Name: Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri l'immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola con microscopia a forza atomica. Questo metodo consente di studiare interazioni proteiche con precisione nanometrica.

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TB e HG riconosce un sostegno finanziario attraverso il Consiglio europeo della ricerca "Cellufuel, Advanced Grant n. 294438". HCS riconosce il sostegno finanziario del Ministero federale per formazione e ricerca attraverso le Proteine di Technofunktionale di Innovationsallianz (TeFuProt), SS riconosce finanziari di sostegno dal Ministero bavarese per scienza ed educazione attraverso il focus della ricerca "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Ringraziamo Conny Hasselberg-Christoph e Martina Hörig per supporto tecnico

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy%3A+Optical+Tweezers%2C+Magnetic+Tweezers+and+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy: Optical Tweezers, Magnetic Tweezers and Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy%2C+a+Powerful+Tool+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy, a Powerful Tool in Microbiology.</a> Journal of Bacteriology. 184 (19), 5205-5213 (2002).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+as+a+Multifunctional+Molecular+Toolbox+in+Nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy as a Multifunctional Molecular Toolbox in Nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Single+Molecular+Recognition+Events+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Single Molecular Recognition Events Using Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticky+Microbes%3A+Forces+in+Microbial+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sticky Microbes: Forces in Microbial Cell Adhesion.</a> Trends in Microbiology. 23 (6), 376-382 (2015).</li>
<li>Yakovenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FimH+Forms+Catch+Bonds+That+Are+Enhanced+by+Mechanical+Force+Due+to+Allosteric+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FimH Forms Catch Bonds That Are Enhanced by Mechanical Force Due to Allosteric Regulation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (17), 11596-11605 (2008).</li>
<li>Casillas-Ituarte, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Polymorphisms+in+the+Fibronectin-Binding+Repeats+of+Fibronectin-Binding+Protein+A+Affect+Bond+Strength+and+Fibronectin+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Polymorphisms in the Fibronectin-Binding Repeats of Fibronectin-Binding Protein A Affect Bond Strength and Fibronectin Conformation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8797-8810 (2017).</li>
<li>Hilleringmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Streptococcus+Pneumoniae+TIGR4+Pili%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Streptococcus Pneumoniae TIGR4 Pili.</a> The EMBO Journal. 28 (24), 3921-3930 (2009).</li>
<li>Izore, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Host+Cell+Recognition+by+the+Pilus+Adhesin+from+Streptococcus+Pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Host Cell Recognition by the Pilus Adhesin from Streptococcus Pneumoniae.</a> Structure. 18 (1), 106-115 (2010).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), a010215(2013).</li>
<li>Henderson, B., Nair, S., Pallas, J., Williams, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+a+Multidomain+Host+Adhesin+Targeted+by+Bacterial+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: a Multidomain Host Adhesin Targeted by Bacterial Fibronectin-Binding Proteins.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (1), 147-200 (2011).</li>
<li>Becke, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+Two-Domain+Binding+Mode+of+Pilus-1+Tip+Protein+RrgA+of+Streptococcus+Pneumoniae+to+Fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy Reveals Two-Domain Binding Mode of Pilus-1 Tip Protein RrgA of Streptococcus Pneumoniae to Fibronectin.</a> ACS nano. 12 (1), 549-558 (2018).</li>
<li>Herman-Bausier, P., Pietrocola, G., Foster, T. J., Speziale, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Activates+the+Capture+of+Human+Plasminogen+by+Staphylococcal+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Activates the Capture of Human Plasminogen by Staphylococcal Fibronectin-Binding Proteins.</a> mBio. 8 (5), e01067(2017).</li>
<li>Vitry, P., Valotteau, C., Feuillie, C., Bernard, S., Alsteens, D., Geoghegan, J. A., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-Induced+Strengthening+of+the+Interaction+between+Staphylococcus+aureus+Clumping+Factor+B+and+Loricrin%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Force-Induced Strengthening of the Interaction between Staphylococcus aureus Clumping Factor B and Loricrin.</a> mBio. 8 (6), e01748(2017).</li>
<li>Milles, L. F., Schulten, K., Gaub, H. E., Bernardi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+Extreme+Mechanostability+in+a+Pathogen+Adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of Extreme Mechanostability in a Pathogen Adhesin.</a> Science. 359 (6383), 1527-1533 (2018).</li>
<li>Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Receptor-Ligand+Systems+of+the+Cellulosome+with+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Receptor-Ligand Systems of the Cellulosome with AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).</li>
<li>Stetter, F. W., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Single+Molecule+Adhesion+by+Atomic+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).</li>
<li>Schmidt, S. W., Christ, T., Glockner, C., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Coupling+Chemistry+Linking+Carboxyl-Containing+Organic+Molecules+to+Silicon+Oxide+Surfaces+under+Acidic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Simple Coupling Chemistry Linking Carboxyl-Containing Organic Molecules to Silicon Oxide Surfaces under Acidic Conditions.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 26 (19), 15333-15338 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-Based%2C+Site-Specific+and+Covalent+Immobilization+of+Biomolecules+for+Single-Molecule+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thiol-Based, Site-Specific and Covalent Immobilization of Biomolecules for Single-Molecule Experiments.</a> Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polyproteins+and+Receptor-Ligand+Complexes%3A+The+Current+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy on Polyproteins and Receptor-Ligand Complexes: The Current Toolbox.</a> Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Ott, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+Polypeptide+Linkers+for+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> ACS nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New%2C+Simple+Method+for+Linking+of+Antibodies+to+Atomic+Force+Microscopy+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New, Simple Method for Linking of Antibodies to Atomic Force Microscopy Tips.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (4), 1176-1184 (2007).</li>
<li>Kufer, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Immobilization+of+Recombinant+Fusion+Proteins+with+hAGT+for+Single+Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Covalent Immobilization of Recombinant Fusion Proteins with hAGT for Single Molecule Force Spectroscopy.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 35 (1), 72-78 (2005).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schilcher, K., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Individual+Antibody-Antigen+Recognition+Events+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Individual Antibody-Antigen Recognition Events by Atomic Force Microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (8), 3477-3481 (1996).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Schilcher, K., Gruber, H. J., Schindler, H. Conjugation of Biomolecules to Tip and Probe Surfaces for Molecular Recognition in Atomic Force Microscopy. European Journal of Cell Biology. 74, 72(1997).</li>
<li>Riener, C. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267003011061">Heterobifunctional Crosslinkers for Tethering Single Ligand Molecules to Scanning Probes.</a> Analytica Chimica Acta. 497 (1-2), 101-114 (2003).</li>
<li>Metwalli, E., Haines, D., Becker, O., Conzone, S., Pantano, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Mono-%2C+Di-%2C+and+Tri-Aminosilane+Treated+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Mono-, Di-, and Tri-Aminosilane Treated Glass Substrates.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 298 (2), 825-831 (2006).</li>
<li>Beyer, D., Knoll, W., Ringsdorf, H., Elender, G., Sackmann, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040609095084568">Covalently Attached Polymer Mono- and Multilayers on Silanized Glass Substrates.</a> Thin Solid Films. 284, 825-828 (1996).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 13 - Silane Coupling Agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 535-548 (2013).</li>
<li>Howarter, J. A., Youngblood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Silica+Silanization+by+3-aminopropyltriethoxysilane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Optimization of Silica Silanization by 3-aminopropyltriethoxysilane.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (26), 11142-11147 (2006).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 6 - Heterobifunctional Crosslinkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 299-339 (2013).</li>
<li>Sehgal, D., Vijay, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+High+Efficiency+of+Water-Soluble+Carbodiimide-Mediated+Amidation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for the High Efficiency of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Amidation.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 87-91 (1994).</li>
<li>Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Thiol-Gold+Interactions+Towards+the+Efficient+Strength+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying Thiol-Gold Interactions Towards the Efficient Strength Control.</a> Nature Communications. 5, 4348(2014).</li>
<li>Butt, H. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0957-4484/6/1/001/meta">Calculation of Thermal Noise in Atomic Force Microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1367-2630/1/1/006/meta">Single Molecule Force Spectroscopy by AFM Indicates Helical Structure of Poly(ethylene-glycol) in Water.</a> New Journal of Physics. 1 (1), 6(1999).</li>
<li>Gugutkov, D., Gonzalez-Garcia, C., Rodriguez Hernandez, J. C., Altankov, G., Salmeron-Sanchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Activity+of+the+Substrate-Induced+Fibronectin+Network%3A+Insight+Into+the+Third+Dimension+Through+Electrospun+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Biological Activity of the Substrate-Induced Fibronectin Network: Insight Into the Third Dimension Through Electrospun Fibers.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (18), 10893-10900 (2009).</li>
<li>Rief, M., Oesterhelt, F., Heymann, B., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polysaccharides+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy on Polysaccharides by Atomic Force Microscopy.</a> Science. 275 (5304), 1295-1297 (1997).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Marszalek, P. E., Oberhauser, A. F., Pang, Y. P., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+Elasticity+Governed+by+Chair-Boat+Transitions+of+the+Glucopyranose+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide Elasticity Governed by Chair-Boat Transitions of the Glucopyranose Ring.</a> Nature. 396 (6712), 661-664 (1998).</li>
<li>Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Stability+of+Single+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical Stability of Single DNA Molecules.</a> Biophysical Journal. 78 (4), 1997-2007 (2000).</li>
<li>Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force-Clamp+Experiments+Reveal+Kinetics+of+Mechanically+Activated+Silyl+Ester+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force-Clamp Experiments Reveal Kinetics of Mechanically Activated Silyl Ester Hydrolysis.</a> ACS nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).</li>
<li>Schmidt, S. W., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Strength+of+the+Silicon-Carbon+Bond+Observed+Over+Three+Decades+of+Force-Loading+Rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dynamic Strength of the Silicon-Carbon Bond Observed Over Three Decades of Force-Loading Rates.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (11), 3664-3668 (2008).</li>
<li>Schmidt, S. W., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Activated+Rupture+of+Single+Covalent+Bonds%3A+Evidence+of+Force+Induced+Bond+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanically Activated Rupture of Single Covalent Bonds: Evidence of Force Induced Bond Hydrolysis.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (13), 5994-5999 (2011).</li>
<li>Schmidt, S. W., Pill, M. F., Kersch, A., Clausen-Schaumann, H., Beyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Induced+Silyl+Ester+Cleavage+Under+Acidic+Conditions+Investigated+by+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy+in+the+Force-Ramp+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Mechanically Induced Silyl Ester Cleavage Under Acidic Conditions Investigated by AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy in the Force-Ramp Mode.</a> Faraday Discussions. 170, 357-367 (2014).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+Forces+of+Titin+and+Fibronectin+Domains+Directly+Measured+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unfolding Forces of Titin and Fibronectin Domains Directly Measured by AFM.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 481, 129-136 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Poiché l'introduzione del AFM basato SMF, si è evoluto in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente intra e forze intermolecolari di singole proteine, acidi nucleici e altre biomolecole3,4,5. Per esperimenti riusciti di SMF, una superficie appropriata strategia di accoppiamento è un prerequisito. Per sondare le forze intramolecolari in polimeri naturali e sintetici, i polimeri possono essere accoppiati direttamente alla superficie del substrato e AFM punta36,38,39,40,41. Per l'indagine sulle interazioni inter-molecolari, quali legami molecolari, tuttavia, si consiglia di utilizzare molecole linker flessibile come etero-bifunzionale PEG linker, o catene polipeptidiche, per collegare i partner di interazione alla punta dell'AFM e la superficie del substrato, al fine di consentire il corretto orientamento dei partner di legame, per superare le forze di superficie a corto raggio e per evitare la denaturazione e svolgersi delle proteine21,22,23, 24,25,26,27,42. Abbiamo pertanto descritto un protocollo semplice e dritto in avanti per l'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro ammine primarie accessibile tramite etero-bifunzionale PEG distanziali.
Abbiamo dimostrato la sua applicabilità con l'indagine dell'interazione delle forze tra adesina RrgA da S. pneumoniae e la proteina della matrice extracellulare Fn, come recentemente descritto dettagliatamente altrove13.
La chimica di superficie è ben consolidata e approcci analizzati e simili sono stati utilizzati con successo in molteplici funzioni SMF esperimenti19,42,43,44,45. Il silylether utilizzato per accoppiare il polimero silano sulla superficie, è soggetto a idrolisi. Il grado di idrolisi dipende dalla quantità di legami silossanici formata, che può essere controllato durante il processo di silanizzazione. Se forze di interazione elevate (≥ 1000 pN) sono attesi durante le misurazioni di SMF, la silanizzazione dovrebbe essere eseguita tramite deposizione di vapore-fase30 che provoca la formazione di uno strato continuo di silossani. Per quanto riguarda molti esperimenti (ad esempio, molte proteine – interazioni della proteina), le forze di interazione sono nel range di pochi centinaia pN e la procedura descritta, in quale silossano formazione è effettuato dalla deposizione da una fase acquosa e non associati organo-silani minuziosamente vengono lavati via con etanolo (punto 1.1.7) seguita da trattamento con calore (passaggio 1.1.8), è sufficienti.
Un altro passo fondamentale è quello di lavare il restante EDC e molecole di NHS fuori la superficie (punto 1.2.3), come gli avanzi porterà all'attivazione di gruppi carbossilici sulle proteine. Questo può sia risultato in reticolazione delle proteine sulla superficie stessa, che può alterare la loro funzionalità o covalenza coppia attivato proteine ad altre proteine sulla superficie opposta. Questo può portare a delle proteine tra la superficie e la punta AFM, che si traduce in alta rottura forze eventualmente accompagnate dal dominio dispiegarsi di bloccaggio (Vedi Figura 3b, traccia 1, 4 e 5, dispiegarsi di domini Fn)46. Lo stesso problema può verificarsi, se gli esteri NHS attivi del distanziatore PEG sono lasciati insaturi. Pertanto, l'incubazione con soluzione salina tamponata Tris si consiglia (punto 1.2.6), come l'ammina primaria di Tris disseta i restanti gruppi amminici reattivi.
Seguendo il protocollo graduale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sul vetro silanizzata superficie (vedere Figura 2), lasciando una forma dimerica della proteina. Questo assomiglia Fn´s struttura in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici di campione37precedenti-AFM. Inoltre, si ottiene una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM, che genera un valore di destinazione del ~ 20% di eventi di interazione ben definiti durante le misurazioni di SMF (Figura 3 e Figura 4). Un altro modo elegante per controllare la quantità di molecole accoppiato all'estremità del substrato e a sbalzo di campione oltre variando i tempi di concentrazione e/o incubazione di proteina, è la combinazione di silano-agenti con diversi gruppi funzionali secondarie. Modificando il rapporto di gruppi reattivi della proteina, che si estende da PEG-polimero, il numero delle proteine immobilizzate può essere controllata15,16,17,18.
Il protocollo descritto qui è utilizzabile anche per immobilizzare altre molecole contenenti di -NH2 o essere regolato alle proteine di coppia a altra superficie di ossido di silicio oltre nitruro di silicio e vetro. A seconda della struttura della proteina, il gruppo carbossilico reattiva di ammina sono modificabili per un gruppo reattivo solfidrilico (ad es., maleimide o ortho-piridil disolfuro) per accoppiare la proteina tramite il suo libero – gruppi SH. Per Fn, questo comporta un orientamento predefinito13,17,20.
In sintesi, questo protocollo può essere registrato per soddisfare diversi requisiti ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre gli esperimenti di spettroscopia di forza singola molecola.

Al lato di pinzette ottiche e magnetiche, la forza atomica (AFM) microscopio1,2 è emersa come uno strumento utile per analizzare e manipolare molecole e sonda di loro proprietà e funzioni, come la loro risposta a una forza esterna3 ,4. Al contrario ai metodi come l'analisi dell'immunosorbente collegata enzima (ELISA), superficie risonanza plasmonica (SPR) o cristallo di quarzo (QCM) microbilancia configurazioni, AFM permette di misurare le interazioni nella singola molecola (SMF)5 e il livello di singola cellula (SCFS)6 . Queste tecnologie hanno reso informazioni preziose in meccanismi di associazione come i legami di cattura trovati per l'interazione della proteina di e. coli pilus che ripete FimH con mannosio7o il tandem β-cerniera formata da proteine leganti Fn da S. aureus legandosi a Fn8. Siamo stati recentemente in grado di dimostrare che l'adesina pilus-1 RrgA9,10 dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 è in grado di legarsi al fibronectin12 con i suoi due domini terminal. Ciò ha rivelato un nuovo meccanismo di associazione di due domini che differisce dal tandem β-cerniera e può attivare piliated pneumococchi a formare e mantenere una transitoria host contatto al fibronectin-contenenti superfici13.
Il successo di SMF esperimenti dipende criticamente l'immobilizzazione funzionale e nativo di biomolecole su superfici solide e punte dell'AFM. Come forze elevate possono verificarsi durante le misurazioni di SMF, le proteine preferibilmente dovrebbero essere accoppiate covalentemente alla superficie. Ci sono un gran numero di metodi differenti di accoppiamento per l'immobilizzazione di proteine e altre biomolecole, come pure le cellule intere su superfici solide (inorganiche), nano-particelle e altri dispositivi descritti nella letteratura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Questi protocolli fanno spesso uso di sostanze pericolose, sono difficili da eseguire e/o richiedono attrezzature speciali (ad es., plasma cleaner). Un modo semplice per molecole di coppia al vetro è quello di attaccare uno strato più spesso di polimero di reticolanti eterobifunzionali con un gruppo Silano-reattivo su un lato e un gruppo dell'ammina-reattivo loro altro lato. A seconda dell'applicazione, gli agenti di accoppiamento possono essere costituito da catene di idrocarburi flessibili di lunghezza variabile, ad es., polietilenglicole (PEG). Essi sopprimere interazioni non specifiche delle superfici modificate (ad es., idrofobiche, elettrostatiche e van-der-Waals interazioni) e può fornire la libertà rotazionale molecola accoppiati.
Qui, descriviamo un protocollo generale per l'accoppiamento covalente di proteine che contengono uno o più gruppi amminici liberi (-NH2) superfici di vetro e nitruro di silicio AFM suggerimenti tramite un eterobifunzionali etossi Silano-PEG-carbossilico (-COOH). Questo protocollo può essere usato negli esperimenti di SMF, che è esemplificato basati sull'interazione di RrgA e la proteina della matrice extracellulare Fn (vedere la Figura 1 per una panoramica).
Il primo passo è la silanizzazione della superficie28,29,30,31. Coinvolge l'idrolisi dei gruppi etossi dell'agente di accoppiamento al fine di formare gruppi SiOH altamente reattivi. Questi possono reagire con i gruppi SiOH sul substrato. In una condensazione primaria passo, questi legami di idrogeno forma silanoli e diffondere sul substrato. In una reazione di condensazione secondario (che di solito richiede calore o vuoto per rimuovere l'acqua), si formano legami silossanici. In questo modo un strato di covalenza allegato organo-silani.
Il secondo passo è l'accoppiamento delle proteine per il funzionale (-COOH) gruppi che si estendono dal polimero32. In primo luogo, l'acido viene convertito in un estere N-hydroxysuccinimid (NHS) reattivo intermedio, che è acquisito attraverso la consolidata NHS/EDC (1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimid chimica33 e subisce sostituzione nucleofila Infine formare un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine.
In questo modo, RrgA è stato accoppiato a punte dell'AFM nitruro di silicio e umano Fn per substrati di vetro in un orientamento casuale e le loro forze di interazione sono stati analizzati a livello di singola molecola. I nostri risultati indicano che la chimica di superficie descritto conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante le misurazioni di SMF. Questa chimica riduce interazioni aspecifiche sfondo, è soggetto a variazioni poco durante l'acquisizione dei dati e pertanto è perfettamente adatta per gli esperimenti di SMF precisi.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; purezza analitica</td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>doppiamente distillata</tr><tr><td>Etanolo</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99,8 %; purezza analitica</td></tr><tr><td>Etossi silano polietilenglicole acido</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-Idrossisuccinimide</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; per sintesi</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Sonda molecolare es. Fibronectina, plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Molecola sonda es. RrgA</td><td></td><td></td><td>Prodotto in laboratorio</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)-amminometano</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; Grado tampone</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becherers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliavetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore a gas inerte</td> Microscopio invertito <td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software JPK NanoWizard SPM e DP</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno da laboratorio</td><td>Legante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro spatola</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td><td></td>per microcentrifuga</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Marca</td><td></td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>piastre</td><td></td><td></td><td></td>di Petri</tr><tr><td>pHmetro</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 & micro; l, 50-200 &micro; l, 100-1000&nbsp; &micro; l</td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantilever in nitruro di silicio - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S Costante di</td><td></td><td>molla &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Bagno di sonicazione</td><td>Barattolo</td> di colorazione Bandelin <td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td><td></td> di agitazione</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech scienza salviette di precisione</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Spettro di mercurio con l'energia primaria a 254&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td></td><td></td><td></td>a vuoto</tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td><td></td>a vuoto</tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta di pesatura</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Negli ultimi anni, la microscopia a forza atomica (AFM) basata spettroscopia della forza singola molecola (SMF) estesa la nostra comprensione delle proprietà molecolari e funzioni. Ci ha dato l'opportunità di esplorare una molteplicità di meccanismi biofisici, ad esempio, come batterica adhesins bind per i ricevitori di superficie di host in modo più dettagliato. Tra gli altri fattori, il successo di SMF esperimenti dipende il funzionale e nativo di immobilizzazione di biomolecole di interesse su superfici solide e punte dell'AFM. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'accoppiamento covalente di proteine per superfici di silicio utilizza silano-PEG-carboxyls e la chimica di N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ben consolidata in ordine per esplorare l'interazione di pilus-1 adesina RrgA dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matrice extracellulare della proteina fibronectina (Fn). I nostri risultati indicano che la funzionalizzazione superficiale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM a sbalzo, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante SMF misure e ha rivelato che RrgA si lega a Fn con una forza media di 52 pN. Il protocollo può essere regolato a coppia tramite sito specifico gratuito gruppi tiolici. Questo si traduce in un orientamento predefinito di proteina o molecola ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre le SMF.

Il protocollo descritto qui risultati in un'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro accessibile ammine primarie con orientazione casuale (Figura 1). Figura 2 Mostra un'immagine AFM di una superficie di vetro silanizzata con (a sinistra) e senza (a destra) Fn immobilizzato, registrata dopo la disidratazione dei campioni sotto una leggera corrente di azoto. Lo strato di polimero Silano presenta solo piccole ondulazioni superficiali con un'altezza di circa 2-5 nm (Figura 2, destra), mentre sulla superficie funzionalizzata con Fn, circa 10 nm alta Fn molecole sono apparente (Figura 2, sinistra). In primi piani, la struttura dimerica della Fn possa essere riconosciuta. Le molecole di Fn sembrano essere compatto con un'altezza di 4-5 nm sopra il rivestimento di superficie di PEG e una lunghezza di ~ 120 nm (vedere inserti).
Per studiare le forze di interazione di RrgA con Fn, che recentemente è stato descritto dettagliatamente dal nostro gruppo13, RrgA è stato accoppiato ad una punta AFM del nitruro di silicio e Fn umano al substrato di vetro (Figura 3a). Figura 3 Mostra la punta rappresentanza curve di separazione dell'interazione di RrgA con Fn registrato ad una velocità di trazione di 1 µm s-1. La chimica delle superfici usata ha condotto ad un'interazione di basso fondo ed eventi di interazione ben sagomato singola (o doppia) (Figura 3a), che sono stati montati utilizzando un worm extensible come modello di catena (eWLC) (curve rosse). Visualizzazione dei risultati della fit (forza di rottura e - lunghezza, Vedi Figura 4) dimostra che dopo aver superato interazioni aspecifiche tra punta AFM e substrato e si estende il linker di PEG (&gt; 70 nm), fino a ~ 19% delle curve di forza ha mostrato la rottura eventi con una rottura media forza per la RrgA - interazione Fn di ~ 52 pN contemporaneamente a una distanza punta-campione di circa 100 nm. In contrasto, una chimica di superficie inapplicabile (qui, tempra omesso con Tris buffered saline Figura 3b) ostacolerà una chiara valutazione degli eventi singola interazione a causa di interazioni aspecifiche, la proteina più vincolanti (traccia 2 e 3) e/o accoppiamento covalente di proteine tra la superficie del campione e la punta AFM a sbalzo. Questo porta a forze di rottura alta (traccia 1) eventualmente accompagnate dal dispiegarsi dei domini della proteina (Fn) (traccia 4 e 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figura 1: panoramica sopra la chimica delle superfici. L'idrolisi di etossi Silano-PEG-carbossilico è seguita dal processo di condensazione sulla superficie del vetro idratata e la formazione di legami incrociati silossano. La reazione di EDC con gruppi carbossilici si traduce in un reattivo o- acylisourea, un mediatore dell'ammina-reattivo con un tempo di dimezzamento estremamente breve in soluzione acquosa (idrolisi). L'intermedio è stabilizzato dalla formazione di un estere NHS che subisce sostituzione nucleofila per infine formano un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figura 2: Immobilizzazione del fibronectin su un vetro substrato tramite eterobifunzionali etossi Silano PEG agente accoppiante carbossilico. Immagini AFM di vetro funzionalizzato superfici con (a sinistra) e senza (a destra) FN. numeri indicare singole molecole di Fn, che sono distribuite in modo omogeneo sulla superficie del substrato (inserti). Le molecole adottano una struttura dimerica e compatta con un'altezza di 4-5 nm sopra il piolo di rivestimento e una lunghezza di &gt; 100 nm. Questo assomiglia alla struttura del Fn in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici, per esempio, mica precedenti-AFM (barra della scala di intarsi = 500 nm)37. Di seguito l'AFM immagini sono profili di altezza lungo le linee indicate nelle immagini AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figura 3: illustrazione di un esperimento di SMF e rappresentante forzare le curve di distanza di RrgA - interazione Fn. (a) RrgA e Fn erano covalentemente via Silano etossi eterobifunzionali PEG agente accoppiante carbossilico di un AFM al nitruro di silicio a sbalzo punta e una superficie di vetro, rispettivamente. Rappresentante SMFS forza distanza curve ottenute per RrgA - interazione Fn a una velocità di retrazione di 1 µm s-1 con l'immobilizzazione descritto di RrgA e Fn sono mostrate. Curve rosse rappresentano i PF di extensible vite senza fine-come catena applicati per ottenere forze di rottura e lunghezze. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano 201813. (b) rappresentante SMFS forza curve distanza ottenute per il RrgA - interazione Fn senza tempra con tamponata Tris Salino. In questo caso, l'ammina primaria di Tris era assente così che rimangono attivi esteri NHS sono stati lasciati insaturi durante l'esperimento. Ciò ha condotto alla proteina multi vincolanti (traccia 2 e 3) e il bloccaggio delle proteine tra la superficie e la punta AFM che ha provocato la rottura alta forza accompagnato da (Fn-) dominio spiegamento (tracce 1, 4 e 5; notare le diverse scale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figura 4: distribuzione di forza e lunghezza del singolo RrgA - interazioni Fn. Rottura forza e corrispondenti istogrammi di lunghezza di rottura ottenuti da RrgA - misurazioni di interazione a Fn SMF (n = 1400) ad una velocità di retrazione di 1 µm s-1. Gli istogrammi rivelano un più probabile rottura forza fMP di 51,6 pN (Gauss adatta, linea nera) e un accumulo di lunghezze di rottura circa 100 nm. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biofisico, come ad esempio la forza di una singola proteina nelle interazioni proteiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per immobilizzare un'ampia gamma di biomolecole diverse. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la gestione della sonda a sbalzo del microscopio a forza atomica e il funzionamento del microscopio a forza atomica stesso possono essere impegnativi.Per iniziare, indossa guanti resistenti agli acidi, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Sotto una cappa aspirante, utilizzare l'isopropanolo in salviette di precisione prive di lanugine. Rimuovere la polvere grossolana e le impurità da diversi vetrini.Trasferire i vetrini puliti in un barattolo in piedi riempito con acido cloridrico diluito con acqua distillata doppiamente. Sigillare il barattolo con un apposito coperchio e metterlo in un bagno ad ultrasuoni per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire le sonde a sbalzo AFM in nitruro di silicio su un vetrino pulito con la punta rivolta verso l'alto.Trasferire il vetrino in una camera impermeabile ai raggi UV e irradiarlo con luce ultravioletta dall'alto per almeno 90 minuti. Dopodiché, sostituire l'acido cloridrico nel barattolo di colorazione con acqua distillata doppiamente, facendo attenzione a non lasciare asciugare la superficie del vetro. Sigillare il barattolo con il coperchio e rimetterlo nel bagno ad ultrasuoni per altri 10 minuti.Nel frattempo, sciogliere l'acido etilenetilenglicole etossisilano in una miscela di etanolo e acqua distillata due volte fino a una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Sigillare ermeticamente questa soluzione per evitare l'evaporazione dell'etanolo. Quando è pronta, versare la soluzione di silano in due piastre di Petri separate.Posizionare i vetrini puliti in una capsula di Petri e il cantilever nell'altra. Utilizzando il parafilm, sigillare ermeticamente entrambe le piastre per evitare l'evaporazione dell'etanolo. Incubare le piastre fisse per 90 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, utilizzare tre becher consecutivi contenenti etanolo puro per lavare sia il cantilever che i vetrini. Posizionare il cantilever lavato su un vetrino pulito. Trasferire i vetrini funzionalizzati nel barattolo di colorazione.Polimerizzare entrambi in forno a 110 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, conservare i campioni di vetro silanizzato e il cantilever in un essiccatore sottovuoto per un massimo di una settimana. Quando si è pronti per iniziare l'immobilizzazione casuale delle proteine, preparare una soluzione contenente EDC e NHS in soluzione salina standard tamponata con fosfato come indicato nel protocollo di testo.Coprire i vetrini rivestiti di silano con questa soluzione. Posizionare le sonde a sbalzo silanizzate in una goccia della soluzione ECD/NHS. Incubare entrambi per 10 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, sciacquare sia il cantilever che i vetrini in tre becher consecutivi per lavare completamente via l'eccesso di EDC/NHS. Trasferire i vetrini attivati in una piastra di Petri dotata di un fazzoletto umido. Aggiungere una goccia della soluzione proteica desiderata nell'area attivata da EDC/NHS dei vetrini e sigillare la capsula di Petri utilizzando il parafilm e incubare le sonde a temperatura ambiente.Aggiungere una goccia della soluzione proteica desiderata alla scatola a sbalzo dotata di un fazzoletto umido. Quindi, lavare accuratamente le sonde a sbalzo con PBS. Posizionare le sonde nella gocciolina della scatola e chiudere la scatola.Incubare le sonde a temperatura ambiente. Successivamente, segnare l'area della gocciolina proteica sul lato posteriore dei vetrini. Lavare accuratamente sia i vetrini che le sonde a sbalzo utilizzando tre becher consecutivi riempiti di PBS.Posizionare le sonde lavate in un recipiente contenente soluzione salina tamponata con Tris per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare accuratamente i vetrini e le sonde a sbalzo con PBS. Conservali in piastre di Petri separate coperte di PBS fino al momento dell'uso.Fissare un vetrino appena pulito sul portacampioni AFM e coprirlo con un tampone PBS. Quindi, fissare la sonda a sbalzo preparata al supporto a sbalzo e posizionarla nella testa AFM. Bagnare accuratamente il cantilever con una goccia di tampone PBS.Spostare lentamente il cantilever verso la superficie di calibrazione fino a quando il cantilever non è completamente immerso nel tampone PBS, ma ancora lontano dalla superficie di calibrazione. Utilizzare il microscopio ottico con vista dall'alto o il microscopio invertito dell'AFM per posizionare il laser sul lato posteriore del cantilever. Posizionare il punto laser vicino all'estremità del cantilever vicino a dove si trova la punta e regolare la posizione sul fotodiodo del rivelatore a quattro quadranti dell'AFM in modo tale che il raggio laser riflesso sia posizionato al centro del fotodiodo.Quindi, apri il gestore di calibrazione nel software AFM. Per iniziare a calibrare la sensibilità del cantilever e la costante della molla, avvicinarsi con cautela alla superficie del substrato e registrare una curva di distanza della forza. Montare una linea retta sulla parte più ripida della curva della forza di retrazione in cui la punta è a contatto con la superficie del substrato per determinare la sensibilità della leva ottica.Ritrarre il cantilever dalla superficie del campione e registrare diversi spettri di rumore termico con il cantilever ad almeno 100 micron dalla superficie e montare un oscillatore armonico, fornito dal software AFM, agli spettri di rumore termico per determinare la costante elastica del cantilever. Successivamente, ritrarre lentamente il cantilever ed estrarlo dalla soluzione. Rimuovere la superficie di vetro utilizzata per la calibrazione a sbalzo e sostituirla con la superficie del campione contenente le proteine immobilizzate.Spostare lentamente il cantilever umido verso la superficie del campione fino a quando il cantilever non è completamente coperto dal tampone PBS, ma ancora lontano dalla superficie del substrato. Avvicinati alla superficie e registra più curve di forza e distanza in diversi punti della superficie del campione con una forza di contatto di 250 piconewton, un tempo di contatto di un secondo, una lunghezza di retrazione di due micrometri e una velocità di retrazione di un micrometro al secondo. Nel software di elaborazione dati, selezionare l'icona Apri batch di Force Scan' per aprire i file della curva di forza misurata.Selezionare l'icona Ricalibra la flessione a V regolando la sensibilità nella costante della molla per convertire la flessione a sbalzo in forza direttamente proporzionale. Quindi, selezionare l'icona Sottrazione linea di base' per sottrarre la linea di base del canale di retrazione in una regione della curva di forza lontana dalla superficie, che imposta anche il livello di forza zero. Selezionare l'icona Determinazione del punto di contatto per definire il punto in cui la punta entra in contatto con il campione.Selezionare l'icona Separazione del campione della punta per convertire il segnale di altezza in separazione del campione della punta. Oltre a sottrarre la posizione del punto di contatto, questo sottrae la flessione a sbalzo per calcolare la distanza tra la superficie del substrato e la punta dell'AFM. Seleziona l'icona Adatta un modello di catena polimerica e scegli il modello Catena a vite senza fine estensibile per esaminare le tracce di distanza della forza per i picchi di forza che si verificano a lunghezze di rottura superiori a 70 nanometri.Ordina le interazioni non specifiche e applica il modello a catena estensibile a forma di verme ai picchi selezionati. In questo studio, le proteine sono immobilizzate covalentemente con orientamento casuale attraverso le loro ammine primarie accessibili. Un'immagine AFM dello strato di polimero silanizzato mostra solo piccole ondulazioni superficiali con altezze comprese tra circa due e cinque nanometri.Tuttavia, si è visto che la superficie funzionalizzata con fibronectina ha molecole di fibronectina alte circa 10 nanometri. Un'ispezione più attenta rivela che la struttura dimerica delle molecole può essere riconosciuta. Queste molecole sembrano essere compatte, con un'altezza di quattro o cinque nanometri sopra il rivestimento superficiale del PEG e una lunghezza di circa 120 nanometri.Vengono quindi studiate le forze di interazione di RRGA con la fibronectina. Le curve rappresentative di separazione dei campioni a punta registrate a una velocità polare di un micron al secondo hanno mostrato una bassa interazione di fondo ed eventi di interazione ben sagomati, che vengono poi adattati, utilizzando un modello a catena estensibile a forma di verme. La rappresentazione grafica dei risultati di questo adattamento mostra che, dopo aver superato le interazioni superficiali non specifiche nell'allungamento dei linker PEG, fino al 19% delle curve di forza presenta eventi di rottura con una forza di rottura media di 52 piconewton per l'interazione con la fibronectina RRGA e a una distanza del campione di punta di circa 100 nanometri.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, a seconda di impostazioni come il tempo di contatto o la velocità di retrazione, i dati della spettroscopia di forza di una singola molecola contengono più informazioni e che questo protocollo può essere solo un primo passo verso l'analisi completa dei dati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni di singole molecole, può anche essere utilizzato per studiare le interazioni a livello di singola cellula. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettroscopia di forza di una singola cellula per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come interagiscono le cellule intere con le superfici rivestite di proteine.Non dimenticare che lavorare con acidi e luce UV può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti resistenti agli acidi e una camera impermeabile ai raggi UV.

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Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

Qui, presentiamo un protocollo per coniugare il monomero proteico mediante enzimi formando polimeri proteici con una sequenza controllata e immobilizzandolo sulla superficie per studi di spettroscopia di forza singola molecola.

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

L'attaccamento covalente delle molecole della sonda alle punte a sbalzo a forza atomica (AFM) è una tecnica essenziale per lo studio delle loro proprietà fisiche. Questo ci permette di determinare la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza dei polimeri tramite la spettroscopia a forza singola a singola molecola basata su AFM con elevata riproducibilità.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Scopri l'immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola con microscopia a forza atomica. Questo metodo consente di studiare interazioni proteiche con precisione nanometrica.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

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