High-throughput generatore di espressione delle proteine Utilizzando una piattaforma microfluidica
23 agosto 2012
Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un array proteico modulare che non richieda una fase di purificazione, rendendolo compatibile con qualsiasi libreria proteica. Ciò si ottiene generando prima geni sintetici attraverso l'assemblaggio PCR. Successivamente, i geni sintetici vengono disposti su vetrini epossidici.
Per fabbricare il dispositivo microfluidico, utilizzare PDMS con controllo in silicone e stampi a flusso. Quindi il dispositivo microfluidico viene allineato all'array di DNA macchiato. Infine, il lisato di reticolociti di coniglio viene fatto fluire nel dispositivo microfluidico e le proteine vengono espresse.
In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione di migliaia di proteine attraverso la marcatura di anticorpi fluorescenti. Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzo della tecnica basata sulla microfluidica rispetto ai metodi esistenti come i microarray di proteine. Microarray di DNA e poi usiamo cellis per produrre proteine sul dispositivo.
Pertanto, non abbiamo bisogno di purificazione delle proteine e le proteine non si seccano mai. Rimangono freschi per tutta la durata dell'esperimento. La tecnica microfluidica fornisce anche una maggiore sensibilità Per fabbricare il dispositivo microfluidico, esporre il controllo del silicone e gli stampi di flusso al vapore di clorotrimetilsilenee per 10 minuti per favorire il rilascio di elastomero.
Dopo le fasi di cottura, preparare una miscela di elastomero a base di silicone e agente indurente in due diversi rapporti di cinque a uno e 20 a uno rispettivamente per gli stampi di controllo e di flusso. Versare il PDMS cinque a uno sullo strato di controllo. Degasare lo strato di controllo e infornare per 30 minuti a 80 gradi Celsius.
Quindi rivestire la miscela PDMS 20 a uno sullo strato di flusso a 2, 600 giri/min per 60 secondi, quindi cuocerla a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Separare lentamente lo strato di controllo dallo stampo, facendo attenzione a non staccare il modello SU otto. Quindi, utilizzando un bisturi, tagliare il dispositivo attorno al suo perimetro e utilizzare un ago smussato per praticare dei fori per accedere ai canali di controllo al microscopio.
Allineare manualmente gli strati di flusso e di controllo iniziando dall'angolo in alto a sinistra e posizionando la valvola a bottone sullo strato di controllo al centro della camera di reazione. Quindi, allinea la prima fila e rilascia delicatamente il livello di controllo riga per riga. Assicurarsi che tutte le valvole a bottone si trovino al centro delle camere di reazione e che le valvole di indirizzo e di ingresso attraversino i canali di flusso nella posizione corretta.
Ripetere il processo localmente fino a quando tutte le righe non sono allineate. Quando è completamente allineato, rilasciare qualsiasi tensione nel PDMS sollevandolo con cautela dai lati e dagli angoli. Quindi cuocere il dispositivo per due ore a 80 gradi Celsius dopo la cottura.
Tagliare lungo il perimetro e staccare il dispositivo a due strati dai fori di punzonatura dello stampo a flusso per accedere ai canali di flusso per generare costrutti di DNA per il dispositivo. Eseguire la PCR per produrre geni sintetici composti da un promotore T sette, un sito di legame del ribosoma, un frame di lettura aperto con diversi tag epitopici alle due estremità e un terminatore T sette. Per preparare i geni sintetici per l'arraying, fare una miscela di polietilenglicole e D triosio diidrato Erogare due microlitri per reazione nei pozzetti di un 384.
Pozzetto piastra. Aggiungere i geni sintetici in una piastra a 384 pozzetti. Quindi aggiungere acqua distillata fino a un volume finale di 20 microlitri.
Successivamente, utilizzando uno spot di microarray, una serie di geni sintetici su substrati di vetro rivestiti con resina epossidica. Sotto uno stereoscopio, allineare manualmente il dispositivo microfluidico all'array genico con il punto di DNA posizionato al centro delle camere di DNA. Quindi allinea il resto delle righe.
Termina con la messa a punto dell'intero dispositivo per alleviare qualsiasi stress sul PDMS e garantire che aderisca bene al microarray. Sollevalo localmente. Infine, incollare il dispositivo al vetrino incubandolo per una notte su una piastra calda a 80 gradi Celsius.
I coloranti alimentari sono utilizzati in questa sezione per scopi di visualizzazione. Le valvole nel livello di controllo vengono azionate dal computer utilizzando la vista di laboratorio. Lo script di visualizzazione del laboratorio controlla una serie di microvalvole a solenoide tramite una scatola di controllo elettronica.
Il collettore dell'elettrovalvola è collegato all'aria compressa, che controlla il flusso d'aria e la pressione nelle valvole di controllo sul dispositivo. Utilizzando un tubo di plastica flessibile con diametro interno di 0,02 pollici e un perno in acciaio inossidabile, collegare il dispositivo al collettore delle elettrovalvole. Riempire i tubi con acqua distillata doppia e inserire il perno nei fori di accesso dello strato di controllo.
Assicurarsi che ogni tubo sia collegato al canale di controllo corrispondente. Per attivare i canali di controllo, eseguire l'applicazione lab view, impostare la pressione dell'aria su cinque PS. Quindi applico la pressione dell'aria attivando la valvola dallo script di visualizzazione del laboratorio. Ciò spingerà l'acqua nei canali di controllo PDMS per identificare la potenziale diafonia tra i canali di controllo dei dispositivi difettosi.
Riempire prima il panino e le valvole dell'indirizzo. Dopotutto, i canali di controllo e le valvole sono pieni d'acqua, adescare le valvole per bloccare i canali di flusso sottostanti. Aumentando prima la pressione dell'aria a 15 PSI, quindi nel programma di visualizzazione del laboratorio attraverso una serie di interruttori on off collegati a singole elettrovalvole.
Attiva tutte le valvole attivando tutti i pulsanti dell'interruttore per assicurarti che tutte le valvole siano aperte. Collegare un tubo a uno degli ingressi del flusso e a quattro o cinque PSI far fluire l'aria nel dispositivo. Questo rilascerà eventuali valvole appiccicose dal vetrino.
Il dispositivo è ora innescato e pronto per la visualizzazione. Il colorante alimentare giallo viene utilizzato per visualizzare i reagenti in questa sezione e la soluzione incolore rappresenta gli hippy per facilitare l'autoassemblaggio di un array proteico sulla superficie e prevenire l'assorbimento non specifico all'interno del dispositivo microfluidico, modificare chimicamente la superficie collegando prima un nuovo tubo con la soluzione richiesta a uno dei canali di flusso nel dispositivo. Quindi collegare il lato libero del tubo al collettore manuale e aprire il flusso di pressione dell'aria.
Caricare 40 microlitri di biotina euforica BSA in un nuovo tubo e farne scorrere circa la metà attraverso il dispositivo per 20 minuti. Usa hippie da 50 millimolari per lavare via qualsiasi substrato non reattivo tra ciascuno dei passaggi. Successivamente, far scorrere 25 microlitri di streptavidina per 20 minuti.
Sopra la biotina euforica BSA lavare con hees per cinque minuti per mangiare la superficie circostante il bottone, chiudere la valvola a bottone e far scorrere il resto del BSA biotinilato, quindi lavare di nuovo con il pisello per cinque minuti. Infine, per creare un array di tag anti sibilo sotto il pulsante, rilasciare la valvola a pulsante e far scorrere 30 microlitri di biotina sibilante Penta per 20 minuti per creare un array di proteine sul dispositivo. Aprire le valvole del collo e far fluire il reticolocita di coniglio.
Soluzione di reazione di trascrizione e traduzione ad accoppiamento rapido attraverso il dispositivo nella camera del DNA. Quindi, chiudere le valvole a sandwich per separare ciascun gene dal suo ambiente e incubare il dispositivo su una piastra calda per 2,5 ore a 30 gradi Celsius. Quindi etichettare l'estremità terminale delle proteine con l'anticorpo C mix SI tre.
Infine, utilizzando uno scanner microarray con un laser a 532 nanometri e un filtro di emissione a 575 nanometri. Determina i livelli di proteine. Questa figura mostra i diversi livelli di espressione proteica su un array proteico.
Di solito il 20% di una libreria genica non riesce ad esprimersi a livelli rilevabili. I livelli di fondo sono stati determinati utilizzando camere che non sono state individuate con il DNA. Pertanto, i segnali provenienti dalle corrispondenti camere proteiche sono dovuti al rumore o all'assorbimento non specifico degli anticorpi marcanti.
Se viene eseguita correttamente, la verifica del dispositivo richiede quattro ore e l'esperimento del chip richiede cinque ore.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un approccio microfluidico per l'espressione di array proteici, utilizzando un dispositivo con migliaia di camere di reazione controllate da valvole micro-meccaniche. L'integrazione di una libreria genica stampata su microarray permette la trascrizione e la traduzione on-chip, risultando in un array proteico pronto all'uso.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microfluidica
- Espressione proteica
- Librerie geniche
Sfondo
- Gli array proteici sono essenziali per vari saggi biologici.
- I metodi tradizionali spesso richiedono passaggi di purificazione, limitando la compatibilità.
- I dispositivi microfluidici possono semplificare il processo di espressione proteica.
- L'assembly PCR viene utilizzato per generare geni sintetici per l'array.
Obiettivo dello studio
- Creare un array proteico modulare senza passaggi di purificazione.
- Migliorare la compatibilità con qualsiasi libreria proteica.
- Migliorare l'efficienza dell'espressione proteica utilizzando la microfluidica.
Metodi utilizzati
- Generazione di geni sintetici attraverso l'assembly PCR.
- Arraying di geni sintetici su vetrini epossidici.
- Fabbricazione di un dispositivo microfluidico utilizzando PDMS.
- Flusso di lisati di reticolociti di coniglio nel dispositivo per l'espressione proteica.
Principali risultati
- È stato creato con successo un dispositivo microfluidico funzionale.
- Le proteine sono state espresse on-chip senza purificazione.
- Il metodo ha dimostrato compatibilità con varie librerie proteiche.
- La trascrizione e la traduzione on-chip sono state efficacemente realizzate.
Conclusioni
- Questo approccio microfluidico semplifica la creazione di array proteici.
- Elimina la necessità di purificazione, migliorando l'usabilità.
- La tecnica può essere applicata a diverse librerie proteiche per la ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
