Name: Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri come misurare la proteolisi a singola molecola con pinzette magnetiche per studiare l'effetto del carico meccanico sul collagene. Questo metodo ad alto rendimento consente di derivare parametri cinetici con quantità minime di substrato.

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Questo lavoro è stato supportato dal Career Award Burroughs Wellcome a livello di interfaccia scientifico (ARD), il National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award 1-DP2-OD007078 (ARD), il William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e la Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Giovane Predoctoral (JC). Gli autori ringraziano James Spudich prestito attrezzature per microscopia.

1. Cella di flusso Preparazione <ol><li> Vetrini coprioggetto (# 1.5, 22x22 mm e 22x40 millimetri, VWR) vengono puliti con ultrasuoni. <ol><li> Aggiungere i coprioggetti ad un piccolo contenitore di vetro capace di contenere coprioggetto e montaggio nel sonicatore (vedi punto 2). </li><li> Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un bagno sonicatore per 20 minuti. </li><li> Eliminare l'isopropanolo e sciacquare i coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata prodotta da un apparato Barnsted MilliQ o un dispositivo simile. Riempire il contenitore con acqua e ultrasuoni per 20 minuti. </li><li> Dopo sonicazione, asciugare i coprioggetti in un flusso di filtrata, priva di polvere nell'aria. Utilizzare solo i coprioggetto che appaiono puliti (cioè senza sbavature). </li><li> Delicatamente i coprioggetti fiamma per alcuni secondi per pulirli di eventuali residui di polvere e umidità: passano i coprioggetti attraverso una fiamma del gas prodotto con un becco Bunsen, facendo attenzione a non deformare il coprioggetti a causa del calore in eccesso. Questa fase rimuove superficie residuacontaminanti. </li></ol></li><li> Utilizzando del nastro biadesivo scotch, collegare i due coprioggetti insieme. Tagliare il nastro ~ 3 cm di lunghezza e 0,3 cm di larghezza. Fissare il nastro su coprioggetto 22x40 millimetri lasciando un canale di 1,6 cm al centro. Utilizzare un puntale per premere delicatamente verso il basso sul vetrino per garantire che il nastro è correttamente rispettati. </li></ol> 2. Magnetic Tweezers Setup e calibrazione <ol><li> Pinzette magnetiche erano installazione utilizzando permanenti magneti in terre rare come descritto in precedenza 10,12. Un alluminio L-staffa è stato costruito con un foro 1 mm di diametro e montato su un verticale z traduttore (Thorlabs) per modulare l'altezza delle pinzette. Due permanenti magneti in terre rare sono stati attaccati alla staffa su entrambi i lati del foro per creare la trappola magnetica (Figura 1). </li><li> Preparazione del DNA: DNA fago lambda marcato al suo 5 'e 3' termina con biotina e digossigenina (IDT DNA, San Diego, CA) è stato usato per calibrare il MAGpinzette magnetiche. <ol><li> Mescolare 50 pl di 4 nM λ-DNA con 2 pl di 40 nM biotina oligonucleotide coniugato e scaldare a 60 ° C per 10 minuti. Poi, lentamente raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Aggiungere DNA ligasi secondo le specifiche del costruttore e legare a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Aggiungere 2 microlitri di 400 nM oligonucleotide digossigenina coniugato ed incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. </li><li> Aggiungere 1,5 microlitri di 10 mM ATP e continuare ligazione dell'oligonucleotide digossigenina coniugato alla λ-DNA per 3 ore. </li><li> Rimuovere gli oligonucleotidi in eccesso e la DNA ligasi con 100 filtri di spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un totale di 1000 volte scambio tampone in tampone TE è sufficiente a rimuovere i oligonucleotidi eccesso. Nota: è importante non utilizzare velocità di rotazione&gt; 500xG perché porterà al taglio del DNA. </li><li> Esaminare un campione di DNA tramite elettroforesi su un gel di agarosio 0,7% per garantire che il DNA is non denaturato o tranciati. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA. L'uso di un NanoDrop UV-Vis spettrofotometro (Thermo Scientific) è raccomandato poiché il volume del campione disponibile può essere molto piccolo. </li></ol></li><li> Preparare celle di flusso come descritto nella sezione 1. </li><li> Per il fissaggio del DNA alla cella a flusso, aggiungere anticorpo anti-digossigenina (pecora IgG; 1 mg mL -1; Bioscience Roche, Mannheim, Germania) e consentono di aderire alla superficie di vetro per 15 minuti. </li><li> Passivazione della superficie della cella di flusso per prevenire non-specifica incollaggio di DNA aggiungendo 2 mg mL -1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. </li><li> Ripetere il punto 2.5. </li><li> Aggiungere 50 pM di fuctionalized λ-DNA e permettono di allegare al vetrino per 15 minuti. </li><li> Lavare via il DNA in eccesso con PBS 1x. </li><li> Aggiungere streptavidina-perle rivestite superparamagnetiche (1 perline micron = 2 mg mL -1; 2,8 perle um = 20 pg mL -1 </li><li> Lavare via perline in eccesso con PBS 1x. </li><li> Magnetic Tweezers calibrazione <ol><li> Spostare i magneti permanenti ad una posizione che è lontano dalla superficie del campione (&gt; 15 mm). </li><li> Posizionare la cella preparato flusso nel microscopio. </li><li> Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella di flusso. </li><li> Scegliere il piano focale di λ-DNA perline funzionalizzati concentrandosi sui talloni da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretta è quella in cui le perle desiderati hanno un centro luminoso. </li><li> Prendete un video del movimento del tallone a 80 Hz o maggiore di 500 frames. </li><li> Spostare il magnete vicino alla superficie del campione. Per distanze superiori a 5 mm, si muovono in incrementi di 1 mm. Per distanze comprese tra 1 e 5 mm, si muovono in incrementi di 0,5 mm. Per distanze inferiori a 1 mm, si muovono in incrementi di 0,25 mm. </li><li> Ripetere i punti 2.11.5 e 2.11.6 ad ogni nuova posizione del magnete. </li><li> Per ciascun datoimpostare, monitorare il centro delle sfere utilizzando una vestibilità 2D gaussiana. </li><li> Calcolare la forza tramite le fluttuazioni browniani utilizzando: </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 1"> dove k B T è l'energia termica Boltzmann, L è la lunghezza di λ-DNA, e &lt;x 2&gt; è la varianza in posizione centroide. <ol start="10"><li> Confermare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un fit Lorentzian spettro di potenza al fine di trovare la frequenza attenuazione. Forza applicata è legata alla frequenza di attenuazione dalla relazione: </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 2"> Dove 0 ƒ è la frequenza rolloff, a è il raggio tallone, e μ è la viscosità del fluido 12. </li></ol> 3. Collagene Allegato Peptide alle celle di flusso Per fornire un esempio concreto per l'applicazione del nostro metodo, si descrive un recente lavoro nostro laboratorio che caratterizza la proteolisi di un peptide trimerico modello collagene. Prevediamo che questo approccio generale può essere diffusamente applicate ad altre proteine ​​e polinucleotidi. <ol><li> Il peptide modello collagene è costituito da un N-terminale 6x His-tag per la purificazione, seguita da un tag 5x myc, (GPP) 10 per applicare formazione tripla elica, il collagene a1 residui 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), che costituiscono la MMP- 1 sito di riconoscimento, la sequenza foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ed un C-terminale per facilitare KKCK etichettatura con biotina-maleimide. Foldon deriva dal fago T4-fibritin proteina, e stabilizza trimeri modello collagene quando fuse sia nella N - o C-terminale 13,14. </li><li> Il peptide collagene e MMP-1 proteine ​​sono state espresse e purificate come descritto in precedenza 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Aggiungere anti-myc (15 pg ml -1) alla cella a flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire l'anti-myc per attaccarsi alla superficie della cella di flusso. </li><li> Passivazione della cella di flusso per prevenire non-specifica fissaggio di proteine ​​usando 5 mg mL -1 BSA allo stesso modo come descritto al punto 2.5. </li><li> Aggiungere 150 pM peptide di collagene e permettono di allegare l'anticorpo tramite il tag myc per 45 minuti. </li><li> Lavare via collagene in eccesso con tampone PBS. </li><li> Aggiungi perle rivestite di streptavidina superparamagnetiche perle (1 micron = 2 mg ml -1 e 2,8 perline micron = 20 mg ml -1) e consentire loro di attaccare le molecole di collagene per 45 minuti. Le perle di 1 micron deve essere diluito fino alla concentrazione desiderata in PBS. Le perle 3 um deve essere separato dalla soluzione tramite magneti, poi risolubilizzato in PBS. Questo processo deve essere ripetuto 3 volte. Abbiamo notato che questo passaggio è essenziale per la get le 3 perle micron di legarsi alla superficie-peptide immobilizzato collagene. </li></ol> 4. Forza proteolisi Assay <ol><li> Una volta che la cella a flusso è assemblato con il peptide collagene e biglie magnetiche, l'immagine cella di flusso nella trappola magnetica in basso, ~ 1 forza pN. Nella nostra esperienza, una sottopopolazione delle perle è talvolta debolmente aderire alla superficie in un modo non specifico. L'applicazione della forza modesta assicura che queste perle sono liberati. </li><li> Aggiungere enzima attivato alla cella a flusso. In questo caso MMP-1 è stato pre-attivato con l'aggiunta di 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubate a 37 ° C per 3 ore. L'attivazione è stata verificata mediante SDS-PAGE. </li><li> Appena la cella di flusso viene nuovamente introdotto nell'apparecchio magnetico pinzette, registrare un video estende alcuni campi di vista, tipicamente ottenendo diverse centinaia perline allegate. Questo sarà t = 0. </li><li> Ripetere lo stesso processo di registrazione di diversi campi di vista (mentre tornava tO lo stesso campo di vista) in punti regolari di tempo, fino a tutte le perline si staccano o non proteolisi più è percepibile. </li><li> Kinetic analisi dei dati <ol><li> Contare le perline nei vari campi di vista a tempi diversi e loro media. Normalizza il numero di perle dividendo il numero medio di perline in ogni punto temporale per il numero di perle di t = 0. In questo modo siamo in grado di confrontare i tassi di proteolisi da diversi esperimenti, perché il numero assoluto di perline sarà diverso da esperimento esperimento. </li><li> Tracciare il rapporto in funzione del tempo. In questo caso, abbiamo montato un decadimento esponenziale più una costante. </li></ol><img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 3"> dove ƒ (t) è il rapporto delle perline allegate (o molecole di collagene unproteolyzed), t è il tempo, a è la frazione di sfere collegate da una ritenuta collagene, b è il tasso costante di decadimento, ecè la frazione di perle che sono attaccate in modo non specifico. <ol start="3"><li> Lo stesso esperimento viene ripetuto a varie forze e MMP-1 concentrazioni di chiarire l'effetto della forza sulla proteolisi collagene di MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Il protocollo sopra descrive un nuovo uso di pinzette magnetico (Figura 1) per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica. Abbiamo calibrato le pinzette di 1 um e 3 perline micron utilizzando sia l'ampiezza delle fluttuazioni osservati browniani e calcolo del roll-off frequenza diverse posizioni magneti (Figura 2). In esperimenti di proteolisi delle forze, la configurazione è simile tranne che il DNA viene sostituito con collagene (figure 3, 4). Il numero normalizzato di perline rimanenti possono essere tracciate in funzione del tempo per trovare le tariffe proteolisi (Figura 5), e questo processo può essereripetuto per diverse concentrazioni degli enzimi e forze. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica del processo di calibrazione magnetico trappola (non in scala). Due magneti permanenti terre rare creare un campo magnetico che tira sulla superparamagnetico tallone. Tradurre il magnete su e giù regola la forza applicata. Le perle vengono esposte con un convenzionale in campo chiaro microscopio con la luce che passa attraverso un forellino fra i due magneti Inset:. Immagine ripresa con un obiettivo 40x aria. I taglienti, macchie rotonde corrispondono ai talloni attaccati alla superficie coverslip. Gli out-of-focus oggetti sono perle indipendenti. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Grafici della forza calibrata in funzione della distanza dal magnete superficie del campione di 1 micron (sinistra) e 2,8 micron (a destra) di tallones. I dati sono stati adatti alla funzione empirica <img alt="Equazione4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione4"> , Dove x è la distanza dal magnete. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 per le perle 1 um e uno = 140, b = 3,10 e c = 1,86 per le perle 3 micron. Questi valori sono specifici per il nostro strumento specifico e geometria sperimentale, e ciascuno strumento deve essere calibrato individualmente. Le barre di errore in ciascun punto rappresenta una variabilità ~ 10% in forza applicata su una base di tallone tallone, a causa della variabilità di dimensioni del tallone. La forza applicata è proporzionale al volume delle perline, e il volume tallone varia ~ 9% rispetto alla media (secondo le specifiche del costruttore). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Forza test di setup proteolisi (non in scala). Il modello trimero collagene è attaccato alla superficie del vetrino via mYC / anti-myc coniugazione. Le perle rivestite con streptavidina superparamagnetici sono attaccati alle trimeri collagene tramite un legame di biotina-streptavidina. Attivato MMP-1 tagli il collagene nel tempo, causando le perline a staccarsi dalla superficie e si allontana dal piano focale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Cartone schematica di proteolisi in funzione del tempo. La vignetta mostra un campo di campione di vista nel corso del tempo, come accade proteolisi. Nel tempo, MMP-1 tagli il collagene e le perline staccare e allontanarsi dal piano focale sotto l'influenza del campo magnetico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Tassi di proteolisi Figura 5. Dipendono forza applicata 16. Vengono mostrati i dati raccolti a 1,0 pN (3 uM MMP-1, nero), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rosso) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magoNTA). I tassi di proteolisi parametri (fit) sono: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), e 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). La frazione di perle unproteolyzed a tempi lunghi (&gt; 15 minuti) resta pressoché costante a ~ 0,25 in diversi esperimenti. Le barre di errore corrispondono alle statistiche Poisson che riflette il numero di osservazioni in ogni punto. L'errore ad ogni tempo di perline n n è 1/2. L'errore nella frazione di perline attaccate è stato calcolato errore propagation.1 perle um sono stati utilizzati per pN 1,0 e 6,2 esperimenti pN e 2,8 um perline sono state usate per gli esperimenti pN 13.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie ​​potenziali. Limitazioni di pinzette magnetiche Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui descritte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Micro copertura in vetro # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro copertura in vetro # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anticorpo anti-myc </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-acetato Aminophenylmercuric </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimmide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marcate con biotina oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> Digossigenina marcato oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> Collagenegene del peptide </td><td> DNA 2,0 </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard Database plasmide </td><td></td></tr><tr><td> z-traduttore </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servo regolatore di traduttore </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplex singola molecola forza misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali 1, 2 e aterogenesi la guarigione della ferita 3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L&#39;effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile 4-7. Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico 8, 9 microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici 10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell&#39;intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello 12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l&#39;effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l&#39;esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.

In questo articolo si descrivono l&#39;uso di una pinzetta magnetici per studiare l&#39;effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche sono aspetti ubiquitari della fisiologia cellulare, con una rilevanza diretta per la metastasi del cancro1, l'aterogenesi2 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'effetto del carico meccanico sul taglio proteolitico di singole proteine in modo altamente parallelo ed economico. In questa dimostrazione, nel primo passaggio viene esaminato il taglio del collagene da parte della metalloproteasi matriciale uno; i trimers di collagene vengono fissati alla lamella di vetro di una cella a flusso, seguito dal fissaggio di microsfere magnetiche di dimensioni micrometriche alle singole molecole di collagene. Il secondo passaggio consiste nel montare la cella a flusso nell'apparato delle pinze magnetiche e verificare che le microsfere legate in modo non specifico siano state rimosse dalla superficie della lamella.Successivamente, la proteasi viene aggiunta alle cellule a flusso. L'ultimo passaggio consiste nel determinare la velocità di proteolisi monitorando in tempo reale il distacco delle perle. Misurando le velocità di distacco delle perle a diverse concentrazioni di proteasi e forze applicate, è possibile ricavare i parametri cinetici zoologici standard utilizzando quantità minime di substrato e proteasi.Inoltre, questa tecnica fornisce informazioni uniche sull'effetto della forza meccanica sulla velocità di proteolisi e sui cambiamenti strutturali nella proteina substrato che accompagnano il taglio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi come le tracce ottiche T e la microscopia a forza atomica è che questa tecnica è ad alto rendimento ed economicamente vantaggiosa. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla forza efficace sul taglio proteolitico di singole proteine, lo strumento e le tecniche possono essere applicati a un'ampia gamma di problemi biofisici, inclusi l'effetto della forza sul ripiegamento e sulla conformazione delle proteine.Iniziare la preparazione della cella a flusso pulendo i coprioggetti mediante sonificazione. Aggiungere i coprioggetti in un piccolo contenitore di vetro in grado di contenerli e adatto al bagno a ultrasuoni. Riempire il contenitore con isopropanolo e sonificare in un bagno a ultrasuoni per 20 minuti, quindi rimuovere l'isopropanolo e risciacquare i coprioggetti con abbondante acqua deionizzata.Riempire il contenitore con acqua e sottoporlo a sonificazione per 20 minuti. Dopo la sonificazione, asciugare le coprioggetti in un flusso d'aria filtrata priva di polvere. Ispezionare le coprioggetti e utilizzare solo quelle prive di macchie.Passare delicatamente le lamelle attraverso la fiamma di un becco Bunsen per alcuni secondi per rimuovere polvere e umidità residue. Fare attenzione a non deformare la lamella a causa di un eccesso di calore. Questo passaggio elimina i contaminanti superficiali residui.Successivamente, utilizzare nastro adesivo trasparente doppia faccia per unire i due vetrini. Dopo aver tagliato il nastro a una lunghezza di circa tre centimetri e una larghezza di 0,3 centimetri, applicarlo su un vetrino di dimensioni 22 per 40 millimetri, lasciando un canale centrale di 1,6 centimetri. Utilizzare la punta di una pipetta per premere delicatamente sul vetrino, assicurandosi che il nastro sia correttamente aderito.L'apparato delle pinze magnetiche è stato costruito da questo laboratorio utilizzando un supporto a L in alluminio con un foro di un millimetro di diametro, montato su un traslatore verticale Z per regolare l'altezza delle pinze. Due magneti permanenti in terre rare sono stati fissati al supporto su entrambi i lati del foro al fine di generare il gradiente del campo magnetico. Una corretta calibrazione della trappola magnetica è essenziale per questa procedura.Per garantire il successo, utilizziamo due metodi diversi come descritto in questa sezione. Per calibrare la trappola magnetica, utilizzare il DNA precedentemente preparato dal fago Lambda, marcato alle estremità 5' e 3' con biotina e doxigenina, come descritto nel protocollo scritto. Per fissare il DNA alla cella di flusso, riempire innanzitutto la cella di flusso con soluzione di anti-doxigenina e anticorpo e lasciare che l'anticorpo aderisca alla superficie di vetro per 15 minuti.Successivamente, satura la superficie della cella a flusso per prevenire l'adesione non specifica del DNA aggiungendo una soluzione di BSA nella cella a flusso. Nota che per questo passaggio di saturazione e per tutti i passaggi successivi, il volume del reagente aggiunto alla cella a flusso deve essere almeno doppio rispetto al volume della cella a flusso, che in questa dimostrazione è di 75 microlitri; incuba la cella a flusso a temperatura ambiente per 45 minuti.Dopo aver ripetuto questo passaggio, aggiungere 50 pico moli di DNA lambda funzionalizzato e lasciarlo aderire al vetrino per 15 minuti, quindi rimuovere l'eccesso di DNA con un lavaggio in XPBS. Infine, aggiungere le perle superparamagnetiche ricoperte di streptavidina e lasciarle aderire al DNA immobilizzato per 15 minuti. In questa dimostrazione, vengono utilizzate perle da 2,8 micrometri.Rimuovere le perle in eccesso con un lavaggio in XPBS. Successivamente, eseguire la calibrazione dei pinzette magnetiche spostando i magneti permanenti in una posizione lontana dalla superficie del campione. Quindi, posizionare la cella a flusso preparata nel microscopio.Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella a flusso. Scegliere il piano focale delle perle funzionalizzate con DNA Lambda mettendo a fuoco le perle lontane da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretto è quello in cui le perle desiderate presentano un centro luminoso.Registrare un video del movimento delle perline a una frequenza superiore a 80 hertz per 500 fotogrammi. Avvicinare il magnete alla superficie del campione e registrare un video del movimento delle perline a ciascuna posizione. Per distanze superiori a cinque millimetri, spostarsi a incrementi di un millimetro per distanze comprese tra uno e cinque millimetri.Spostarsi a incrementi di 0,5 millimetri per distanze inferiori a un millimetro, spostarsi a incrementi di 0,25 millimetri. Per ogni dataset, tracciare il centro delle perline utilizzando un adattamento gaussiano 2D. Calcolare la forza mediante le fluttuazioni browniane come descritto nella procedura scritta. Verificare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un adattamento spettrale di potenza di Lian.Per determinare la frequenza di distacco, la relazione tra forza applicata e frequenza di distacco può essere individuata nel testo precedente all'attacco del peptide di collagene alle cellule di flusso, esprimere e purificare il peptide di collagene e le proteine MMP1. Iniziare aggiungendo la soluzione di anticorpo anti-MIC alla cella di flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, in modo da permettere all'anticorpo anti-MIC di legarsi alla superficie della cella di flusso. Bloccare la cella di flusso per prevenire l'attacco non specifico delle proteine utilizzando BSA a 5 milligrammi per millilitro. Aggiungere 150 picomolari di peptide di collagene e lasciarlo legare all'anticorpo tramite il marcatore M1 per 45 minuti.Lavare via l'eccesso di collagene utilizzando tampone PBS prima di aggiungere le microsfere di 2,8 micrometri alla cella di flusso. Queste devono essere separate dalla soluzione di microsfere rivestite con streptavidina mediante magneti potenti, quindi risospese in PBS. Questo processo deve essere ripetuto tre volte.Questo passaggio è essenziale per permettere ai microsfera di 2,8 micrometri di legarsi al peptide di collagene immobilizzato sulla superficie. Successivamente, aggiungere microsfera superparamagnetiche ricoperte di streptavidina e lasciarle attaccare alle molecole di collagene per 45 minuti. Una volta assemblata la cella a flusso con il peptide di collagene e le microsfera magnetiche, acquisire un'immagine della cella a flusso nella trappola magnetica.Sotto una forza ridotta, una sottopopolazione delle perle è talvolta debole, aderente alla superficie in modo non specifico. L'applicazione di una forza moderata garantisce che queste perle vengano rilasciate. Aggiungere l'enzima attivato alla cella di flusso.In questo caso, la MMP uno è stata preattivata aggiungendo 3,5 millimolari di PMA e incubata a 37 gradi Celsius per tre ore. Non appena una cella a flusso viene reintrodotto nell'apparato di pinze magnetiche, registrare un video che comprenda alcuni campi visivi, ottenendo tipicamente alcune centinaia di microsfere legate. Questa misurazione corrisponde a tempo uguale a zero.Ripetere lo stesso processo di acquisizione di diversi campi visivi a intervalli di tempo regolari fino a quando tutte le perle si staccano o non si osserva ulteriore proteolisi. I pinzette magnetiche sono state calibrate per perle di un micrometro e di 2,8 micrometri. Utilizzando sia l'entità delle fluttuazioni browniane osservate sia il calcolo della frequenza di attenuazione in corrispondenza di diverse posizioni del magnete negli esperimenti di proteolisi forzata, è possibile tracciare il numero normalizzato di perle rimanenti in funzione del tempo per determinare la velocità di proteolisi.E questo processo può essere ripetuto con diverse concentrazioni di enzimi e forze. I tassi di proteolisi dipendono dalla forza applicata. I tassi di proteolisi sono stati determinati a uno piconewton, 6,2 piconewton e 13 piconewton.La frazione di perle non legate, per tempi superiori a 15 minuti, rimane approssimativamente costante a 0,25 in diversi esperimenti. Nel nostro caso, il saggio ci ha permesso di misurare l'efficienza catalitica della MMP uno in funzione della forza applicata. Analizzando i dati, abbiamo scoperto che l'elica tripla del collagene deve svolgersi localmente prima della proteolisi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque-sei ore se svolta correttamente. È importante ricordare che sono necessarie almeno 30-50 perline per campo visivo per ottenere una buona significatività statistica dei dati. Non dimenticare che un PMA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esperimento è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di guanti, camici da laboratorio e maschere facciali.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'effetto della forza sul taglio proteolitico di singole proteine utilizzando pinze magnetiche. Le pinze magnetiche sono uno strumento eccellente per comprendere esperimenti biofisici a livello di singola molecola. Questa tecnica può essere estesa ad altre combinazioni di proteasi e substrato.Inoltre, tecniche simili possono essere utilizzate per comprendere la dinamica strutturale delle proteine, nonché per studiare altre proteine che si legano o modificano l'RNA e/o il DNA.

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Bioingegneria

Pinzette magnetiche, una potente tecnica di manipolazione singola molecola, possono essere adattati per le misure dirette della torsione (utilizzando una configurazione denominata liberamente orbitante pinzette magnetiche) e coppia (utilizzando una configurazione definita pinzette coppia magnetica) in macromolecole biologiche. Linee guida per l'esecuzione di tali misure sono espresse, comprese le applicazioni allo studio del DNA e associati filamenti nucleo-proteine.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro sperimentale completo per lo studio delle interazioni RNA-proteina utilizzando pinzette ottiche. Sono delineate diverse possibili configurazioni sperimentali, tra cui la combinazione di pinzette ottiche con microscopia confocale.

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

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Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Scopri come misurare la proteolisi a singola molecola con pinzette magnetiche per studiare l'effetto del carico meccanico sul collagene. Questo metodo ad alto rendimento consente di derivare parametri cinetici con quantità minime di substrato.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

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