Name: Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Impara la colorazione con blu di toluidina per sezioni di nervo periferico incastonate in resina. Questo metodo consente la visualizzazione ad alta risoluzione della morfologia, della mielinizzazione e della rigenerazione del nervo sciatico nel ratto.

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Gli autori vorrebbero dopo impianto di microscopia Jenkins all'Università del Wyoming per il loro aiuto e i membri del laboratorio Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana di Subash, per assistenza nella cura degli animali. Questa pubblicazione è stato reso possibile da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto Grant n. 2P20GM103432.

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.
1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione
Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi. Fissazione del tessuto in vivo è una pratica standard per la preparazione del tessuto del sistema nervoso per l'istologia, dove la perfusione è spesso un precursore di questo. Il posizionamento e le dimensioni dei nervi periferici ha permesso per la fissazione in situ. Si sconsiglia di accumulazione e fissazione del tessuto dopo l'eutanasia a causa della possibilità di degradazione del tessuto.
<ol><li>Preparare il ratto per anestesia generale collocandolo in una camera di induzione con 2-3% isoflurane, poi posizionare il ratto anestetizzato in posizione prona sulla cima di una stuoia di dissezione e mantenere a 1-2% di isoflurane via anestetica cono di naso. Per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia, test animali per pedale ritiro alle zampe posteriori e verificare l'assenza di riflessi palpebrali agli occhi toccando il canthus mediale dell'occhio. Nota: L'iniezione intraperitoneale di ketamina è un'alternativa comunemente usata per via inalatoria isoflurano.</li>
	<li>Per esporre il nervo sciatico, radersi i capelli dell'hind limb(s) e pulire le zone rasate con etanolo al 70%. Con un bisturi o forbici, praticare un'incisione di 2-3 cm in pelle lungo l'arto dal ginocchio fino al grande trocantere, dove palpazione del femore utilizzando il bisturi sterile per accertare la corretta posizione dell'incisione. Il femore si trova appena prossimale rispetto al segmento più accessibile del nervo sciatico. Anche se si tratta di un intervento chirurgico non-sopravvivenza, mantenere tecniche sterili.</li>
	<li>Dopo aver effettuato l'incisione cutanea, individuare l'aereo tra il muscolo bicipite femorale e del muscolo di maximus del gluteus e usando le forbici microdissection separare la fascia sottostante ed esporre 2-3 cm del nervo sciatico sottolineatura. Per esporre una sezione trasparente del nervo sciatico, è necessario utilizzare un riavvolgitore per ampliare il divario tra i due muscoli (Figura 1A). Con una pinzetta e forbici iris, separare con cura il nervo dal tessuto connettivo, ponendo la massima cura di non comprimere o tagliare il nervo circostante.</li>
	<li>Aggiungere fissativo sufficiente Trump (4% formaldeide, glutaraldeide al 1% in PBS 1X (tamponato fosfato salino) con 1,16 g di NaH2PO4· H2O / 100 mL) nella cavità contenente il nervo per coprire il nervo e lasciate riposare per 10 min. Se necessario, garza posto sotto la cerva gamba per migliorare l'angolo in modo che altro fissativo può essere aggiunto nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 min e ripetere questo passaggio altre due volte.</li>
	<li>Usando un microscopio per dissezione, tagliare il nervo da entrambi i lati utilizzando forbici dissezione bene, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo sciatico e subito messo le sezioni del nervo in provette da 15 mL contenenti fissativo di briscola a 4 ° C per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 h.</li>
	<li>Non lasciare gli animali incustoditi durante qualsiasi parte della procedura chirurgica. Dopo la rimozione del nervo, eutanasia animali di dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.</li>
</ol>2. trattamento tetrossido di osmio e l'incorporamento di resina
<ol><li>Post di fissazione, attentamente rimuovere qualsiasi residuo grasso e tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa 5 mm di lunghezza (nervo segmenti possono essere separati e identificati in diversi tubi). Preparare fresco tetrossido di osmio 2% diluito in soluzione fissante di Trump e tenere in un tubo di vetro. Immergere i segmenti del nervo in tetrossido di osmio 2% per 2 h, che può essere in tubi di plastica per questo breve periodo di tempo. Nota: Alcuni tubi di plastica reagiscono con tetrossido di osmio, causando un oscuramento della soluzione, in modo prolungato stoccaggio di tetrossido di osmio in tubi di plastica non è raccomandato.</li>
	<li>Utilizzando una resina epossidica embedding kit medium, preparare la formula finale di incorporamento:<ol>
<li>Mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione DDSA (anidride dodecenylsuccinic; miscela A) e mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione NMA (anidride methylnadic; miscela B). Lasciare entrambe le miscele A e B mescolare per almeno 20 minuti agitando con un agitatore magnetico.</li>
		<li>Immediatamente prima dell'uso mescolare la miscela A e B e aggiungere l'acceleratore DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) nella proporzione di 1.5-2.0% del volume totale della miscela. Si noti che la soluzione DPM-30 dovrebbe essere misurata proprio per evitare il blocco da diventando di colore scuro e fragili. Tutti i prodotti chimici resina sono tossici; prestare particolare attenzione per evitare il contatto con la pelle o per inalazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando provette da 1,5 mL, lavare segmenti del nervo con PBS e iniziare il processo di disidratazione collocando i segmenti del nervo in acetone/distillata diversi passaggi dell'acqua: 30%, 60%, 90%, concentrazioni per 10 minuti ciascuno, quindi in 100% di acetone 3 volte per 10 minuti ciascuno.  Si noti che l'etanolo può essere utilizzato al posto di acetone.</li>
	<li>Per l'infiltrazione di resina, posizionare i segmenti del nervo in una miscela di 1 parte della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min, poi in una miscela di 2 parti della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min , e infine posto il nervo segmenti in finale l'incorporamento di miscela per 30 min.</li>
	<li>Mettere i segmenti del nervo in incorporamento stampi in gomma siliconica (ci hanno usato Lunghezza 106 mm x 71 mm di larghezza x profondità mm 7; bloccare Dimensione Lunghezza 11 mm x 6 mm di larghezza x 3 mm di profondità). Aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, facendo attenzione a coprire i segmenti di intero nervo evitando bolle d'aria. Lasciare lo stampo contenente segmenti di nervo con la resina per polimerizzare a 60 ° C durante la notte.</li>
</ol>3. sezionamento di ultramicrotomo
<ol><li>Preparare la lama di vetro usando un coltellinaio di vetro (Figura 1B) e fare vetro coltelli con barche (Figura 1), che vengono utilizzati per raccogliere le sezioni del nervo che galleggia sull'acqua distillata.</li>
	<li>Posizionare blocchi nervosi resina incorporato nel supporto ultramicrotomo con il trapezio lato rivolto verso l'alto. Utilizzando l'ambito di ultramicrotomo, tagliare qualsiasi eccesso di resina che circonda il tessuto nervoso e rendere il blocco di affrontare una forma trapezoidale e come vicino alla superficie longitudinale del nervo possibile usando una lama di taglio singolo, come una lama di rasoio. Non penetrano la superficie longitudinale del segmento del nervo, che è riconoscibile per la sua colorazione scura di tetrossido di osmio. Nota: Rimozione della resina in eccesso riduce l'area della resina essere sezionato e migliorare le prestazioni di lama e taglio nei passaggi successivi.</li>
	<li>Utilizzando l'ultramicrotomo, rendere più sezioni trasversali sufficiente esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del tessuto del nervo usando un coltello di vetro normale. Una volta fatto questo, passare a un coltello di vetro cui barca è riempito con acqua distillata a temperatura ambiente e regolare l'ultramicrotomo a 1-2 μm per tagliare sezioni sottili.</li>
	<li>Trasferimento sezioni sottili galleggiante dalla barca di coltello di vetro a una goccia d'acqua deionizzata su vetrino con anello in metallo (Figura 1). A secco diapositive contenente sezioni passando più volte sopra una fiamma per pochi secondi, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. Macchia secche sezioni immediatamente con toluidina blu o conservare a temperatura ambiente per diversi giorni prima della colorazione. Nota: Sezioni possono essere asciugati anche utilizzando una piastra scalda a 60 ° C per 15 min. Un lento processo di essiccazione rende liscia le sezioni.</li>
</ol>4. blu di toluidina colorazione
<ol><li>Preparare la soluzione di 1% di blu di toluidina sciogliendo 2 g di borato di sodio in 100 mL di acqua deionizzata, quindi aggiungere 1 g di blu di toluidina e mescolare fino a scioglimento. Filtrare la soluzione utilizzando carta da filtro (dimensione dei pori: 11 µm) e mantenere la soluzione in un flacone opaco a temperatura ambiente fino a due settimane.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di plastica o micro pipetta, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina nella parte superiore le sezioni del nervo e lasciare per 20-30 s.</li>
	<li>Lavare via tutte le soluzione di blu di toluidina in eccesso delicatamente immergendo i vetrini in acqua deionizzata vaschetta e ripetere 3 - 4 volte fino a quando le sezioni sono chiare. Asciugare i vetrini almeno 15 min a 60 ° C o una notte a temperatura ambiente e poi coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio regolare. Esaminare le diapositive montate immediatamente o conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Esaminare sotto un microscopio chiaro. Un obiettivo ad immersione X 100 è consigliato per immagini dettagliate utilizzate per calcolare i rapporti di g.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio13. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando il ...

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori1. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.
Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose4,,5,6 chiare . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 18567ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche8. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi10. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.
Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione 11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) 11,13,14,15 .
La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni16. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.
Oltre alla macchiatura17blu di toluidina, un argento che macchia il metodo18 e di colorazione tricromica di Masson4 utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati4. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.
Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso19. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.
Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura20. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato di Dulbco</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>blu di toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato di sodio decaidrato</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Kit di terreno per inclusione epossidica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Per regolare il pH fissativo di Trump</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tetrossido di osmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro vetrini, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio per microscopio in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Prodotti</td><td>RMC MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta conica</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di vetro da 4 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Per il taglio del blocco di resina</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>70944</td><td>Per la raccolta di sezioni sottili</td></tr><tr><td>di resina Strisce di coltelli in vetro ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Forno da 100 Watt</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Whatman Carta da filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in plastica da 3 mL</td><td>Kit microchirurgico Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr> Strumenti di <tr><td></td><td>precisione</td><td></td><td></td>mondiali</tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Olympus Doppia</td><td></td><td></td><td>telecamera CCD a colori e monocromatica, DP80</td></tr></tbody></table>

blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamenti...

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della lesione e della rigenerazione dei nervi periferici, come ad esempio qual è la morfometria di un nervo periferico, quanti assoni sono presenti, qual è lo stato di mielinizzazione e c'è tessuto fibrotico presente? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione ad alta risoluzione delle caratteristiche nervose. Inizia posizionando un ratto anestetizzato in posizione prona sulla parte superiore di un tappetino di dissezione.Posizionare un cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2%. Per garantire un'adeguata profondità di anestesia, testare gli animali per verificare la presenza di ritiro del pedale e i riflessi palpebrali delle zampe posteriori. Una volta raggiunta un'adeguata profondità di anestesia, radere i peli degli arti posteriori e sterilizzare le aree rasate con etanolo al 70%.Palpare il femore per identificare la posizione corretta per l'incisione. Il femore si trova appena prossimalmente al segmento più accessibile del nervo sciatico. Dopo aver praticato un'incisione di due o tre centimetri nella pelle lungo l'arto posteriore dal ginocchio fino al grande trocantere, individuare il piano tra il muscolo bicipite femorale e il muscolo grande gluteo.Quindi utilizzare le forbici da microdissezione per separare la fascia sottostante ed esporre due o tre centimetri del nervo sciatico sottostante. Usa un divaricatore per allargare lo spazio tra i due muscoli. Con una pinza sottile e forbici dell'iride separa accuratamente il nervo dal tessuto connettivo circostante, facendo molta attenzione a non comprimere o tagliare il nervo.Quindi, copri il nervo esposto con il fissativo di Trump e lascia riposare per 10 minuti. Se necessario, posizionare una garza sotto la zampa posteriore per migliorare l'angolo in modo da poter aggiungere più fissante nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 minuti e ripetere questo passaggio altre due volte.Al microscopio da dissezione, tagliare il nervo sciatico da entrambi i lati usando le forbici da dissezione fine, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo. Mettere immediatamente le sezioni nervose in provette da 15 ml contenenti il fissativo di Trump e fissarle a quattro gradi Celsius per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 ore. Dopo la fissazione, rimuovere con cura il grasso rimanente e i tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa cinque millimetri di lunghezza.I segmenti nervosi possono essere separati in diversi tubi etichettati. Immergere i segmenti nervosi in tetrossido di osmio al 2% appena preparato per due ore. Utilizzando un kit di inclusione epossidica, preparare la miscela di inclusione finale.Mescolare il mezzo di inclusione epossidico con la soluzione DDSA e mescolare il mezzo di inclusione epossidico con la soluzione NMA. Mescolare entrambe le soluzioni per almeno 20 minuti con un agitatore magnetico. Immediatamente prima dell'uso, combinare il DPM dell'acceleratore con la soluzione B e quindi combinarlo con la soluzione A in modo che la proporzione finale dell'acceleratore sia compresa tra uno virgola cinque e il 2% del volume totale.Trasferire i segmenti nervosi in provette da cinque millilitri in un punto e dopo il lavaggio con PBS, iniziare il processo di disidratazione sostituendo il PBS con concentrazioni crescenti di acetone e acqua distillata per 10 minuti ciascuno poi in acetone al 100% tre volte per 10 minuti ciascuno. Un passaggio critico è la disidratazione dei tessuti. L'acqua e la resina non interagiranno, quindi l'acqua rimasta nel tessuto non verrà infiltrata dalla resina lasciando buchi nella sezione privi di qualità istologiche.Per l'infiltrazione di resina, posizionare prima i segmenti nervosi in una miscela uno a uno di miscela di inclusione e acetone al 100% per 30 minuti. Dopo 30 minuti, trasferire gli spicchi in una miscela due a uno di miscela per incorporare e acetone al 100% per 30 minuti. Posizionare i segmenti nervosi in stampi per incorporare gomma siliconica e aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, assicurandosi di coprire l'intero segmento nervoso evitando bolle d'aria.Lasciare polimerizzare la resina a 60 gradi Celsius per una notte. Posizionare un blocco di resina con il nervo incorporato nel supporto dell'ultramicrotomo con il lato trapezoidale rivolto verso l'alto. Durante la visualizzazione attraverso l'ultramicrotomo, utilizzare una lama a taglio singolo per tagliare la resina in eccesso che circonda il tessuto nervoso.Non penetrare la superficie longitudinale del segmento nervoso che è riconoscibile per la sua colorazione scura da tetrossido di osmio. Con un semplice coltello di vetro sull'ultramicrotomo, crea più sezioni trasversali per esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del nervo. Fatto ciò, passa a un coltello di vetro con la barca piena di acqua distillata a temperatura ambiente e regola l'ultramicrotomo a uno o due micron per tagliare sezioni sottili.Usa un anello di metallo per trasferire sezioni sottili galleggianti dalla barca del coltello di vetro a una goccia di acqua deionizzata su uno scivolo di vetro. Un altro passaggio critico è durante il trasferimento della sezione sottile dal coltello di vetro allo scivolo. Queste sezioni sottili sono molto fragili e possono rompersi o piegarsi.Dopo il sezionamento, asciugare le sezioni sulle guide passando più volte una slitta su una fiamma, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente per diversi giorni se non immediatamente colorati con blu di toluidina. Per colorare le sezioni nervose, utilizzare una pipetta di plastica o un micropipettatore per aggiungere una goccia di soluzione blu di toluidina sulla parte superiore delle sezioni nervose.Dopo 20-30 secondi, risciacquare tutto l'eccesso di soluzione blu di toluidina immergendo delicatamente i vetrini in un barattolo di acqua deionizzata, ripetendo tre o quattro volte fino a quando le sezioni non sono chiare. Asciugare i vetrini per almeno 15 minuti a 60 gradi Celsius o per una notte a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, aggiungere un normale mezzo di montaggio e coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.Infine, esaminare le sezioni montate al microscopio ottico. Si consiglia una lente a immersione in olio 100X per immagini dettagliate per calcolare i rapporti g. Le sezioni del nervo sciatico incorporate in un terreno di resina e colorate con blu di toluidina hanno mostrato immagini nitide con risoluzione ottimale all'aumento dell'ingrandimento da 10X a 20X, 40X e 60X.Questo metodo preserva la struttura nervosa e consente l'imaging ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento che facilita la misurazione di diversi parametri come il rapporto g, che è il rapporto tra il diametro dell'assone, indicato dalla freccia etichettata B, e il diametro totale della fibra, etichettato A.Una varietà di fattori può portare a sezioni nervose periferiche non ottimali, inclusa la presenza di crepe nella sezione a causa di una manipolazione impropria del nervo. Possono verificarsi anche buchi nella sezione a causa di una disidratazione insufficiente. Un altro possibile errore nella procedura è il piegamento delle sezioni, che può essere rimediato utilizzando anelli di inoculazione per il trasferimento delle sezioni sul vetrino.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la quantificazione degli assoni, per rispondere a ulteriori domande, come qual è il grado di rigenerazione in un nervo rigenerativo? Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere sezioni nervose periferiche da uno a due micron per valutare la morfometria nervosa.

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Una combinazione di tecniche differenti per massimizzare la raccolta dati dal tessuto del mouse è presentato.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Questo video mostra la tecnica di colorazione di sezioni nervose periferiche di ratto trattate con tetrossido di osmio incorporate in resina utilizzando il blu di toluidina. Le sezioni nervose colorate aiutano a visualizzare le strutture sottili dei nervi periferici.

Colorazione blu di toluidina delle sezioni nervose periferiche: una tecnica per colorare le fibre nervose mieliniche per la visualizzazione della struttura nervosa periferica

Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.

Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane

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Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Il protocollo per l'imaging longitudinale dinamico e selettivo lesione laser di terminazioni nervose in topi transgenici giornalista è presentato.

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Le malattie demielinizzanti possono essere modellate negli animali mediante l'applicazione focale di lisolecitina nel SNC. Una singola iniezione di lisolecitina nel midollo spinale del topo produce una lesione che si ripara spontaneamente nel tempo. L'obiettivo è studiare i fattori coinvolti nella de- e rimielinizzazione e testare agenti per migliorare la riparazione.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

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La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

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Impara la colorazione con blu di toluidina per sezioni di nervo periferico incastonate in resina. Questo metodo consente la visualizzazione ad alta risoluzione della morfologia, della mielinizzazione e della rigenerazione del nervo sciatico nel ratto.

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

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