Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare l'effetto del carico meccanico sulla scissione proteolitica di singole proteine in modo altamente parallelo ed economico. In questa dimostrazione, la scissione del collagene da parte della metalloproteinasi della matrice uno viene esaminata nella prima fase, i trimmer di collagene sono attaccati al vetrino di una cella di flusso, seguita dall'attaccamento di microsfere magnetiche di dimensioni micrometriche alle singole molecole di collagene. Il secondo passo consiste nel montare la cella di flusso nell'apparato delle pinzette magnetiche e verificare che le perle non specificamente attaccate siano state rimosse dalla superficie del vetrino coprioggetti.

Successivamente, la proteasi viene aggiunta alle celle di flusso. Il passaggio finale consiste nel determinare il tasso di proteolisi monitorando il distacco delle perle in tempo reale. Misurando i tassi di distacco delle perle a concentrazioni e forze variabili di proteasi, è possibile derivare parametri cinetici zoologici standard utilizzando piccole quantità di substrato e proteasi.

Inoltre, questa tecnica fornisce informazioni uniche sull'effetto della forza meccanica sulla velocità di proteolisi e sui cambiamenti strutturali nella proteina del substrato che accompagnano la scissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come le tracce ottiche di T e la microscopia a forza atomica, è che questa tecnica è ad alta produttività ed economica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla forza efficace sulla scissione proteolitica di singole proteine, la strumentazione e le tecniche possono essere applicate a un'ampia gamma di problemi biofisici, incluso l'effetto della forza sul ripiegamento e la conferma delle proteine.

Iniziare la preparazione della cella a flusso pulendo i vetrini coprioggetti utilizzando la sonicazione. Aggiungere i vetrini coprioggetti in un piccolo contenitore di vetro in grado di contenerli che si inserisce nell'atore. Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un lavatore per 20 minuti e sciacquare i vetrini coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata.

Riempire il contenitore con acqua e sonicare per 20 minuti. Dopo l'asciugatura della sonicazione, il coperchio scivola in un flusso di aria filtrata e priva di polvere. Ispezionare i vetrini coprioggetto e utilizzare solo quelli privi di macchie.

Fiammeggiare delicatamente i vetrini del coperchio per alcuni secondi per pulirli da eventuali residui di polvere e umidità passando il coperchio. Scivola attraverso una fiamma a gas prodotta da un bruciatore bunsen, facendo attenzione a non deformare il vetrino a causa del calore eccessivo. Questa fase rimuove i contaminanti superficiali residui.

Quindi, usa lo scotch biadesivo per attaccare insieme i due vetrini coprioggetto. Tagliando prima il nastro di circa tre centimetri di lunghezza e 0,3 centimetri di larghezza, attacca il nastro a un vetrino coprioggetto di 22 x 40 millimetri, lasciando un canale di 1,6 centimetri al centro. Utilizzare la punta di una pipetta per premere delicatamente sul vetrino coprioggetto per assicurarsi che il nastro abbia aderito correttamente.

L'apparato per pinzette magnetiche è stato costruito da questo laboratorio utilizzando una staffa a L in alluminio con un foro stenopoico di un millimetro di diametro e montato su un traslatore Z verticale per modulare l'altezza delle pinzette. Due magneti permanenti in terre rare sono stati attaccati alla staffa su entrambi i lati del foro stenopeico per creare il gradiente del campo magnetico. La corretta calibrazione della trappola magnetica è essenziale per questa procedura.

Per garantire il successo, utilizziamo due metodi diversi, come descritto in questa sezione. Per calibrare la trappola magnetica Per la calibrazione, utilizzare DNA precedentemente preparato da fago Lambda, marcato alle sue cinque estremità principali e tre prime con biotina e dossigeno come descritto nel protocollo scritto. Per attaccare prima il DNA alla cella di flusso, riempire la cella di flusso con ossigeno anti-D e soluzione di anticorpi e lasciare che l'anticorpo aderisca alla superficie del vetro per 15 minuti.

Successivamente, ha mangiato la superficie della cella a flusso per prevenire l'adesione non specifica del DNA aggiungendo una soluzione di BSA alla cella a flusso. Si noti che per questa fase di azione e per tutte le fasi successive, il volume del reagente aggiunto alla cella a flusso deve essere almeno doppio. Il volume della cella di flusso, che in questa dimostrazione è di 75 microlitri, incubare la cella di flusso a temperatura ambiente per 45 minuti.

Dopo aver ripetuto questo passaggio, aggiungere 50 pico molari di DNA lambda funzionalizzato e lasciarlo attaccare al vetrino coprioggetti per 15 minuti, lavare via il DNA in eccesso con un XPBS. Infine, aggiungi perle super paramagnetiche rivestite di streptavidina e lasciale attaccare al DNA immobilizzato per 15 minuti. In questa dimostrazione vengono utilizzate perle da 2,8 micrometri.

Lavare via le perline in eccesso con un XPBS. Quindi, eseguire la calibrazione delle pinzette magnetiche spostando i magneti permanenti in una posizione lontana dalla superficie del campione. Quindi posizionare la cella di flusso preparata nel microscopio.

Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella di flusso. Scegli il piano focale delle perle funzionalizzate Lambda DNA concentrandoti sulle perle lontano da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretto è quello in cui le perline desiderate hanno un centro luminoso.

Fate un video del movimento del tallone che 80 hertz sono maggiori per 500 fotogrammi. Avvicinare il magnete alla superficie del campione e registrare un video del movimento del cordone in ogni posizione. Per distanze superiori a cinque millimetri, spostarsi con incrementi di un millimetro per distanze comprese tra uno e cinque millimetri.

Muoviti con incrementi di 0,5 millimetri per distanze inferiori a un millimetro, spostati con incrementi di 0,25 millimetri Per ogni set di dati, traccia il centro delle perline utilizzando un adattamento gaussiano 2D. Calcolo della forza tramite fluttuazioni browniane come descritto nella procedura scritta. Confermare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un adattamento Lian dello spettro di potenza.

Al fine di trovare la frequenza di roll-off, la relazione tra la forza applicata e la frequenza di roll-off può essere trovata nel testo prima dell'attaccamento del peptide di collagene alle cellule di flusso, esprimere e purificare il peptide di collagene e le proteine MMP one. Iniziare aggiungendo la soluzione di anticorpi anti-mic alla cella a flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire all'anti-mic di attaccarsi alla superficie della cella a flusso e prevenire l'adesione non specifica delle proteine utilizzando cinque milligrammi per millilitro. BSA Aggiungere 150 peptide di collagene picomolare e lasciarlo aderire all'anticorpo tramite l'M ttag per 45 minuti.

Lavare via il collagene in eccesso utilizzando il tampone PBS prima di aggiungere perle da 2,8 micrometri alla cella di flusso. Devono essere separati dallo strep divid e dalla soluzione di perline rivestite utilizzando potenti magneti, quindi risospesi in PBS. Questo processo deve essere ripetuto tre volte.

Questo passaggio è essenziale per far sì che le perle da 2,8 micrometri si leghino al peptide di collagene immobilizzato in superficie. Quindi, aggiungi le perle super paramagnetiche rivestite di strep divid streptavidina e lasciale attaccare alle molecole di collagene per 45 minuti. Una volta che la cella di flusso è stata assemblata con il peptide di collagene e le perle magnetiche, visualizzare l'immagine della cella di flusso nella trappola magnetica.

Sotto una forza bassa, una sottopopolazione di perle è a volte debole, aderendo alla superficie in modo non specifico. L'applicazione di una forza modesta assicura che queste perle vengano liberate. Aggiungere l'enzima attivato alla cella a flusso.

In questo caso, MMP one è stato pre-attivato aggiungendo 3,5 millimolari di PMA A e incubato a 37 gradi Celsius per tre ore. Non appena una cella a flusso viene reintrodotta nell'apparato delle pinzette magnetiche, registrare un video che copre alcuni campi visivi, in genere producendo diverse centinaia di perline attaccate. Questa misura corrisponde a tempo uguale a zero.

Ripetere lo stesso processo di registrazione di diversi campi visivi in punti temporali regolari fino a quando tutte le perle si staccano o non è distinguibile un'ulteriore proteolisi. Le pinzette magnetiche sono state calibrate per perline da un micrometro e 2,8 micrometri. Utilizzando sia l'entità delle fluttuazioni browniane osservate che il calcolo della frequenza di roll-off a diverse posizioni del magnete negli esperimenti di proteolisi forzata, il numero normalizzato di perle rimanenti può essere tracciato in funzione del tempo per trovare il tasso di proteolisi.

E questo processo può essere ripetuto per diverse concentrazioni e forze enzimatiche. I tassi di proteolisi dipendono dalla forza applicata. I tassi di proteolisi sono stati determinati a un pico Newton, 6,2 pico Newton e 13 pico newton.

La frazione di perle unpro è maggiore di 15 minuti, rimane approssimativamente costante a 0,25 in diversi esperimenti. Nel nostro caso, il test ci ha permesso di misurare l'efficienza catalitica di MMP one in funzione della forza applicata. Analizzando i dati, abbiamo scoperto che la tripla elica del collagene deve svolgersi localmente prima della proteolisi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore se eseguita correttamente. È importante ricordare che sono necessarie almeno 30-50 perle per carburante di vista per ottenere una buona significatività statistica dei dati. Non dimenticare che un PMA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questo esperimento dovrebbero essere sempre utilizzate precauzioni come guanti, camici da laboratorio e maschera facciale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'effetto della forza sulla scissione proteolitica di singole proteine utilizzando una pinzetta magnetica. Le pinzette magnetiche sono un ottimo strumento per comprendere gli esperimenti biofisici di singole molecole. Questa tecnica può essere estesa ad altre combinazioni di proteasi e substrato.

Inoltre, tecniche simili possono essere utilizzate per comprendere le dinamiche strutturali delle proteine e per comprendere altre proteine che legano o modificano l'RNA e/o il DNA.