Name: Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri il metodo di pulldown con biotina per validare i target mRNA dei microRNA cellulari utilizzando mimici LNA biotinilati. Questa tecnica offre elevata specificità e stabilità per la cattura e quantificazione degli mRNA target.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (a C.D.). Il lavoro è stato anche sostenuto dal RCMI Grant G12MD007586, i Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, centro di ricerca traduzione Meharry (MeTRC) CTSA concedere (U54 RR026140 da NCRR/NIH, il Grant MD007593 U54 da NIMHD/NIH e il Tennessee Center per AIDS Ricerca (P30 AI110527).

1. la transfezione di 3'-biotinylated miRNA
Nota: Eseguire la procedura seguente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile.
<ol><li>Cellule di seme 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T per pozzetto in 2 mL di completano per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) [DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x antibiotico penna-strep]. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, controllare la salute e l'aderenza delle cellule placcati sotto un microscopio chiaro. Nota: Assicurarsi che le cellule hanno aderito e raggiunto morfologia appropriata prima di procedere al passaggio successivo. Le cellule HEK 293T sono in genere pronte per la transfezione 18 – 24 h post placcatura.</li>
	<li>In un tubo di microfuge sterile 1,7 mL, diluire 75 picomoli di biotinylated miRNA a 200 µ l di media minimi essenziali. Trasferire questo mix un altro 1,7 mL microfuge tubo contenente liposoma base reagente di transfezione (8 µ l/pozzetto) diluito in 200 µ l di media minimi essenziali. Mescolare accuratamente, ma delicatamente, pipettando e incubare per 20 – 25 min a temperatura ambiente per permettere la formazione dei complessi transfezione.</li>
	<li>Rimuovere i vecchi media dalla piastra di coltura ben 6 pipettando delicato e riempire ogni pozzetto con 1.6 mL di DMEM completa preparata al momento (senza 1 x antibiotici penna-strep).</li>
	<li>Aggiungere i complessi di transfezione (da 1,3) drop-wise per le cellule della piastra 6 pozzetti usando una pipetta ben calibrata. Agitare delicatamente la piastra mentre aggiungendo i complessi per assicurare la loro distribuzione uniforme su tutta la piastra. Nota: Questo passaggio è molto critico per il raggiungimento di alta efficienza trasfezione e deve essere eseguito con cura e pazienza.</li>
	<li>Coltura le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per almeno 36 h.</li>
</ol>2. preparazione di streptavidina rivestito biglie magnetiche — io
<ol><li>Risospendere accuratamente i branelli magnetici streptavidina nel Vortex. Trasferire 30 µ l di sospensione di tallone (per campione) in una provetta di microfuge privo di nucleasi di 2 mL.</li>
	<li>Collocare la provetta contenente la sospensione di perlina allo stand di separatore di biglie magnetiche ("magnete" qui di seguito) per 2 min. Dopo aver verificato che le perle siano portate a lato del tubo a contatto con il magnete, rimuovere con cautela il surnatante mediante una micropipetta.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di lavaggio della perla (10 mM Tris-Cl a pH 7.5, 0,5 mM EDTA, NaCl di 1m) ai talloni. Rimuovere il tubo dal magnete. Vortex per 15 s a temperatura ambiente per lavare le perle.</li>
	<li>Collocare la provetta contenente microsfere sul magnete per 2 min e attentamente rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.3 e 2.4 per un totale di tre lavaggi. Dopo la fase di lavaggio finale, togliere il tubo dal magnete.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di RNAsi liberando soluzione (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) ai talloni, mescolare bene su vortex per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il tubo contenente microsfere sul magnete per 2 min e attentamente rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.6 per un totale di tre volte.</li>
	<li>Aggiungere perlina risospensione soluzione (0,5 M NaCl) ai talloni, vortice 15 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min posto le perle di sedimento sul magnete per 2 min e rimuovere con cautela il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l del tallone (1 µ g / µ l BSA, tRNA del lievito di 2 µ g / µ l) di soluzione bloccante ai talloni. Mix dolce nel Vortex per 15 s a temperatura ambiente. Incubare a 4 ° C per 16 ore (durante la notte) in un rotatore di multi-tubo.</li>
</ol>3. preparazione dei lisati cellulari
<ol><li>Raccogliere le cellule HEK 293T trasfettate da dolce raschiare con una spatola sterile cella all'interno della cappa laminare, quindi trasferire ciascun campione in una provetta di microfuge sterile mL 2.</li>
	<li>Agglomerare le cellule raschiate per centrifugazione a 1.500 x g per 5 min. Risospendere il pellet in 1X PBS sterile (fosfato tampone salino), pH 7,2. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 5 min ottenere un pellet gratuito dei media residua. Immediatamente immergersi nella provetta contenente il pellet in ghiaccio.</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi di cellule fresche completo (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, inibitore della proteasi: 1x). Nota: Uno stock di tampone di lisi delle cellule manca IGEPAL, Superase e proteasi inibitore cocktail può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente. Preparare un lotto fresco di tampone di lisi della cellula completa aggiungendo i supplementi di cui sopra alle concentrazioni finali consigliate nel buffer di lisi delle cellule stock e riporlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 260 µ l di tampone di lisi ghiacciata cella completa per ogni campione nel tubo microfuge (cioè, ogni tubo microfuge contiene cellule raccolte da un pozzetto della piastra 6 pozzetti) e risospendere il pellet cellulare in una sospensione omogenea di pipettaggio.</li>
	<li>Lisare le cellule utilizzando il metodo di congelamento-scongelamento: incubare le provette a-80 ° C per 10 – 15 min. Quindi, permettono alle cellule di scongelare su ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare la cella risultante lisata a 16.000 x g per 5 min in una centrifuga da banco refrigerato a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il lysate delle cellule liquidati in una provetta di microfuge sterile 1,7 mL sul ghiaccio. Scartare il pellet. Nota: Il volume finale di cancellato lisato dovrebbe essere ~ 240-250 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 5 M NaCl per lo sgomberati lisato ad una concentrazione finale di 1M e mantenere i campioni su ghiaccio.</li>
</ol>4. preparazione di biglie magnetiche streptavidina — II
<ol><li>Preparare il tampone di lavaggio di discesa completa fresco (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1m NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase e 1 x cocktail di inibitore della proteasi) Nota: Uno stock di tampone di lavaggio di discesa manca IGEPAL, Superase e proteasi inibitore cocktail può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente. Preparare un lotto fresco di tampone di lisi della cellula completa aggiungendo i supplementi di cui sopra alle concentrazioni finali consigliate nel buffer di lisi delle cellule stock e riporlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Posizionare la provetta contenente il preparato Perline (dal punto 2.9) sul magnete per 2 min attentamente rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l di tampone di lavaggio completo a discesa ghiacciata ai talloni. Vortex per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 30-60 s. posto i tubi sul magnete per 2 min con attenzione rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.3 per un totale di 3 volte.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 300 µ l di tampone di lavaggio completo menu a tendina.</li>
</ol>5. pull-down di Target mRNA-miRNA complessi
<ol><li>Trasferire 300 µ l della cella lysata (dal punto 3.8) nella provetta di microfuge contenente 300 µ l di perline (dal punto 4.5).</li>
	<li>Incubare la miscela su un mixer nutante per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posto il tubo sul magnete per 5 min, attentamente rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ l di tampone di lavaggio completo a discesa ghiacciata ai talloni. Vortex per 15 s a temperatura ambiente e posto il tubo sul magnete per 5 min, attentamente rimuovere e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere il punto 5.4 altre due volte.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 100 µ l di acqua priva di nucleasi e incubare in ghiaccio.</li>
</ol>6. totale estrazione del RNA, sintesi del cDNA e qPCR
<ol><li>Estrarre RNA totale dalle perle sedimento (dal punto 5.6) utilizzando un metodo appropriato (Vedi Tabella materiali). Risospendere il RNA totale estratto in 25 µ l di acqua priva di nucleasi. Determinare la concentrazione di RNA e la qualità utilizzando uno spettrofotometro (assorbanza a 260/280). Preparare un brodo di lavoro di RNA a 50 ng / µ l.</li>
	<li>Eseguire la sintesi del cDNA, in triplici copie, utilizzando 50 ng di RNA totale (dal punto 6.1) utilizzando una sintesi di cDNA appropriato kit (Vedi Tabella materiali) utilizzando oligo dT primer in un volume finale di 20 µ l (tabella 1). Quindi, provette per PCR carico nello strumento qPCR per eseguire cicli termici secondo le condizioni descritte nella tabella 2.</li>
	<li>
Eseguire qPCR sul CDNA (dal punto 6.2) utilizzando chimica SYBR Green (Vedi tabella materiali):
	<ol>
<li>Eseguire tutte le reazioni di qPCR in triplici copie in un piatto fondo ben chiaro 96 in condizioni sterili.</li>
		<li>Aliquotare 9 µ l della miscela di reazione dal qPCR master mix (Vedi tabella 3) in ciascun pozzetto della piastra. Quindi, aggiungere 1 µ l di cDNA in ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 10 µ l. sigillare la piastra per PCR usando foglio sigillante resistente al calore PCR e caricare nello strumento qPCR</li>
		<li>Eseguire cicli termici secondo le condizioni designate nella tabella 4.</li>
		<li>Normalizzare i livelli di espressione (valori Ct) di ciascun campione per i livelli di espressione del controllo uova strapazzato. Utilizzare questi valori per calcolare piega cambiamenti nell'espressione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+silence+gene+expression+by+repressing+protein+expression+and%2For+by+promoting+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harborsymposia+on+quantitative+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay.</a> Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).</li>
<li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome research. 14, 1902-1910 (2004).</li>
<li>Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+microRNAs+from+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">New microRNAs from mouse and human.</a> RNA. 9, 175-179 (2003).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+maturation%3A+Stepwise+processing+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization.</a> The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131, 1097-1108 (2007).</li>
<li>Perron, M. P., Provost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions+and+complexes+in+human+microRNA+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience%3A+A+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function.</a> Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75, 843-854 (1993).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+requirements+for+let-7+function+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo.</a> Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).</li>
<li>Lee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+class+of+microRNA+targets+containing+simultaneous+5%27-UTR+and+3%27-UTR+interaction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites.</a> Genome research. 19, 1175-1183 (2009).</li>
<li>Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-mediated+gene+silencing+by+translational+repression+followed+by+mRNA+deadenylation+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay.</a> Science. 336, 237-240 (2012).</li>
<li>Iwakawa, H. O., Tomari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Functions+of+MicroRNAs%3A+mRNA+Decay+and+Translational+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression.</a> Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).</li>
<li>Wilczynska, A., Bushell, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25190144">The complexity of miRNA-mediated repression.</a> Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).</li>
<li>Selbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li>
<li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li>
<li>Sayed, D., Abdellatif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologicalreviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in development and disease.</a> Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).</li>
<li>Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+giants+of+gene+regulation%3A+Experimental+strategies+for+microRNA+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews.+Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).</li>
<li>Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+microRNA+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Computational methods for microRNA target prediction.</a> Methods in enzymology. , 65-86 (2007).</li>
<li>Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mammalian+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prediction of mammalian microRNA targets.</a> Cell. 115, 787-798 (2003).</li>
<li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+microRNA+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for microRNA target identification.</a> Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).</li>
<li>Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+sponges%3A+Competitive+inhibitors+of+small+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells.</a> Nature. 4, 721-726 (2007).</li>
<li>Elmen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+microRNA-122+in+mice+by+systemically+administered+LNA-antimiR+leads+to+up-regulation+of+a+large+set+of+predicted+target+mRNAs+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver.</a> Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Jin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+microRNA+mimics+should+be+used+with+caution%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiersin+genetics%22%5BJournal%5D)">Transfection of microRNA mimics should be used with caution.</a> Frontiersin genetics. 6, 340(2015).</li>
<li>Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+microRNA+targets+from+isolated+argonaute+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes.</a> RNA biology. 4, 76-84 (2007).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460, 479-486 (2009).</li>
<li>Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+microRNA+targets+by+miRNP+immunopurification%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification.</a> RNA. 13, 1198-1204 (2007).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141, 129-141 (2010).</li>
<li>Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+microRNA+targets+using+an+RNA-induced+silencing+complex+%28RISC%29-trap+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+theNational+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach.</a> Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).</li>
<li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis%3A+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li>
<li>Meister, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Argonaute2+mediates+RNA+cleavage+targeted+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular cell. 15, 185-197 (2004).</li>
<li>Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+overlapping+functions+for+mammalian+Argonautes+in+microRNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing.</a> Genes & development. 23, 304-317 (2009).</li>
<li>Wani, S., Cloonan, N. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2014/05/22/005439">Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Grunweller, A., Hartmann, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+oligonucleotides%3A+The+next+generation+of+antisense+agents%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%3A+clinical+immunotherapeutics%2Cbiopharmaceuticals+and+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?</a> BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).</li>
<li>Guerard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+Based+single-stranded+oligonucleotides+are+not+genotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+molecular+mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic.</a> Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).</li>
<li>Song, R., Ro, S., Yan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+detection+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+inmolecular+biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization detection of microRNAs.</a> Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).</li>
<li>Edbauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+structure+and+function+by+FMRP-associated+microRNAs+miR-125b+and+miR-132%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132.</a> Neuron. 65, 373-384 (2010).</li>
<li>Le, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-125b+promotes+neuronal+differentiation+in+human+cells+by+repressing+multiple+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets.</a> Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).</li>
<li>Dash, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ADP-Ribose%29+Polymerase-1+%28PARP-1%29+induction+by+cocaine+is+post-transcriptionally+regulated+by+miR-125b%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Micheli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+proapoptotic+proteins+Bak1+and+p53+by+miR-125b+in+an+experimental+model+of+Alzheimer%27s+disease%3A+Protective+role+of+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol.</a> Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).</li>
<li>Orom, U. A., Lund, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+microRNA+targets+using+biotinylated+synthetic+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs.</a> Methods. 43, 162-165 (2007).</li>
<li>Cloonan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-thinking+miRNA-mRNA+interactions%3A+Intertwining+issues+confound+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery.</a> BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).</li>
<li>Guo, Y. E., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-Biotin-tagged+microRNA-27+does+not+associate+with+Argonaute+proteins+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells.</a> RNA. 20, 985-988 (2014).</li>
<li>Mook, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+and+off-target+effects+of+locked+nucleic+acid+%28LNA%29+and+unlocked+nucleic+acid+%28UNA%29+modified+siRNA+and+small+internally+segmented+interfering+RNA+%28sisiRNA%29+in+mice+bearing+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+DNA%2C+PNA+%26+XNA%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts.</a> Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).</li>
<li>Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+mismatch+discrimination+of+locked+nucleic+acid-DNA+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes.</a> Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari e non finanziari.

Identificazione di mRNA target dei miRNA cellulari è importante per capire la loro funzione regolatrice. Diversi strumenti computazionali sono impiegati per prevedere obiettivi basati sulla complementarietà di sequenza di sementi e sulla conservazione di sequenze bersaglio19,20. Anche se questi strumenti sono utili, possono generare elevati livelli di falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, queste previsioni sono accoppiate con metodi sperimentali quali ...

I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA che regolano negativamente l' espressione di proteina1non codificanti. Precursori di miRNA risiedono in cluster attraverso molte regioni del genoma, più frequentemente all'interno delle regioni intergeniche e introni di proteina-codificazione geni2,3. Biogenesi dei miRNA coinvolgono trascrizione dei pri-miRNA da miRNA-codifica geni4. I pri-miRNA sono sottoposti a elaborazione sequenziale, prima nel nucleo e nel citoplasma per generare singolo incagliato Mirna maturi4,5. Successivamente, i miRNA maturi sono incorporati il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC): una proteina-RNA multimerica complessa che include un membro della famiglia di proteine per destinazione riconoscimento4,5, Argonaute 6,7. Mirna maturi nel complesso RISC prevalentemente associare al 3' UTR di destinazione mRNAs8,9,10 ma anche possono associare occasionalmente nella codificazione e la regione 5' UTR del mRNA10,11 . L'associazione di miRNA per il mRNA sequenze risultati in traslazionale silenziamento12,13,14 e in alcuni casi mRNA destabilizzazione15. Poiché un singolo miRNA puoi indirizzare molti mRNA, queste molecole regolatrici sono coinvolte in quasi ogni processo cellulare e sono state implicate in varie malattie condizioni16,17,18.
Conoscenza dettagliata di come Mirna regolano vie cellulari richiede l'identificazione degli mRNA bersaglio. Sono disponibili per predire putativi miRNA:mRNA interazioni19,20più piattaforme di bioinformatica. Queste previsioni si basano su perfetto Watson-Crick appaiamento tra la sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 del quieto e una sequenza complementare entro il4,di mRNA target21. Inoltre, questi strumenti generano la struttura secondaria del duplex miRNA:mRNA, calcolano i parametri termodinamici di questa interazione molecolare e visualizza conservazione delle sedi del legame tra le specie per migliorare la rilevanza funzionale della destinazione Pronostico. Purtroppo, questi strumenti hanno anche la limitazione della predizione falsi obiettivi positivi a un tasso molto elevato (~ 27 – 70%)15,22. La cosa più importante, queste piattaforme in silico non riescono a riconoscere le interazioni non-canonica di Mirna con loro obiettivi23. Pertanto, tali analisi predittive sono spesso combinati con metodi sperimentali per convalidare funzionalmente rilevanti obiettivi.
Diversi approcci sono stati sviluppati per convalidare sperimentalmente l'interazione miRNA:mRNA. Esperimenti genetici utilizzando miRNA mimics, spugne e inibitori che alterano i livelli di miRNA nella cella forniscono indizi per suo effetto regolatore dal bersaglio gene espressione24,25,26. Inoltre, reporter basato su analisi tramite co-transfezione di un clone contenente la regione 3' UTR di mimici di mRNA e miRNA la destinazione o inibitori in cellule forniscono la prova della funzione regolamentare di Mirna26. Mentre questi metodi sono fondamentali per studiare la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica di Mirna, effetti di efficienza e pleotropic di transfezione delle alterazioni nei livelli di miRNA cellulare sono grossi limiti di questi approcci genetici23, 26. Di conseguenza, complementari metodi biochimici che sonda l'interazione diretta tra miRNA e l'obiettivo sono impiegati per comprendere meglio la funzione cellulare dei miRNA.
Un metodo ampiamente utilizzato per studiare l'interazione diretta tra miRNA e il suo obiettivo è immunoprecipitazione del complesso RISC seguito mediante l'individuazione del target di mRNA all'interno del complesso27,28,29,30 . Recentemente, un metodo migliorato di trappola RISC è stato utilizzato anche per identificare bersagli miRNA; si accoppia stabilizzazione degli obiettivi all'interno gli intermedi di RISC-miRNA-mRNA con la purificazione del mRNA bersaglio. Tuttavia, questi methodsface le sfide inerenti delle interazioni aspecifiche tra proteine RNA e RNA-binding che solitamente sono segregate da compartimenti cellulari31,32. Inoltre, queste analisi sono dipendente dalla presenza di proteine AGO2 per immunoprecipitazione del complesso RISC33. Dato che AGO2 non è l'unico argonaute per mediare interazioni miRNA:mRNA efficiente, l'esclusione di altri argonautes potrebbe portare a risultati biased34. Pertanto, strategie alternative sono necessari per studiare il legame diretto del miRNA a mRNA.
In questo rapporto, abbiamo elaborato un approccio One-Step per sondare l'interazione diretta tra un miRNA e l'obiettivo mRNA. In primo luogo, 3' biotinilati bloccato dell'acido nucleico (LNA) miRNA imita transfected nelle cellule di mammiferi. Quindi, la miRNA:mRNA complesso nel lisato cellulare viene catturato utilizzando streptavidina biglie magnetiche. Il target di mRNA associato alla sua miRNA complementare è quantificato utilizzando qPCR.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare - HEK293T cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente (Hi-FBS)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)&nbsp;</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)</td><td>Cellgro/Mediatech</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNasi&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Terreni sierici ridotti</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>3198-088</td><td></td></tr><tr><td>Liopfectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato has-miR-125b</td><td>Exiqon</td><td>339178/ID-27281622</td><td></td></tr><tr><td>Controllo strapazzato biotinilato</td><td>Exiqon</td><td>479997-671/ID-714884</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche di streptavidina</td><td>Pierce</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>TRNA di lievito</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl<subSoluzione >2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico, soluzione di sale disodico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Superase</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Acqua libera da RNAsi/DNAsi</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi di cDNA iScript-Select</td><td>Biorad</td><td>170-8897</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Primers&nbsp;</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq-Universal SYBR verde supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-Spin Magnete</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>12320D</td><td></td></tr></tbody></table>

biotina-based pulldown assay validate mrna mirna obiettivi del cellulare

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

I microRNA (Mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che appaiamento regolano l'espressione genica cellulare. Mirna bind per la regione 3' non tradotta (UTR) del bersaglio mRNA per inibire la traduzione della proteina o in alcuni casi causare la degradazione di mRNA. L'associazione del quieto al 3' UTR del bersaglio che mRNA è mediato da una sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 all'estremità 5' di miRNA. Mentre il ruolo dei miRNA come molecole regolatrici cellulari è ben consolidato, identificazione degli mRNA bersaglio con rilevanza funzionale rimane una sfida. Strumenti bioinformatici sono stati impiegati per prevedere sequenze all'interno di 3' UTR degli mRNA come obiettivi potenziali per l'associazione di miRNA. Questi strumenti sono stati utilizzati anche per determinare la conservazione evolutiva di tali sequenze tra specie affini nel tentativo di prevedere il ruolo funzionale. Tuttavia, questi metodi computazionali spesso generano falsi positivi e sono limitati a predire canonica interazione tra miRNA e mRNA. Di conseguenza, le procedure sperimentali che misurano il legame diretto del miRNA al suo target di mRNA sono necessari da stabilire interazione funzionale. In questo rapporto, descriviamo un metodo sensibile per la convalida di interazione diretta tra i cellulari miRNA miR-125b e 3' UTR di PARP-1 mRNA. Elaboriamo un protocollo in cui imita sintetico biotinilato-miRNA transfected nelle cellule di mammiferi e il complesso di miRNA-mRNA nel lisato cellulare è stato tirato con biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Infine, la destinazione del che mRNA nel complesso dell'acido nucleico spostate verso il basso è stato quantificato utilizzando una strategia basata su qPCR.

Mirna regolano processi cellulari legandosi agli mRNA bersaglio. Di conseguenza, identificazione mRNA bersaglio è la chiave per capire la funzione di miRNA. Qui abbiamo elaborato un metodo per identificare target di mRNA di miRNA cellulare. Questo protocollo è adattato da Wani et al. 35 con la modifica dell'utilizzazione biotinilati basati su LNA miRNA imita di pulldown bersaglio mRNA. L'uso di base di LNA oligonucleotidi mimici migliora la specificità del...

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'mRNA, come ad esempio, se il bersaglio dell'mRNA previsto in silico può interagire direttamente con un particolare microRNA cellulare. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza imitatori biotinilati per abbattere l'mRNA bersaglio. E questi imitatori biotinilati hanno acidi nucleici bloccati o una chimica mimica basata sull'LNA che aiuta nella formazione di oligonucleotidi molto stabili con un'affinità molto elevata che può migliorare la specificità della reazione.Le implicazioni di questa metodologia sono che può passare dalla comprensione della biologia del microRNA a terapie basate su microRNA. Ciò è dovuto principalmente al fatto che sappiamo tutti che i microRNA svolgono un ruolo fondamentale in ogni aspetto della biologia cellulare. Quindi, identificando i bersagli dei microRNA, che sono gli mRNA, possiamo certamente fornire conoscenze critiche che sarebbero importanti per la scoperta e la terapia.A dimostrare il protocollo sarà Sabyasachi Dash, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per rivestire le perle magnetiche con streptavidina, per prima cosa, agitare accuratamen

biotin-based-pulldown-assay-to-validate-mrna-targets-cellular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

L'identificazione luminescente di elementi funzionali in 3' regioni non tradotte (3'UTR) (3'LIFE) è una tecnica per identificare la regolazione funzionale nei 3'UTR da parte di miRNA o altri fattori regolatori. Questo protocollo utilizza una metodologia ad alto rendimento, come la trasfezione a 96 pozzetti e i saggi di luciferasi, per lo screening di centinaia di interazioni putative per la repressione funzionale.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Descriviamo l'uso di una piattaforma di espressione genica multiplexata ad alto rendimento che quantifica l'espressione genica mediante codifica a barre e conteggio di molecole in substrati biologici senza la necessità di amplificazione. Abbiamo utilizzato la piattaforma per quantificare l'espressione di microRNA (miRNA) nel sangue intero in soggetti con e senza sindrome dell'intestino irritabile.

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

Questo metodo di discesa di RNA permette di identificare i bersagli di RNA di un RNA lunghi non codificanti (lncRNA). Basato sull'ibridazione di fatto in casa, progettato anti-senso del DNA del oligonucleotide sonde specifiche per questo lncRNA in un tessuto opportunamente fisso o linea cellulare, in modo efficiente permette la cattura di tutti i target di RNA della lncRNA.

Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

Questo protocollo utilizza una reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), un saggio SRB (sulforhodamine B), una clonazione di 3 regioni non tradotte (3' UTR) e un analisi luciferasi per verificare i geni bersaglio di un miRNA di interesse e per comprendere le funzioni dei miRNA.

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

Qui, presentiamo una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine che 1) può identificare i miRNA noti e nuovi in modo più accurato e 2) è completamente automatizzata e liberamente disponibile. Gli utenti possono ora eseguire un breve script di invio per eseguire la pipeline mirMachine completamente automatizzata.

mirMachine: uno sportello unico per l'annotazione dei miRNA vegetali

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri il metodo di pulldown con biotina per validare i target mRNA dei microRNA cellulari utilizzando mimici LNA biotinilati. Questa tecnica offre elevata specificità e stabilità per la cattura e quantificazione degli mRNA target.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Esplora altri video