Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della lesione e della rigenerazione dei nervi periferici, come ad esempio qual è la morfometria di un nervo periferico, quanti assoni sono presenti, qual è lo stato di mielinizzazione e c'è tessuto fibrotico presente? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione ad alta risoluzione delle caratteristiche nervose. Inizia posizionando un ratto anestetizzato in posizione prona sulla parte superiore di un tappetino di dissezione.

Posizionare un cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2%. Per garantire un'adeguata profondità di anestesia, testare gli animali per verificare la presenza di ritiro del pedale e i riflessi palpebrali delle zampe posteriori. Una volta raggiunta un'adeguata profondità di anestesia, radere i peli degli arti posteriori e sterilizzare le aree rasate con etanolo al 70%.

Palpare il femore per identificare la posizione corretta per l'incisione. Il femore si trova appena prossimalmente al segmento più accessibile del nervo sciatico. Dopo aver praticato un'incisione di due o tre centimetri nella pelle lungo l'arto posteriore dal ginocchio fino al grande trocantere, individuare il piano tra il muscolo bicipite femorale e il muscolo grande gluteo.

Quindi utilizzare le forbici da microdissezione per separare la fascia sottostante ed esporre due o tre centimetri del nervo sciatico sottostante. Usa un divaricatore per allargare lo spazio tra i due muscoli. Con una pinza sottile e forbici dell'iride separa accuratamente il nervo dal tessuto connettivo circostante, facendo molta attenzione a non comprimere o tagliare il nervo.

Quindi, copri il nervo esposto con il fissativo di Trump e lascia riposare per 10 minuti. Se necessario, posizionare una garza sotto la zampa posteriore per migliorare l'angolo in modo da poter aggiungere più fissante nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 minuti e ripetere questo passaggio altre due volte.

Al microscopio da dissezione, tagliare il nervo sciatico da entrambi i lati usando le forbici da dissezione fine, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo. Mettere immediatamente le sezioni nervose in provette da 15 ml contenenti il fissativo di Trump e fissarle a quattro gradi Celsius per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 ore. Dopo la fissazione, rimuovere con cura il grasso rimanente e i tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa cinque millimetri di lunghezza.

I segmenti nervosi possono essere separati in diversi tubi etichettati. Immergere i segmenti nervosi in tetrossido di osmio al 2% appena preparato per due ore. Utilizzando un kit di inclusione epossidica, preparare la miscela di inclusione finale.

Mescolare il mezzo di inclusione epossidico con la soluzione DDSA e mescolare il mezzo di inclusione epossidico con la soluzione NMA. Mescolare entrambe le soluzioni per almeno 20 minuti con un agitatore magnetico. Immediatamente prima dell'uso, combinare il DPM dell'acceleratore con la soluzione B e quindi combinarlo con la soluzione A in modo che la proporzione finale dell'acceleratore sia compresa tra uno virgola cinque e il 2% del volume totale.

Trasferire i segmenti nervosi in provette da cinque millilitri in un punto e dopo il lavaggio con PBS, iniziare il processo di disidratazione sostituendo il PBS con concentrazioni crescenti di acetone e acqua distillata per 10 minuti ciascuno poi in acetone al 100% tre volte per 10 minuti ciascuno. Un passaggio critico è la disidratazione dei tessuti. L'acqua e la resina non interagiranno, quindi l'acqua rimasta nel tessuto non verrà infiltrata dalla resina lasciando buchi nella sezione privi di qualità istologiche.

Per l'infiltrazione di resina, posizionare prima i segmenti nervosi in una miscela uno a uno di miscela di inclusione e acetone al 100% per 30 minuti. Dopo 30 minuti, trasferire gli spicchi in una miscela due a uno di miscela per incorporare e acetone al 100% per 30 minuti. Posizionare i segmenti nervosi in stampi per incorporare gomma siliconica e aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, assicurandosi di coprire l'intero segmento nervoso evitando bolle d'aria.

Lasciare polimerizzare la resina a 60 gradi Celsius per una notte. Posizionare un blocco di resina con il nervo incorporato nel supporto dell'ultramicrotomo con il lato trapezoidale rivolto verso l'alto. Durante la visualizzazione attraverso l'ultramicrotomo, utilizzare una lama a taglio singolo per tagliare la resina in eccesso che circonda il tessuto nervoso.

Non penetrare la superficie longitudinale del segmento nervoso che è riconoscibile per la sua colorazione scura da tetrossido di osmio. Con un semplice coltello di vetro sull'ultramicrotomo, crea più sezioni trasversali per esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del nervo. Fatto ciò, passa a un coltello di vetro con la barca piena di acqua distillata a temperatura ambiente e regola l'ultramicrotomo a uno o due micron per tagliare sezioni sottili.

Usa un anello di metallo per trasferire sezioni sottili galleggianti dalla barca del coltello di vetro a una goccia di acqua deionizzata su uno scivolo di vetro. Un altro passaggio critico è durante il trasferimento della sezione sottile dal coltello di vetro allo scivolo. Queste sezioni sottili sono molto fragili e possono rompersi o piegarsi.

Dopo il sezionamento, asciugare le sezioni sulle guide passando più volte una slitta su una fiamma, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente per diversi giorni se non immediatamente colorati con blu di toluidina. Per colorare le sezioni nervose, utilizzare una pipetta di plastica o un micropipettatore per aggiungere una goccia di soluzione blu di toluidina sulla parte superiore delle sezioni nervose.

Dopo 20-30 secondi, risciacquare tutto l'eccesso di soluzione blu di toluidina immergendo delicatamente i vetrini in un barattolo di acqua deionizzata, ripetendo tre o quattro volte fino a quando le sezioni non sono chiare. Asciugare i vetrini per almeno 15 minuti a 60 gradi Celsius o per una notte a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, aggiungere un normale mezzo di montaggio e coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.

Infine, esaminare le sezioni montate al microscopio ottico. Si consiglia una lente a immersione in olio 100X per immagini dettagliate per calcolare i rapporti g. Le sezioni del nervo sciatico incorporate in un terreno di resina e colorate con blu di toluidina hanno mostrato immagini nitide con risoluzione ottimale all'aumento dell'ingrandimento da 10X a 20X, 40X e 60X.

Questo metodo preserva la struttura nervosa e consente l'imaging ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento che facilita la misurazione di diversi parametri come il rapporto g, che è il rapporto tra il diametro dell'assone, indicato dalla freccia etichettata B, e il diametro totale della fibra, etichettato A.Una varietà di fattori può portare a sezioni nervose periferiche non ottimali, inclusa la presenza di crepe nella sezione a causa di una manipolazione impropria del nervo. Possono verificarsi anche buchi nella sezione a causa di una disidratazione insufficiente. Un altro possibile errore nella procedura è il piegamento delle sezioni, che può essere rimediato utilizzando anelli di inoculazione per il trasferimento delle sezioni sul vetrino.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la quantificazione degli assoni, per rispondere a ulteriori domande, come qual è il grado di rigenerazione in un nervo rigenerativo? Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere sezioni nervose periferiche da uno a due micron per valutare la morfometria nervosa.