Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biofisico, come ad esempio la forza di una singola proteina nelle interazioni proteiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per immobilizzare un'ampia gamma di biomolecole diverse. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la gestione della sonda a sbalzo del microscopio a forza atomica e il funzionamento del microscopio a forza atomica stesso possono essere impegnativi.

Per iniziare, indossa guanti resistenti agli acidi, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Sotto una cappa aspirante, utilizzare l'isopropanolo in salviette di precisione prive di lanugine. Rimuovere la polvere grossolana e le impurità da diversi vetrini.

Trasferire i vetrini puliti in un barattolo in piedi riempito con acido cloridrico diluito con acqua distillata doppiamente. Sigillare il barattolo con un apposito coperchio e metterlo in un bagno ad ultrasuoni per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire le sonde a sbalzo AFM in nitruro di silicio su un vetrino pulito con la punta rivolta verso l'alto.

Trasferire il vetrino in una camera impermeabile ai raggi UV e irradiarlo con luce ultravioletta dall'alto per almeno 90 minuti. Dopodiché, sostituire l'acido cloridrico nel barattolo di colorazione con acqua distillata doppiamente, facendo attenzione a non lasciare asciugare la superficie del vetro. Sigillare il barattolo con il coperchio e rimetterlo nel bagno ad ultrasuoni per altri 10 minuti.

Nel frattempo, sciogliere l'acido etilenetilenglicole etossisilano in una miscela di etanolo e acqua distillata due volte fino a una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Sigillare ermeticamente questa soluzione per evitare l'evaporazione dell'etanolo. Quando è pronta, versare la soluzione di silano in due piastre di Petri separate.

Posizionare i vetrini puliti in una capsula di Petri e il cantilever nell'altra. Utilizzando il parafilm, sigillare ermeticamente entrambe le piastre per evitare l'evaporazione dell'etanolo. Incubare le piastre fisse per 90 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, utilizzare tre becher consecutivi contenenti etanolo puro per lavare sia il cantilever che i vetrini. Posizionare il cantilever lavato su un vetrino pulito. Trasferire i vetrini funzionalizzati nel barattolo di colorazione.

Polimerizzare entrambi in forno a 110 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, conservare i campioni di vetro silanizzato e il cantilever in un essiccatore sottovuoto per un massimo di una settimana. Quando si è pronti per iniziare l'immobilizzazione casuale delle proteine, preparare una soluzione contenente EDC e NHS in soluzione salina standard tamponata con fosfato come indicato nel protocollo di testo.

Coprire i vetrini rivestiti di silano con questa soluzione. Posizionare le sonde a sbalzo silanizzate in una goccia della soluzione ECD/NHS. Incubare entrambi per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, sciacquare sia il cantilever che i vetrini in tre becher consecutivi per lavare completamente via l'eccesso di EDC/NHS. Trasferire i vetrini attivati in una piastra di Petri dotata di un fazzoletto umido. Aggiungere una goccia della soluzione proteica desiderata nell'area attivata da EDC/NHS dei vetrini e sigillare la capsula di Petri utilizzando il parafilm e incubare le sonde a temperatura ambiente.

Aggiungere una goccia della soluzione proteica desiderata alla scatola a sbalzo dotata di un fazzoletto umido. Quindi, lavare accuratamente le sonde a sbalzo con PBS. Posizionare le sonde nella gocciolina della scatola e chiudere la scatola.

Incubare le sonde a temperatura ambiente. Successivamente, segnare l'area della gocciolina proteica sul lato posteriore dei vetrini. Lavare accuratamente sia i vetrini che le sonde a sbalzo utilizzando tre becher consecutivi riempiti di PBS.

Posizionare le sonde lavate in un recipiente contenente soluzione salina tamponata con Tris per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare accuratamente i vetrini e le sonde a sbalzo con PBS. Conservali in piastre di Petri separate coperte di PBS fino al momento dell'uso.

Fissare un vetrino appena pulito sul portacampioni AFM e coprirlo con un tampone PBS. Quindi, fissare la sonda a sbalzo preparata al supporto a sbalzo e posizionarla nella testa AFM. Bagnare accuratamente il cantilever con una goccia di tampone PBS.

Spostare lentamente il cantilever verso la superficie di calibrazione fino a quando il cantilever non è completamente immerso nel tampone PBS, ma ancora lontano dalla superficie di calibrazione. Utilizzare il microscopio ottico con vista dall'alto o il microscopio invertito dell'AFM per posizionare il laser sul lato posteriore del cantilever. Posizionare il punto laser vicino all'estremità del cantilever vicino a dove si trova la punta e regolare la posizione sul fotodiodo del rivelatore a quattro quadranti dell'AFM in modo tale che il raggio laser riflesso sia posizionato al centro del fotodiodo.

Quindi, apri il gestore di calibrazione nel software AFM. Per iniziare a calibrare la sensibilità del cantilever e la costante della molla, avvicinarsi con cautela alla superficie del substrato e registrare una curva di distanza della forza. Montare una linea retta sulla parte più ripida della curva della forza di retrazione in cui la punta è a contatto con la superficie del substrato per determinare la sensibilità della leva ottica.

Ritrarre il cantilever dalla superficie del campione e registrare diversi spettri di rumore termico con il cantilever ad almeno 100 micron dalla superficie e montare un oscillatore armonico, fornito dal software AFM, agli spettri di rumore termico per determinare la costante elastica del cantilever. Successivamente, ritrarre lentamente il cantilever ed estrarlo dalla soluzione. Rimuovere la superficie di vetro utilizzata per la calibrazione a sbalzo e sostituirla con la superficie del campione contenente le proteine immobilizzate.

Spostare lentamente il cantilever umido verso la superficie del campione fino a quando il cantilever non è completamente coperto dal tampone PBS, ma ancora lontano dalla superficie del substrato. Avvicinati alla superficie e registra più curve di forza e distanza in diversi punti della superficie del campione con una forza di contatto di 250 piconewton, un tempo di contatto di un secondo, una lunghezza di retrazione di due micrometri e una velocità di retrazione di un micrometro al secondo. Nel software di elaborazione dati, selezionare l'icona Apri batch di Force Scan' per aprire i file della curva di forza misurata.

Selezionare l'icona Ricalibra la flessione a V regolando la sensibilità nella costante della molla per convertire la flessione a sbalzo in forza direttamente proporzionale. Quindi, selezionare l'icona Sottrazione linea di base' per sottrarre la linea di base del canale di retrazione in una regione della curva di forza lontana dalla superficie, che imposta anche il livello di forza zero. Selezionare l'icona Determinazione del punto di contatto per definire il punto in cui la punta entra in contatto con il campione.

Selezionare l'icona Separazione del campione della punta per convertire il segnale di altezza in separazione del campione della punta. Oltre a sottrarre la posizione del punto di contatto, questo sottrae la flessione a sbalzo per calcolare la distanza tra la superficie del substrato e la punta dell'AFM. Seleziona l'icona Adatta un modello di catena polimerica e scegli il modello Catena a vite senza fine estensibile per esaminare le tracce di distanza della forza per i picchi di forza che si verificano a lunghezze di rottura superiori a 70 nanometri.

Ordina le interazioni non specifiche e applica il modello a catena estensibile a forma di verme ai picchi selezionati. In questo studio, le proteine sono immobilizzate covalentemente con orientamento casuale attraverso le loro ammine primarie accessibili. Un'immagine AFM dello strato di polimero silanizzato mostra solo piccole ondulazioni superficiali con altezze comprese tra circa due e cinque nanometri.

Tuttavia, si è visto che la superficie funzionalizzata con fibronectina ha molecole di fibronectina alte circa 10 nanometri. Un'ispezione più attenta rivela che la struttura dimerica delle molecole può essere riconosciuta. Queste molecole sembrano essere compatte, con un'altezza di quattro o cinque nanometri sopra il rivestimento superficiale del PEG e una lunghezza di circa 120 nanometri.

Vengono quindi studiate le forze di interazione di RRGA con la fibronectina. Le curve rappresentative di separazione dei campioni a punta registrate a una velocità polare di un micron al secondo hanno mostrato una bassa interazione di fondo ed eventi di interazione ben sagomati, che vengono poi adattati, utilizzando un modello a catena estensibile a forma di verme. La rappresentazione grafica dei risultati di questo adattamento mostra che, dopo aver superato le interazioni superficiali non specifiche nell'allungamento dei linker PEG, fino al 19% delle curve di forza presenta eventi di rottura con una forza di rottura media di 52 piconewton per l'interazione con la fibronectina RRGA e a una distanza del campione di punta di circa 100 nanometri.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, a seconda di impostazioni come il tempo di contatto o la velocità di retrazione, i dati della spettroscopia di forza di una singola molecola contengono più informazioni e che questo protocollo può essere solo un primo passo verso l'analisi completa dei dati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni di singole molecole, può anche essere utilizzato per studiare le interazioni a livello di singola cellula. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettroscopia di forza di una singola cellula per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come interagiscono le cellule intere con le superfici rivestite di proteine.

Non dimenticare che lavorare con acidi e luce UV può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti resistenti agli acidi e una camera impermeabile ai raggi UV.