono stabili per almeno 16 ore. Il sistema può essere utilizzato per tecniche epifluorescenza e avanzate. A differenza di altre configurazioni chemiotassi 18, questo sistema è adatto per la registrazione lenta migrazione, cellule aderenti. Importante, il sistema è modulare e permette facilmente l&#39;introduzione di adesivo alternativa o segnali migrazione solubili e l&#39;esame di vari tipi cellulari.

<table><tbody><tr><td>Corredi per la colorazione del vetro di copertura</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542 E40</td><td>Portavetrini</td></tr><tr><td>Raccoglitore</td><td></td> per<td>forno</td><td>Serie ED 53</td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>Silicon Quest</td><td>708-007</td><td>Boro drogato < 100> wafer, diametro 4", 500 &mu; m,</td></tr><tr><td>fotoresist GM1070 SU-8</td> lucidato su un lato <td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 sviluppatore</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 agente indurente</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 prepolimero elastomerico</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-biotina (20%)</td><td>SuSos AG</td><td>PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)/PEG(3,4)-biotina (20%)</td><td>1 mg/ ml in PBS</td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>46955</td><td>1 mM in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidina-AlexaFluor350</td><td>Invitrogen</td><td>S-11249</td><td>1 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Biotina-4-fluoresceina</td><td>Invitrogen</td><td>B-1370</td><td>0,03 &mu; g/&mu; l in PBS</td></tr><tr><td>Biotin-RGD</td><td>GenScript</td><td>SC1208</td><td>0,03 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Syto 64 Red</td><td>Invitrogen</td><td>S-11346</td><td>1 &mu; M in PBS</td></tr><tr><td>Chemiotassi a vetrino adesivo 3D</td><td>Ibidi</td><td>80328</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Greiner punta smussata gialla</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739261</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina, mp 55-57 &deg; C</td><td>Sigma</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Nano eNabler 10 &mu; m cantilever </td><td>BioForce</td><td>SPT-S-C-10s</td><td></td></tr><tr><td>Immagine J software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>Manual Tracking plugin</td><td>Fabrice Cordeli&#232; res</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td></tr><tr><td>Strumento di chemiotassi e migrazione</td><td>Ibidi GmbH</td><td></td><td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td></tr></tbody></table>

creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cellule possono percepire e migrare verso concentrazioni più elevate di stimoli adesive come le glicoproteine ​​della matrice extracellulare e spunti solubili come fattori di crescita. Qui, descriviamo un metodo per creare gradienti opposti di segnali adesivi e solubile in una camera microfluidica, che è compatibile con imaging cellulare vivo. Un copolimero di poli-L-lisina e polietilene glicole (PEG-PLL) è impiegato per passivare coprioggetto e prevenire adsorbimento non specifico di biomolecole e cellule. Successivamente, la stampa microcontatto o litografia dip penna sono utilizzati per creare percorsi di streptavidina sulle superfici passivati ​​per servire come punti di ancoraggio per il peptide biotinilato arginina-glicina-acido aspartico (RGD) come cue adesivo. Un dispositivo microfluidico è disposto sulla superficie modificata e utilizzata per creare il gradiente di segnali adesivi (100% allo 0% RGD RGD) sulle tracce streptavidina. Infine, lo stesso dispositivo microfluidico è usato per creare un gradiente di suc chemoattractanth come siero bovino fetale (FBS), come cue solubile in direzione opposta del gradiente di segnali adesivi.

Per capire come integrare i segnali di cellule migratorie 25, abbiamo sviluppato un metodo per celle di immagine con microscopia a fluorescenza che migrano in un ambiente con concorrenti gradienti adesivi e solubili (Figura 1). Tracce adesive che contenevano streptavidina fluorescente e RGD biotinilato sono stati creati con le tracce microcontatto stampati e litografia dip penna (Figura 2). Stampa microcontact successo è indicato dalla linea profilo dell&#39;intensità di fluo...

Un metodo per l&#39;assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L&#39;ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l&#39;importanza relativa di spunti di orientamento.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare gradienti adesivi e solubili per studiare la migrazione cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto passivando una superficie per prevenire l'adesione cellulare non specifica. Il secondo passaggio consiste nella fabbricazione di stampi mediante microstampa a contatto.Successivamente, la superficie attivata viene stampata con linee di streptavidina mediante microcontatto. La streptavidina può anche essere stampata sotto forma di punti utilizzando la litografia con penna a immersione, collegata alla parte inferiore di un dispositivo microfluidico. La superficie modificata fungerà da base per un gradiente adesivo di biotina RGD.L'ultimo passaggio consiste nel caricare le cellule sulla superficie con il segnale adesivo in presenza di un gradiente solubile di chemiotattante. Infine, la microscopia a cellule vive viene utilizzata per mostrare la migrazione cellulare in risposta a segnali adesivi e solubili. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio in transwell o in camera vuota e una configurazione microfluidica convenzionale, è che il sistema disintegrato di dispositivi microfluidici con pa

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Combinando approcci di trapianto cellulare, marcatura citoscheletrica e perdita/guadagno di funzione, questo protocollo descrive come la piastra precordale prospettica del pesce zebra in migrazione possa essere utilizzata per analizzare la funzione di un gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica.

Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

Il controllo dei gradienti chimici e di ossigeno è essenziale per le colture cellulari. Questo articolo riporta un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato (PDMS-PC) in grado di generare in modo affidabile combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno per studi di migrazione cellulare, che può essere praticamente utilizzato nei laboratori biologici senza strumentazione sofisticata.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia a contrasto temporale e a contrasto di fase per immagini di macrofagi peritoneici residenti nel gradiente C5a di complemento chemiotattico. I protocolli possono essere estesi ad altre cellule immunitarie.

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

Qui viene presentato un protocollo per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare 3D all'interno e all'interno dell'interfaccia di idrogel granulari.

Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Scopri come creare gradienti adesivi e solubili per studiare la migrazione cellulare con microscopia a fluorescenza. Questo metodo combina microcontact printing e microfluidica per analizzare le risposte cellulari a segnali di guida.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Esplora altri video