Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'mRNA, come ad esempio, se il bersaglio dell'mRNA previsto in silico può interagire direttamente con un particolare microRNA cellulare. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza imitatori biotinilati per abbattere l'mRNA bersaglio. E questi imitatori biotinilati hanno acidi nucleici bloccati o una chimica mimica basata sull'LNA che aiuta nella formazione di oligonucleotidi molto stabili con un'affinità molto elevata che può migliorare la specificità della reazione.

Le implicazioni di questa metodologia sono che può passare dalla comprensione della biologia del microRNA a terapie basate su microRNA. Ciò è dovuto principalmente al fatto che sappiamo tutti che i microRNA svolgono un ruolo fondamentale in ogni aspetto della biologia cellulare. Quindi, identificando i bersagli dei microRNA, che sono gli mRNA, possiamo certamente fornire conoscenze critiche che sarebbero importanti per la scoperta e la terapia.

A dimostrare il protocollo sarà Sabyasachi Dash, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per rivestire le perle magnetiche con streptavidina, per prima cosa, agitare accuratamente le perle per risospenderle. Quindi, trasferire 30 microlitri di perle risospese in un tubo per microfughe privo di nucleasi da due millimetri.

Lasciare il tubo riempito con la sospensione della perlina magnetica sul magnete per due minuti. Dopo due minuti, rimuovere il surnatante con l'aiuto di una micropipetta quando le perle vengono tirate sul lato del tubo a contatto con il magnete. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio alle perline.

Dopo aver aggiunto il tampone di lavaggio, rimuovere il tubo dal magnete. Quindi, agitare le perline per 15 secondi per lavarle. Quindi, trasferisci il tubo contenente le perle magnetiche sul magnete per due minuti.

Al termine dell'incubazione, estrarre il surnatante e gettarlo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione liberante di RNasi alle perle. Agitare le perle per 15 secondi per mescolare la soluzione di RNasi.

Quindi, incubare le perle a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti di incubazione, trasferire la provetta contenente le perle magnetiche sul magnete per due minuti. Dopo l'incubazione, estrarre il surnatante e gettarlo.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di risospensione alle perle e agitare per 15 secondi. Dopo il vortex, incubare la provetta a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, trasferire il tubo con le perline magnetiche sul magnete per due minuti.

Dopo due minuti, versare il surnatante ed eliminarlo. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante alle perline. Per risospendere le perle nella soluzione bloccante, agitarla accuratamente a temperatura ambiente per 15 secondi.

Quindi, lasciare il tubo su un rotatore multitubo a quattro gradi Celsius per 16 ore. Per preparare il lisato, utilizzare un raschietto cellulare e raschiare le cellule HEK293T trasfettate sotto la cappa laminare. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo microfuge da due millilitri.

Successivamente, sottoporre la sospensione cellulare a centrifugazione a 1.500 g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, sciogliere il pellet cellulare in soluzione salina tamponata con fosfato 1x mantenuta a pH 7,2. Ripetere il processo di centrifugazione, per ottenere un pellet residuo privo di fluido.

Al termine della centrifugazione, trasferire rapidamente il pellet sul ghiaccio. Quindi, preparare un nuovo tampone di lisi cellulare. Dopo aver preparato il tampone, aggiungere 260 microlitri di tampone di lisi cellulare completa al campione nella provetta per microfuge.

Pipet il pellet della cella più volte per una sospensione omogenea. Per lisare le cellule, incubare le provette a 80 gradi Celsius per 10-15 minuti. Quindi, lasciare le celle sul ghiaccio.

Ripetere il processo di centrifugazione a 16.000 g per cinque minuti in una centrifuga da banco a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante contenente lisato in una provetta sterile da 1,7 millilitri per microfuge su ghiaccio ed espellere il pellet. Al surnatante, aggiungere cinque molari di cloruro di sodio per ottenere una concentrazione finale di un molare.

Per prima cosa, preparare il tampone di lavaggio a scomparsa. Dopo l'incubazione notturna dopo il blocco delle microsfere, trasferire il tubo contenente le perle magnetiche sul magnete per due minuti. Scartare il surnatante dopo il periodo di incubazione.

Alle perline, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a strappo ghiacciato. Quindi, agitare le perle a temperatura ambiente per 15 secondi. E incubare immediatamente a temperatura ambiente per 30-60 secondi.

Dopo un minuto, trasferire il tubo contenente le perle magnetiche sul magnete per due minuti. Scartare il surnatante dopo il periodo di incubazione. Quindi, risospendere le perle in 300 microlitri di tampone di lavaggio pull-down completo.

Dopo aver aggiunto il cloruro di sodio, trasferire 300 microlitri di lisato cellulare in una provetta per microfuge riempita con 300 microlitri di perline. Quindi, lasciare il composto sul mixer nutante per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, trasferire il tubo sul magnete per cinque minuti.

Scartare il surnatante dopo il periodo di incubazione. Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio completo a strappo ghiacciato alle perline. Dopo aver aggiunto il tampone, agitare le perle per 15 secondi a temperatura ambiente.

Quindi, posiziona il tubo sul magnete per cinque minuti. Scartare il surnatante dopo il periodo di incubazione. Quindi, sciogliere le perle in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi e conservarle in ghiaccio.

Isolare l'RNA totale dalle perline. Quindi, sciogliere l'RNA isolato in 25 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi, misurare la concentrazione di RNA nello spettrofotometro.

Infine, preparare la soluzione madre di RNA a 50 nanogrammi per microlitro. Successivamente, utilizzare 50 nanogrammi dell'RNA isolato totale per sintetizzare il DNA complementare seguendo le istruzioni del produttore. Quindi, aggiungere i primer oligo fino a un volume finale di 20 microlitri.

Posizionare la provetta per PCR sul termociclatore e iniziare la corsa. Al termine della qPCR, trasferire nove microlitri della miscela di reazione PCR in ciascun pozzetto della piastra. A ciascun pozzetto, aggiungere un microlitro di DNA complementare per ottenere un volume finale di 10 microlitri.

Quindi, utilizzare un sigillante per piastre PCR resistente al calore per sigillare la piastra PCR e caricare sul termociclatore. Quindi, avviare il programma sul termociclatore. Al fine di convalidare i bersagli di miR-125b, vengono studiati i livelli di espressione degli mRNA bersaglio di PARP-1 e p53.

È interessante notare che i livelli di espressione degli mRNA di PARP-1 e p53 sono relativamente più alti rispetto all'mRNA dell'actina, che è il controllo negativo. Altri controlli negativi utilizzati nell'esperimento sono l'assenza di un modello e tre sequenze strapazzate biotinilate di prima qualità. Inoltre, le tre prime regioni non tradotte di PARP-1 e p53 quantificate, mostrano anche diversi livelli di amplificazione.

Questo è in confronto ai controlli negativi, come l'actina, l'assenza di stampo e tre sequenze strapazzate biotinilate primarie. Questa amplificazione di PARP-1 e p53 indica che questi sono forti bersagli del miR-125b cellulare. Una volta padroneggiata, questa tecnica inizia con la placcatura delle cellule, fino alla trasfezione dei mimici dell'LNA marcati con biotina e si conclude con l'analisi PCR può essere eseguita entro una settimana, se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come convalidare i presunti bersagli dell'mRNA nelle cellule di mammifero. Ciò può essere ottenuto con un rapporto tra elevata specificità e basso rumore introducendo le tre principali trasfezioni basate su imitazioni dell'acido nucleico bloccato marcate con biotina nelle cellule di mammifero. Non dimenticare che lavorare con l'RNA, in particolare con l'RNA piccolo, come i micro RNA, può essere altamente sensibile e soggetto a degradazione.

Pertanto, è necessario prendere le precauzioni necessarie durante l'esecuzione di questo test, come l'uso di acqua priva di nucleasi, provette per microfusi prive di nucleasi e tamponi sterili, e tamponi e reagenti appena preparati devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione di questo test per ottenere una migliore sensibilità e risultati migliori.