Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo

Ciao, sono il dottor Alaa Alshareeda del King Abdullah International Medical Research Center presso il Dipartimento di Cellule Staminali e Medicina Rigenerativa. Oggi dimostreremo l'effetto delle cellule staminali mesenchimali sullo sviluppo del carcinoma epatocellulare su un modello di ratto utilizzando la tecnologia dei fogli cellulari. Ciao, sono Abdullah Almubarak.

Lavoro in Chirurgia Sperimentale e Laboratorio Animale presso la King Saud University. Usiamo il ratto nudo per evitare qualsiasi rigetto dopo il trapianto del foglio cellulare. Questo diagramma mostra la procedura di trapianto di fogli cellulari su ratti nudi.

In questo studio verranno utilizzati ratti nudi di età compresa tra otto e 12 settimane. Per prima cosa, intacca i ratti e fai un taglio da sette a dieci centimetri tra la pelle e i muscoli sottostanti usando il bisturi per esporre il fegato. Per trasferire il foglio cellulare, utilizzare una membrana sterile.

Posiziona la membrana sul foglio cellulare per raccoglierla. Quindi, posiziona il foglio cellulare con la membrana su un lobo del fegato. Costruzione di fogli di celle.

Prima di seminare le cellule, rivestire le piastre di coltura UpCell sensibili alla temperatura di 3,5 centimetri con FBS non diluito. Il rivestimento delle piastre con FBS supporta la crescita delle cellule nello strato di membrana e previene la degradazione delle cellule. Assicurarsi di coprire tutta la superficie dei piatti.

Incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Il giorno successivo rimuovere l'FBS in eccesso e lasciare asciugare i piatti a temperatura ambiente per almeno un'ora. Seminare almeno un milione di cellule tumorali HepG2 da sole o co-coltivate con cellule staminali mesenchimali in terreno di coltura DMEM.

Il terreno è stato integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Il rapporto utilizzato tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali in questo studio è di 4:1. Dopo aver aggiunto le cellule, agitare delicatamente i piatti.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Distacco del foglio cellulare. Al 100% di confluenza cellulare, estrarre le piastre dall'incubatore a 37 gradi Celsius.

Ora, incubare il foglio di cellule tumorali HepG2 per un'ora a temperatura ambiente, mentre incubare l'HepG2 co-coltivato con cellule staminali mesenchimali per 30-40 minuti a 20 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica al 95% di aria. Durante il periodo di incubazione per il distacco del foglio cellulare, inizia la procedura animale. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della King Saud University.

Esecuzione della procedura chirurgica. Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro del pedale. Disinfettare l'area chirurgica con iodio.

Ora, applica un secondo scrub con iodio. Coprire l'animale con un telo sterilizzato per evitare la contaminazione dell'incisione. Usando un bisturi sterilizzato, fai un taglio tra la pelle e i muscoli sottostanti, di circa sette-dieci centimetri di dimensione per esporre il fegato.

Separare il muscolo addominale dalla pelle con il bordo posteriore piatto del bisturi. Pugnalare con cura la linea alba utilizzando un bisturi ed estendere il taglio con una forbice affilata. Trapianto di fogli cellulari su fegato di ratto.

Picchiettare delicatamente il piatto di coltura sulla panca per staccare il foglio dalla sua superficie. Separare il foglio di cellule dalla superficie del piatto raschiando i bordi del foglio in un semicerchio. Ora, rimuovi delicatamente tutto il terreno di coltura dal piatto.

Assicurarsi che il foglio sia integro senza alcun danno, altrimenti non può essere utilizzato. Preparare una membrana sterile per raccogliere e trasferire il foglio cellulare. Quindi, per prima cosa, immergi la membrana con soluzione fisiologica, quindi rimuovi la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.

Posizionare la membrana bagnata sopra il foglio cellulare, evitando bolle d'aria tra la membrana e il foglio cellulare. Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica normale sulla membrana e sul foglio cellulare per raccogliere il materiale. Lasciare la membrana per alcuni secondi per assicurarsi che il foglio cellulare sia attaccato correttamente alla membrana, quindi raccoglierlo.

Ora, prepara il fegato per il trapianto. Assicurati che la superficie del fegato sia asciutta. Posizionare la membrana con il foglio cellulare su un singolo lobo del fegato del ratto.

Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica sterilizzata per staccare il foglio cellulare dalla membrana. Attendere cinque minuti prima di rimuovere con cura la membrana. Il foglio cellulare può essere visto attaccato al fegato in questo video.

Infine, chiudere i muscoli sottostanti e le incisioni cutanee con cinque suture di nylon. Dopo aver chiuso l'incisione, disinfettare l'area chirurgica con betadine. Il tempo che intercorre tra l'interruzione dell'anestesia e l'avvio è variabile, ma di solito è compreso tra cinque e 20 minuti.

Questa figura mostra il tumore sviluppato sul fegato di ratto dopo un mese di trapianto di fogli cellulari HepG2. Qui, il tumore è stato sviluppato dopo il trapianto di cellule tumorali HepG2 fabbricate su fogli cellulari e cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Mentre questo mostra, il più piccolo tumore sviluppato sul fegato di ratto dopo il trapianto di foglio cellulare fabbricato da cellule tumorali HepG2 e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale, questa figura mostra la colorazione H ed E del fegato di ratto dopo un mese dal trapianto di foglio cellulare.

Dove A rappresenta le cellule epatiche di ratto normali e B mostra le cellule epatiche di ratto tumorali. Conclusione. Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di sviluppare un modello di carcinoma epatocellulare su un ratto nudo utilizzando la tecnologia del foglio cellulare. Grazie per aver guardato.