Name: Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri come misurare la proteolisi a singola molecola con pinzette magnetiche per studiare l'effetto del carico meccanico sul collagene. Questo metodo ad alto rendimento consente di derivare parametri cinetici con quantità minime di substrato.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato dal Career Award Burroughs Wellcome a livello di interfaccia scientifico (ARD), il National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award 1-DP2-OD007078 (ARD), il William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e la Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Giovane Predoctoral (JC). Gli autori ringraziano James Spudich prestito attrezzature per microscopia.

1. Cella di flusso Preparazione <ol><li> Vetrini coprioggetto (# 1.5, 22x22 mm e 22x40 millimetri, VWR) vengono puliti con ultrasuoni. <ol><li> Aggiungere i coprioggetti ad un piccolo contenitore di vetro capace di contenere coprioggetto e montaggio nel sonicatore (vedi punto 2). </li><li> Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un bagno sonicatore per 20 minuti. </li><li> Eliminare l'isopropanolo e sciacquare i coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata prodotta da un apparato Barnsted MilliQ o un dispositivo simile. Riempire il contenitore con acqua e ultrasuoni per 20 minuti. </li><li> Dopo sonicazione, asciugare i coprioggetti in un flusso di filtrata, priva di polvere nell'aria. Utilizzare solo i coprioggetto che appaiono puliti (cioè senza sbavature). </li><li> Delicatamente i coprioggetti fiamma per alcuni secondi per pulirli di eventuali residui di polvere e umidità: passano i coprioggetti attraverso una fiamma del gas prodotto con un becco Bunsen, facendo attenzione a non deformare il coprioggetti a causa del calore in eccesso. Questa fase rimuove superficie residuacontaminanti. </li></ol></li><li> Utilizzando del nastro biadesivo scotch, collegare i due coprioggetti insieme. Tagliare il nastro ~ 3 cm di lunghezza e 0,3 cm di larghezza. Fissare il nastro su coprioggetto 22x40 millimetri lasciando un canale di 1,6 cm al centro. Utilizzare un puntale per premere delicatamente verso il basso sul vetrino per garantire che il nastro è correttamente rispettati. </li></ol> 2. Magnetic Tweezers Setup e calibrazione <ol><li> Pinzette magnetiche erano installazione utilizzando permanenti magneti in terre rare come descritto in precedenza 10,12. Un alluminio L-staffa è stato costruito con un foro 1 mm di diametro e montato su un verticale z traduttore (Thorlabs) per modulare l'altezza delle pinzette. Due permanenti magneti in terre rare sono stati attaccati alla staffa su entrambi i lati del foro per creare la trappola magnetica (Figura 1). </li><li> Preparazione del DNA: DNA fago lambda marcato al suo 5 'e 3' termina con biotina e digossigenina (IDT DNA, San Diego, CA) è stato usato per calibrare il MAGpinzette magnetiche. <ol><li> Mescolare 50 pl di 4 nM λ-DNA con 2 pl di 40 nM biotina oligonucleotide coniugato e scaldare a 60 ° C per 10 minuti. Poi, lentamente raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Aggiungere DNA ligasi secondo le specifiche del costruttore e legare a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Aggiungere 2 microlitri di 400 nM oligonucleotide digossigenina coniugato ed incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. </li><li> Aggiungere 1,5 microlitri di 10 mM ATP e continuare ligazione dell'oligonucleotide digossigenina coniugato alla λ-DNA per 3 ore. </li><li> Rimuovere gli oligonucleotidi in eccesso e la DNA ligasi con 100 filtri di spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un totale di 1000 volte scambio tampone in tampone TE è sufficiente a rimuovere i oligonucleotidi eccesso. Nota: è importante non utilizzare velocità di rotazione&gt; 500xG perché porterà al taglio del DNA. </li><li> Esaminare un campione di DNA tramite elettroforesi su un gel di agarosio 0,7% per garantire che il DNA is non denaturato o tranciati. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA. L'uso di un NanoDrop UV-Vis spettrofotometro (Thermo Scientific) è raccomandato poiché il volume del campione disponibile può essere molto piccolo. </li></ol></li><li> Preparare celle di flusso come descritto nella sezione 1. </li><li> Per il fissaggio del DNA alla cella a flusso, aggiungere anticorpo anti-digossigenina (pecora IgG; 1 mg mL -1; Bioscience Roche, Mannheim, Germania) e consentono di aderire alla superficie di vetro per 15 minuti. </li><li> Passivazione della superficie della cella di flusso per prevenire non-specifica incollaggio di DNA aggiungendo 2 mg mL -1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. </li><li> Ripetere il punto 2.5. </li><li> Aggiungere 50 pM di fuctionalized λ-DNA e permettono di allegare al vetrino per 15 minuti. </li><li> Lavare via il DNA in eccesso con PBS 1x. </li><li> Aggiungere streptavidina-perle rivestite superparamagnetiche (1 perline micron = 2 mg mL -1; 2,8 perle um = 20 pg mL -1 </li><li> Lavare via perline in eccesso con PBS 1x. </li><li> Magnetic Tweezers calibrazione <ol><li> Spostare i magneti permanenti ad una posizione che è lontano dalla superficie del campione (&gt; 15 mm). </li><li> Posizionare la cella preparato flusso nel microscopio. </li><li> Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella di flusso. </li><li> Scegliere il piano focale di λ-DNA perline funzionalizzati concentrandosi sui talloni da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretta è quella in cui le perle desiderati hanno un centro luminoso. </li><li> Prendete un video del movimento del tallone a 80 Hz o maggiore di 500 frames. </li><li> Spostare il magnete vicino alla superficie del campione. Per distanze superiori a 5 mm, si muovono in incrementi di 1 mm. Per distanze comprese tra 1 e 5 mm, si muovono in incrementi di 0,5 mm. Per distanze inferiori a 1 mm, si muovono in incrementi di 0,25 mm. </li><li> Ripetere i punti 2.11.5 e 2.11.6 ad ogni nuova posizione del magnete. </li><li> Per ciascun datoimpostare, monitorare il centro delle sfere utilizzando una vestibilità 2D gaussiana. </li><li> Calcolare la forza tramite le fluttuazioni browniani utilizzando: </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 1"> dove k B T è l'energia termica Boltzmann, L è la lunghezza di λ-DNA, e &lt;x 2&gt; è la varianza in posizione centroide. <ol start="10"><li> Confermare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un fit Lorentzian spettro di potenza al fine di trovare la frequenza attenuazione. Forza applicata è legata alla frequenza di attenuazione dalla relazione: </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 2"> Dove 0 ƒ è la frequenza rolloff, a è il raggio tallone, e μ è la viscosità del fluido 12. </li></ol> 3. Collagene Allegato Peptide alle celle di flusso Per fornire un esempio concreto per l'applicazione del nostro metodo, si descrive un recente lavoro nostro laboratorio che caratterizza la proteolisi di un peptide trimerico modello collagene. Prevediamo che questo approccio generale può essere diffusamente applicate ad altre proteine ​​e polinucleotidi. <ol><li> Il peptide modello collagene è costituito da un N-terminale 6x His-tag per la purificazione, seguita da un tag 5x myc, (GPP) 10 per applicare formazione tripla elica, il collagene a1 residui 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), che costituiscono la MMP- 1 sito di riconoscimento, la sequenza foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ed un C-terminale per facilitare KKCK etichettatura con biotina-maleimide. Foldon deriva dal fago T4-fibritin proteina, e stabilizza trimeri modello collagene quando fuse sia nella N - o C-terminale 13,14. </li><li> Il peptide collagene e MMP-1 proteine ​​sono state espresse e purificate come descritto in precedenza 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Aggiungere anti-myc (15 pg ml -1) alla cella a flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire l'anti-myc per attaccarsi alla superficie della cella di flusso. </li><li> Passivazione della cella di flusso per prevenire non-specifica fissaggio di proteine ​​usando 5 mg mL -1 BSA allo stesso modo come descritto al punto 2.5. </li><li> Aggiungere 150 pM peptide di collagene e permettono di allegare l'anticorpo tramite il tag myc per 45 minuti. </li><li> Lavare via collagene in eccesso con tampone PBS. </li><li> Aggiungi perle rivestite di streptavidina superparamagnetiche perle (1 micron = 2 mg ml -1 e 2,8 perline micron = 20 mg ml -1) e consentire loro di attaccare le molecole di collagene per 45 minuti. Le perle di 1 micron deve essere diluito fino alla concentrazione desiderata in PBS. Le perle 3 um deve essere separato dalla soluzione tramite magneti, poi risolubilizzato in PBS. Questo processo deve essere ripetuto 3 volte. Abbiamo notato che questo passaggio è essenziale per la get le 3 perle micron di legarsi alla superficie-peptide immobilizzato collagene. </li></ol> 4. Forza proteolisi Assay <ol><li> Una volta che la cella a flusso è assemblato con il peptide collagene e biglie magnetiche, l'immagine cella di flusso nella trappola magnetica in basso, ~ 1 forza pN. Nella nostra esperienza, una sottopopolazione delle perle è talvolta debolmente aderire alla superficie in un modo non specifico. L'applicazione della forza modesta assicura che queste perle sono liberati. </li><li> Aggiungere enzima attivato alla cella a flusso. In questo caso MMP-1 è stato pre-attivato con l'aggiunta di 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubate a 37 ° C per 3 ore. L'attivazione è stata verificata mediante SDS-PAGE. </li><li> Appena la cella di flusso viene nuovamente introdotto nell'apparecchio magnetico pinzette, registrare un video estende alcuni campi di vista, tipicamente ottenendo diverse centinaia perline allegate. Questo sarà t = 0. </li><li> Ripetere lo stesso processo di registrazione di diversi campi di vista (mentre tornava tO lo stesso campo di vista) in punti regolari di tempo, fino a tutte le perline si staccano o non proteolisi più è percepibile. </li><li> Kinetic analisi dei dati <ol><li> Contare le perline nei vari campi di vista a tempi diversi e loro media. Normalizza il numero di perle dividendo il numero medio di perline in ogni punto temporale per il numero di perle di t = 0. In questo modo siamo in grado di confrontare i tassi di proteolisi da diversi esperimenti, perché il numero assoluto di perline sarà diverso da esperimento esperimento. </li><li> Tracciare il rapporto in funzione del tempo. In questo caso, abbiamo montato un decadimento esponenziale più una costante. </li></ol><img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 3"> dove ƒ (t) è il rapporto delle perline allegate (o molecole di collagene unproteolyzed), t è il tempo, a è la frazione di sfere collegate da una ritenuta collagene, b è il tasso costante di decadimento, ecè la frazione di perle che sono attaccate in modo non specifico. <ol start="3"><li> Lo stesso esperimento viene ripetuto a varie forze e MMP-1 concentrazioni di chiarire l'effetto della forza sulla proteolisi collagene di MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Il protocollo sopra descrive un nuovo uso di pinzette magnetico (Figura 1) per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica. Abbiamo calibrato le pinzette di 1 um e 3 perline micron utilizzando sia l'ampiezza delle fluttuazioni osservati browniani e calcolo del roll-off frequenza diverse posizioni magneti (Figura 2). In esperimenti di proteolisi delle forze, la configurazione è simile tranne che il DNA viene sostituito con collagene (figure 3, 4). Il numero normalizzato di perline rimanenti possono essere tracciate in funzione del tempo per trovare le tariffe proteolisi (Figura 5), e questo processo può essereripetuto per diverse concentrazioni degli enzimi e forze. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica del processo di calibrazione magnetico trappola (non in scala). Due magneti permanenti terre rare creare un campo magnetico che tira sulla superparamagnetico tallone. Tradurre il magnete su e giù regola la forza applicata. Le perle vengono esposte con un convenzionale in campo chiaro microscopio con la luce che passa attraverso un forellino fra i due magneti Inset:. Immagine ripresa con un obiettivo 40x aria. I taglienti, macchie rotonde corrispondono ai talloni attaccati alla superficie coverslip. Gli out-of-focus oggetti sono perle indipendenti. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Grafici della forza calibrata in funzione della distanza dal magnete superficie del campione di 1 micron (sinistra) e 2,8 micron (a destra) di tallones. I dati sono stati adatti alla funzione empirica <img alt="Equazione4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione4"> , Dove x è la distanza dal magnete. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 per le perle 1 um e uno = 140, b = 3,10 e c = 1,86 per le perle 3 micron. Questi valori sono specifici per il nostro strumento specifico e geometria sperimentale, e ciascuno strumento deve essere calibrato individualmente. Le barre di errore in ciascun punto rappresenta una variabilità ~ 10% in forza applicata su una base di tallone tallone, a causa della variabilità di dimensioni del tallone. La forza applicata è proporzionale al volume delle perline, e il volume tallone varia ~ 9% rispetto alla media (secondo le specifiche del costruttore). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Forza test di setup proteolisi (non in scala). Il modello trimero collagene è attaccato alla superficie del vetrino via mYC / anti-myc coniugazione. Le perle rivestite con streptavidina superparamagnetici sono attaccati alle trimeri collagene tramite un legame di biotina-streptavidina. Attivato MMP-1 tagli il collagene nel tempo, causando le perline a staccarsi dalla superficie e si allontana dal piano focale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Cartone schematica di proteolisi in funzione del tempo. La vignetta mostra un campo di campione di vista nel corso del tempo, come accade proteolisi. Nel tempo, MMP-1 tagli il collagene e le perline staccare e allontanarsi dal piano focale sotto l'influenza del campo magnetico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Tassi di proteolisi Figura 5. Dipendono forza applicata 16. Vengono mostrati i dati raccolti a 1,0 pN (3 uM MMP-1, nero), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rosso) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magoNTA). I tassi di proteolisi parametri (fit) sono: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), e 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). La frazione di perle unproteolyzed a tempi lunghi (&gt; 15 minuti) resta pressoché costante a ~ 0,25 in diversi esperimenti. Le barre di errore corrispondono alle statistiche Poisson che riflette il numero di osservazioni in ogni punto. L'errore ad ogni tempo di perline n n è 1/2. L'errore nella frazione di perline attaccate è stato calcolato errore propagation.1 perle um sono stati utilizzati per pN 1,0 e 6,2 esperimenti pN e 2,8 um perline sono state usate per gli esperimenti pN 13.

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li>
<li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+structure+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li>
<li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li>
<li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+collagen%2Fenzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic%2C+enzyme-induced+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li>
<li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li>
<li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+determination+of+unbinding+force%2C+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li>
<li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stabilization+at+atomic+level%3A+crystal+structure+of+designed+%28GlyProPro%2910foldon%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li>
<li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li>
<li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li>
<li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li>
<li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li>
<li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie ​​potenziali. Limitazioni di pinzette magnetiche Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui descritte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Micro copertura in vetro # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro copertura in vetro # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anticorpo anti-myc </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-acetato Aminophenylmercuric </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimmide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marcate con biotina oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> Digossigenina marcato oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> Collagenegene del peptide </td><td> DNA 2,0 </td><td> Sintesi personalizzata </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard Database plasmide </td><td></td></tr><tr><td> z-traduttore </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servo regolatore di traduttore </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplex singola molecola forza misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali 1, 2 e aterogenesi la guarigione della ferita 3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L&#39;effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile 4-7. Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico 8, 9 microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici 10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell&#39;intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello 12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l&#39;effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l&#39;esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.

In questo articolo si descrivono l&#39;uso di una pinzetta magnetici per studiare l&#39;effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche sono aspetti ubiquitari della fisiologia cellulare, con una rilevanza diretta per la metastasi del cancro1, l'aterogenesi2 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'effetto del carico meccanico sul taglio proteolitico di singole proteine in modo altamente parallelo ed economico. In questa dimostrazione, nel primo passaggio viene esaminato il taglio del collagene da parte della metalloproteasi matriciale uno; i trimers di collagene vengono fissati alla lamella di vetro di una cella a flusso, seguito dal fissaggio di microsfere magnetiche di dimensioni micrometriche alle singole molecole di collagene. Il secondo passaggio consiste nel montare la cella a flusso nell'apparato delle pinze magnetiche e verificare che le microsfere legate in modo non specifico siano state rimosse dalla superficie della lamella.Successivamente, la proteasi viene aggiunta alle cellule a flusso. L'ultimo passaggio consiste nel determinare la velocità di proteolisi monitorando in tempo reale il distacco delle perle. Misurando le velocità di distacco delle perle a diverse concentrazioni di proteasi e forze applicate, è possibile ricavare i parametri cinetici zoologici standard utilizzando quantità minime di substrato e proteasi.Inoltre, questa tecnica fornisce informazioni uniche sull'effetto della forza meccanica sull

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Pinzette magnetiche, una potente tecnica di manipolazione singola molecola, possono essere adattati per le misure dirette della torsione (utilizzando una configurazione denominata liberamente orbitante pinzette magnetiche) e coppia (utilizzando una configurazione definita pinzette coppia magnetica) in macromolecole biologiche. Linee guida per l'esecuzione di tali misure sono espresse, comprese le applicazioni allo studio del DNA e associati filamenti nucleo-proteine.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Scopri come misurare la proteolisi a singola molecola con pinzette magnetiche per studiare l'effetto del carico meccanico sul collagene. Questo metodo ad alto rendimento consente di derivare parametri cinetici con quantità minime di substrato.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Esplora altri video