Name: Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri come sviluppare un modello di carcinoma epatocellulare in vivo utilizzando la tecnologia dei fogli cellulari su ratti nudi. Questo metodo consente di valutare l'effetto delle cellule staminali mesenchimali sulla crescita tumorale.

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Gli autori vorrei ringraziare il personale della chirurgia sperimentale e laboratorio animale presso il College of Medicine, re Saud University, per la loro cooperazione e assistenza-soprattutto Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Gli autori inoltre desidera ringraziare il team di media King Saud bin Abdul-Aziz University per la preparazione di visual materiale-soprattutto Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.

Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del comitato etico di King Saud University. Le procedure chirurgiche, anestetici e altri farmaci usati sugli animali sono approvati dal comitato etico di King Saud University. Tutto il lavoro sperimentale è eseguito da personale opportunamente addestrato.
1. cella foglio costruzione
<ol><li>Spalmate le piastre di coltura (piastre di coltura termosensibile 3.5 cm) non diluito siero bovino fetale (FBS) e garantire per coprire tutta la superficie del piatto. Nota: Questo passaggio è importante per il distacco dello strato di cellule dal momento che supporta la crescita delle cellule in un monostrato e impedisce l'aggregazione delle cellule.</li>
	<li>Incubare i piatti per 24 h a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria.</li>
	<li>Rimuovere i FB in eccesso dai piatti rivestiti e consentire i piatti ad asciugare a temperatura ambiente (TA) per almeno 1 h.</li>
	<li>Preparare le sospensioni tre cellulari: 1 x 106 HepG2 cellule, cellule di 1 x 106 HepG2 con BMMSCs e 1 x 106 HepG2 cellule con UCMSCs (in un rapporto di 4:1 per BMMSCs e UCMSCs).</li>
	<li>La sospensione di cella appropriata ad ogni piatto con etichetta del seme.</li>
	<li>Sospendere tutte le cellule in coltura DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria.</li>
</ol>2. cella foglio distacco
<ol><li>Alla confluenza delle cellule di 100%, prendere i piatti fuori l'incubatore a 37 ° C.</li>
	<li>Incubare il piatto di strato delle cellule HepG2 per 1h a RT, mentre incubando il HepG2/BMMSC e piatti di strato delle cellule HepG2/UCMSC per 30-40 min a 20 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO2 e il 95% di aria. Nota: Strato di cellule fatta da solo HepG2 è fragile; riducendo la temperatura a 20 ° C provoca danni alla struttura del foglio.</li>
</ol>3. le prestazioni della procedura chirurgica
Nota: Durante il periodo di incubazione per il distacco del foglio cellulare, avviare la procedura di animale.
<ol><li>
Istruzioni per la preparazione della zona di chirurgia
	<ol>
<li>Effettuare tutte le procedure chirurgiche in un'area sterile separata all'interno del laboratorio, come un cappuccio, a flusso laminare o una sala di chirurgia asettica. Garantire che tutte le superfici dell'area chirurgia sono non-poroso, sigillato, resistente e sanitizzabile.</li>
		<li>Indossare equipaggiamento protettivo adeguato, compreso testa e copriscarpe, guanti, maschere e scrub.</li>
		<li>Uso chirurgico strumenti che sono pulita e sterilizzata (tramite autoclave; staminali saturo ad alta pressione) all'inizio dell'ambulatorio.</li>
		<li>Cambiare i guanti fra i ratti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dell'animale per chirurgia
	<ol>
<li>Utilizzare per 12-week-old 8 nudi ratti.</li>
		<li>Creare l'anestesia iniettabile per ratti.<ol>
<li>Per preparare la soluzione di anestesia, ketamina-xilazina, mescolare 1 mL di soluzione fisiologica sterile (ad es., cloruro di sodio 0,9%) in una fiala di raccolta sterile 10 mL siero, 1 mL di xilazina (ad una concentrazione di 20 mg/mL) e 2 mL di ketamina e agitare bene prima utilizzare.</li>
			<li>Per applicare l'anestesia, iniettare 0,2 mL di soluzione di ketamina-xilazina per 100 g di peso corporeo del ratto per via intraperitoneale. Nota: La dose totale della soluzione è di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rimuovere lo sporco/detriti visibili dal sito chirurgico.</li>
		<li>Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro pedale (piede pad pizzico su entrambi i piedi posteriori). Nota: Se il pizzico di rilievo del piede provoca una risposta, ripetere ad una dose di 0,05 mL/100 g (circa ogni 30 min), quindi controllare nuovamente la profondità anestetica.</li>
		<li>Disinfettare l'area operata con una macchia di due stadi di povidone-iodio/isopropanolo.</li>
		<li>Coprire il topo con un telino sterile per evitare la contaminazione dell'incisione.</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea i ratti con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)8 prima di effettuare l'incisione.</li>
		<li>Usando un bisturi sterile, fare un 7 - a 10 cm di taglio tra le bucce e i muscoli sottostanti per esporre il fegato.<ol>
<li>Separare il muscolo addominale dalla pelle con il bordo posteriore piatta del bisturi.</li>
			<li>Attentamente pugnalare il linea alba usando un bisturi ed estendere il taglio con forbici affilate.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. foglio di trapianto
Nota: Trapianto di cellule foglio viene eseguito sul fegato.
<ol><li>Raccogliere il foglio delle cellule dalla piastra di coltura.<ol>
<li>Picchiettare delicatamente la piastra di coltura sopra il banco per staccare il foglio dalla sua superficie.</li>
		<li>Separare strato di cellule dalla superficie del piatto da raschiare il bordo del foglio in un semicerchio utilizzando una pipetta sterile.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il mezzo intero dalla piastra di coltura.</li>
		<li>Assicurarsi che il foglio è intatto senza alcun danno; in caso contrario, non può essere utilizzato (Figura 1). Nota: I fogli risultanti possono essere rilevati direttamente dall'occhio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una membrana sterile (carta da filtro) per la raccolta di strato di cellule dal piatto.<ol>
<li>In primo luogo, mettere a bagno la membrana con soluzione salina. Quindi, rimuovere la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.</li>
		<li>Posizionare la membrana umida sopra strato di cellule, evitando pieghe e bolle d'aria tra la membrana e strato di cellule.</li>
		<li>Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica normale sopra la membrana e strato di cellule per raccoglierli più facile. Nota: Per evitare di rompere la strato di cellule, non utilizzare la soluzione salina fredda e sollevare la membrana e strato di cellule con il forcipe.</li>
		<li>Lasciare la membrana per pochi secondi per assicurarsi che strato di cellule sia correttamente collegato alla membrana e poi raccoglierlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il fegato per trapianto di cellule foglio.<ol>
<li>Assicurarsi che la superficie del fegato sia asciutta toccando delicatamente con un batuffolo di cotone sterile.</li>
		<li>Utilizzando pinze sterili, collocare la membrana con strato di cellule sopra un singolo lobo del fegato del ratto.</li>
		<li>Aggiungere poche gocce di soluzione fisiologica sterile e applicare una leggera pressione sulla membrana per staccare il foglio di cella da esso.</li>
		<li>Attendere 5 minuti prima di rimuovere con cura la membrana. Nota: Questo viene fatto per garantire che strato di cellule sia collegato correttamente al fegato.</li>
		<li>Infine, chiudere i muscoli sottostanti e incisioni con suture in nylon 5-0 la pelle.</li>
		<li>Disinfettare la zona di chirurgia con povidone-iodio. Nota: La figura 2 Mostra un diagramma della procedura di trapianto di cellule foglio sul fegato di ratto nudo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cura post-operatoria di
<ol><li>Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, il ratto singolarmente per evitare cannibalismo o soffocamento della casa e monitorarlo regolarmente (almeno ogni 15 min) fino a quando non è cosciente e completamente ambulanti.</li>
	<li>Quindi, valutare i ratti al giorno per 5-14 d, almeno 5 d postoperatorio, per garantire che non ci sono complicazioni. Durante la valutazione giornaliera, assicurarsi di quanto segue.<ol>
<li>La ferita è chiusa, e le suture sono intatte, senza essere eccessivamente stretto.</li>
		<li>Non ci sono nessun segno dell'infezione del sito di incisione, come il calore, eccessivo scarico purulento o gonfiore.</li>
		<li>Non ci sono segni associati con dolore, come il consumo di cibo e acqua in diminuzione, perdita di peso, disidratazione, pelle tenting o respirazione con la bocca aperta e rapida. Al controllo da moderata a grave dolore post-operatorio, se del caso, iniettare i ratti per via sottocutanea con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) ogni 6-8 h9 per un minimo di 48-72 h postoperatorio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analisi dell'Area trapiantato
<ol><li>Un mese dopo il trapianto, il sacrificio del ratto e raccogliere l'area trapiantata per istologico e l'analisi di immunohistochemical.</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088(2010).</li>
<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
<li>Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , 
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<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
<li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li>
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<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Una vasta quantità di ricerca è dedicata allo sviluppo di un'adeguata in vivo animale modello preclinico analogo cancri umani. Attualmente, gli approcci principali utilizzati per creare modelli animali di cancro coinvolgono ingegneria genetica e delle cellule trapianto11. Modelli animali geneticamente modificati sono buoni strumenti per l'identificazione e la validazione dei geni bersaglio, come pure la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tossicità indotta da farmaci. Tutt...

HCC è un cancro primario del fegato che è significativamente associato con una prognosi difficile. Ogni anno, quasi mezzo milione nuovi pazienti sono diagnosticati con HCC, che rappresenta 85% dei pazienti di cancro del fegato nel mondo1. Hepatocarcinogenesis non è una malattia di form singolo; piuttosto, è una collezione di malattie che hanno differenti caratteristiche istopatologiche e variabilità genetica e genomica, oltre alla varia prognostici risultati1. Di conseguenza, le principali sfide nello sviluppo di un'efficace strategia terapeutica per HCC sono la limitata conoscenza della biologia HCC e la mancanza di un modello animale sperimentale adatto che può aiutare a capire questa complessa malattia. Un in vivo modello animale che imita cancro umano è necessario per la selezione di geni candidati e identificazione di marcatori prognostici/predittivi implicati nell'induzione del cancro, così come per lo studio di diversi fattori che possono influenzare le risposte del cancro agli agenti terapeutici.
Gli studi in vitro del cancro sono ancora associati con grossi limiti. Questo è dovuto al fatto che le cellule tumorali perdono molte delle loro caratteristiche in vivo quando mantenute in coltura. I cambiamenti che si verificano a cellule in vitro risultato dall'assenza della fisiologia del tessuto intero in un ambiente ex vivo . Interazione cellula--cellula di cancro (stromal, immunitario, sistema vascolare, epiteliali, ecc.) all'interno del microambiente tumorale riflette notevolmente il cancro delle cellule caratteristiche2. Il microambiente tumorale potrebbe alterare l'espressione proteina/del gene del cancro delle cellule e delle caratteristiche fenotipiche, oltre angiogenetici e potenzialità metastatica. Il sistema di cultura bidimensionale (2D) in vitro manca anche una matrice di tessuto adatto, che è necessaria regolare la progressione del tumore. Così, a causa di queste limitazioni, in vivo modelli dovrebbero sempre essere utilizzati per supportare i risultati preliminari di modelli in vitro . In questo studio, usiamo la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un in vivo modello animale che delucida il completo processo biologico sottostante HCC.
Più di un decennio fa, laboratorio di Okano stabilito un metodo novello di ingegneria tissutale basata sulla cella foglio tecnologia3. Questa tecnica utilizza una plastica termo-sensibile cultura per consentire l'adesione/distacco cellulare reversibile controllando l'idrofobicità di superficie. Questo metodo consente una delicata raccolta di cellule coltivate nel formato di un intatto tridimensionale (3D) (foglio i.e.,cell), con una curatissima matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellula--cellula. La tecnica di strato delle cellule richiede la spre-spalmatura di piastre di coltura con un polimero termosensibile PNIPPA (PIPA Am), che è commercialmente disponibile e pronto per l'uso. Ad una temperatura inferiore a 20 ° C, PIPA sono polimeri diventano idratati e si dissolvono in soluzioni acquose, considerando che, ad una temperatura superiore (37 ° C), i polimeri diventano disidratati e trasformano in un precipitato torbido. Il polimero contiene catene ammide idrofila e catene laterali idrofobe (gruppi isopropilico). Alle alte temperature, si intensifica il movimento browniano delle molecole d'acqua, considerando che, a bassa temperatura, le molecole dell'acqua che circonda i gruppi isopropilico della ripartizione struttura idratata e i gruppi di isopropile idrofobo aggregare a causa di interazioni idrofobiche. Di conseguenza, l'intera catena del polimero aggrega e precipitati4.
Nello studio presentato, questa tecnica è impiegata per sviluppare un modello animale di HCC con tre fogli differenti delle cellule. Il primo foglio impiegato è costituito da cellule di HCC cella linea solo, mentre gli altri due fogli sono costituiti da una combinazione di cellule della linea cellulare HCC e MSCs da due origini diverse: midollo osseo MSCs (BMMSCs) e del cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). MSCs sono non-emopoietici cellule stromale che sono capaci di differenziazione intocell derivati del lignaggio mesenchymal, inclusi adipociti, osteociti, condrociti e miociti5. La ragione che ci avvaliamo di queste cellule, durante la creazione di strato di cellule di cancro è la segnalazione incoerente sull'effetto di MSCs sui cancri. È stato suggerito che MSCs può avere due fenotipi distinti: "MSC1", un fenotipo proinfiammatorio e "MSC2", un fenotipo immunosoppressivo6. MSCs esprimono recettori toll-like (TLR). TLR4 adescamento di MSCs aumenta la secrezione di fattori proinfiammatori, mentre TLR3 innesco aumenta la loro secrezione di fattori immunosoppressivi6. Uno studio in vitro di questi due fenotipi ha riferito che una co-coltura di MSC1 con linee cellulari del cancro attenuata la crescita della cellula tumorale, mentre MSC2 co-coltura ha avuto l' effetto opposto7. Ciò implica che MSCs può essere Pro-cancro o anticancro, a seconda del loro fenotipo. Così, oltre a sviluppare il modello animale di HCC utilizzando tecnologia dello strato delle cellule, vogliamo esplorare l'effetto del trapianto di MSC sullo sviluppo del tumore, e se utilizzando queste cellule sarà aumentare o ridurre lo sviluppo di questo modello.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina&nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica sterile</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare HepG2 umana</td><td>ATCC, USA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr> Linea <tr><td>cellulare MSC del midollo osseo umano</td><td>PromoCell, USA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC del tessuto del cordone ombelicale umano</td><td>PromoCell, USA&nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 50%</td> <td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td> <td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine. &nbsp; soluzione.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>Monouso:&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Polipropilene ad alta trasparenza</td> PP <td>Centrifuga Tube Falcon &nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>piastre sterili UpCell da 3,5 cm con carta da filtro (membrana)</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &; l &nbsp; Puntali per pipette&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Procedura di base Telo</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; Pipetta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus, volume variabile</td><td>Eppendorf® &nbsp; Ricerca&reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali 37 gradi C, 5% CO2</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali 20 gradi; C, 5% CO2</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici sterili e ratti nudi:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sutura in nylon&nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilamento, Lancetta</td></tr><tr><td>1 ml Siringhe per tubercolina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Ratti nudi&nbsp;</td><td>Fiume</td><td></td><td></td> Charles</tr></tbody></table>

esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di carcinoma epatocellulare in vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Un in vivo modello animale che imita cancro umano potrebbe avere varie applicazioni che forniscono le informazioni cliniche significative. Le tecniche attualmente utilizzate per lo sviluppo di modelli di cancro in vivo hanno notevoli limitazioni. Pertanto, in questo studio, miriamo a implementare la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un modello di cancro in vivo . Carcinoma epatocellulare (HCC) è sviluppato con successo in nudi ratti utilizzando fogli di cella create da cellule di HCC cella linea. I fogli di cellule di cancro sono generati tramite adesione intracellulare e la formazione di una struttura stratificata, controllata dalla matrice extracellulare. Ciò consente il trapianto di foglio HCC in fegato e la creazione di un modello animale del tumore-cuscinetto entro un mese. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali mesenchimali (MSC) nello sviluppo di questo modello di cancro è studiato. Oltre il foglio di linea delle cellule HCC, un'altra cella due fogli vengono creati: un foglio delle cellule HCC e midollo osseo MSCs (BMMSCs) e un foglio di cellule di HCC e cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). Fogli che hanno una combinazione di entrambe le cellule HCC e MSCs sono anche in grado di produrre un animale del tumore-cuscinetto. Tuttavia, l'aggiunta di MSCs riduce le dimensioni del formato di tumore, e questo effetto negativo sullo sviluppo del tumore varia a seconda origine dei MSCs usate. Questo indica che una lastra cella determinati sottotipi MSC poteva essere utilizzata nel controllo e gestione di tumore.

Carcinogenicità di strati delle cellule trapiantate in ratti:
Un mese dopo il trapianto, tutti i fogli delle cellule trapiantate in fegati di ratti hanno sviluppato tumori (Figura 3). La dimensione media dei tumori sviluppati da HepG2, HepG2/BMMSC e strati delle cellule HepG2/UCMSC erano 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, rispettivamente10.
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Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare un modello in vivo del cancro utilizzando tecnologia dello strato delle cellule. Tale modello potrebbe essere molto utile per la valutazione delle terapie anticancro.

Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Ciao, sono il dottor Alaa Alshareeda del King Abdullah International Medical Research Center presso il Dipartimento di Cellule Staminali e Medicina Rigenerativa. Oggi dimostreremo l'effetto delle cellule staminali mesenchimali sullo sviluppo del carcinoma epatocellulare su un modello di ratto utilizzando la tecnologia dei fogli cellulari. Ciao, sono Abdullah Almubarak.Lavoro in Chirurgia Sperimentale e Laboratorio Animale presso la King Saud University. Usiamo il ratto nudo per evitare qualsiasi rigetto dopo il trapianto del foglio cellulare. Questo diagramma mostra la procedura di trapianto di fogli cellulari su ratti nudi.In questo studio verranno utilizzati ratti nudi di età compresa tra otto e 12 settimane. Per prima cosa, intacca i ratti e fai un taglio da sette a dieci centimetri tra la pelle e i muscoli sottostanti usando il bisturi per esporre il fegato. Per trasferire il foglio cellulare, utilizzare una membrana sterile.Posiziona la membrana sul foglio cellulare per raccoglierla. Quindi, posiziona il foglio cellulare con la membrana su un lobo del fegato. Costruzione di fogli di celle.Prima di seminare le cellule, rivestire le piastre di coltura UpCell sensibili alla temperatura di 3,5 centimetri con FBS non diluito. Il rivestimento delle piastre con FBS supporta la crescita delle cellule nello strato di membrana e previene la degradazione delle cellule. Assicurarsi di coprire tutta la superficie dei piatti.Incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Il giorno successivo rimuovere l'FBS in eccesso e lasciare asciugare i piatti a temperatura ambiente per almeno un'ora. Seminare almeno un milione di cellule tumorali HepG2 da sole o co-coltivate con cellule staminali mesenchimali in terreno di coltura DMEM.Il terreno è stato integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Il rapporto utilizzato tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali in questo studio è di 4:1. Dopo aver aggiunto le cellule, agitare delicatamente i piatti.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Distacco del foglio cellulare. Al 100% di confluenza cellulare, estrarre le piastre dall'incubatore a 37 gradi Celsius.Ora, incubare il foglio di cellule tumorali HepG2 per un'ora a temperatura ambiente, mentre incubare l'HepG2 co-coltivato con cellule staminali mesenchimali per 30-40 minuti a 20 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica al 95% di aria. Durante il periodo di incubazione per il distacco del foglio cellulare, inizia la procedura animale. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della King Saud University.Esecuzione della procedura chirurgica. Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro del pedale. Disinfettare l'area chirurgica con iodio.Ora, applica un secondo scrub con iodio. Coprire l'animale con un telo sterilizzato per evitare la contaminazione dell'incisione. Usando un bisturi sterilizzato, fai un taglio tra la pelle e i muscoli sottostanti, di circa sette-dieci centimetri di dimensione per esporre il fegato.Separare il muscolo addominale dalla pelle con il bordo posteriore piatto del bisturi. Pugnalare con cura la linea alba utilizzando un bisturi ed estendere il taglio con una forbice affilata. Trapianto di fogli cellulari su fegato di ratto.Picchiettare delicatamente il piatto di coltura sulla panca per staccare il foglio dalla sua superficie. Separare il foglio di cellule dalla superficie del piatto raschiando i bordi del foglio in un semicerchio. Ora, rimuovi delicatamente tutto il terreno di coltura dal piatto.Assicurarsi che il foglio sia integro senza alcun danno, altrimenti non può essere utilizzato. Preparare una membrana sterile per raccogliere e trasferire il foglio cellulare. Quindi, per prima cosa, immergi la membrana con soluzione fisiologica, quindi rimuovi la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.Posizionare la membrana bagnata sopra il foglio cellulare, evitando bolle d'aria tra la membrana e il foglio cellulare. Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica normale sulla membrana e sul foglio cellulare per raccogliere il materiale. Lasciare la membrana per alcuni secondi per assicurarsi che il foglio cellulare sia attaccato correttamente alla membrana, quindi raccoglierlo.Ora, prepara il fegato per il trapianto. Assicurati che la superficie del fegato sia asciutta. Posizionare la membrana con il foglio cellulare su un singolo lobo del fegato del ratto.Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica sterilizzata per staccare il foglio cellulare dalla membrana. Attendere cinque minuti prima di rimuovere con cura la membrana. Il foglio cellulare può essere visto attaccato al fegato in questo video.Infine, chiudere i muscoli sottostanti e le incisioni cutanee con cinque suture di nylon. Dopo aver chiuso l'incisione, disinfettare l'area chirurgica con betadine. Il tempo che intercorre tra l'interruzione dell'anestesia e l'avvio è variabile, ma di solito è compreso tra cinque e 20 minuti.Questa figura mostra il tumore sviluppato sul fegato di ratto dopo un mese di trapianto di fogli cellulari HepG2. Qui, il tumore è stato sviluppato dopo il trapianto di cellule tumorali HepG2 fabbricate su fogli cellulari e cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Mentre questo mostra, il più piccolo tumore sviluppato sul fegato di ratto dopo il trapianto di foglio cellulare fabbricato da cellule tumorali HepG2 e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale, questa figura mostra la colorazione H ed E del fegato di ratto dopo un mese dal trapianto di foglio cellulare.Dove A rappresenta le cellule epatiche di ratto normali e B mostra le cellule epatiche di ratto tumorali. Conclusione. Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di sviluppare un modello di carcinoma epatocellulare su un ratto nudo utilizzando la tecnologia del foglio cellulare. Grazie per aver guardato.

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Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo

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