Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino

Qui presentiamo un metodo sensibile, rapido e discriminante di colorazione post-gel per immagini di RNA etichettati con aptamers RNA Mango I, II, III o IV, utilizzando gel nativi o denacilidi di gel poliacrilamina (PAGE). Dopo aver eseguito gel PAGE standard, l'RNA con etichettatura mango può essere facilmente macchiato con TO1-Biotin e quindi analizzato utilizzando lettori di fluorescenza comunemente disponibili.

La metodologia di imaging in gel con tag Mango qui dimostrata è robusta e si prevede che possa essere semplicemente estesa in termini di sensibilità e specificità. Ciò semplificherebbe ulteriormente la purificazione di routine di RNA e complessi di RNA biologicamente importanti con il semplice espediente di aggiungere un manga-tag all'RNA di interesse. Gli RNA sono implicati in sempre più malattie per questo metodo di post dating è un modo semplice e veloce per essere in grado di tracciare e visualizzare l'RNA.

Sarà necessaria una maggiore cura nel trasferimento del gel da un luogo all'altro in quanto i gel sono fragili e inclini alla rottura. Per preparare un gel denaturante da 30 millilitri, selezionare prima la percentuale di poliacrilammide con il blu bromofenolo appropriato e i coloranti cianolo di xilene rispetto a un RNA di interesse per assicurare la separazione ad alta banda. Quindi, mescolare le soluzioni A, B e C in base alla tabella uno e aggiungere APS e timud.

Versare immediatamente la soluzione di gel in un apposito apparato di fusione del gel. Inserire il cono desiderato e lasciare il gel alla polimerasi per circa 30 minuti. Preparare il serbatoio del gel utilizzando 1 soluzione XTBE e rimuovere con cura il cono.

Sollevare con cura il gel e montarlo sull'apparato di gel e fissare utilizzando clip leganti. Utilizzando una siringa, aspirare i pozzi immediatamente prima del caricamento del campione. Preparare campioni di RNA 1X aggiungendo una soluzione di caricamento del gel denaturante 2X ai campioni di RNA di interesse.

Utilizzare un termociclo per riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, caricare campioni raffreddati sul fondo di ogni pozzo utilizzando punte di caricamento del gel. E bene il gel a temperatura ambiente assicurando che la potenza sia effettivamente bassa per non rompere la piastra di vetro dell'apparato di gel.

Preparare la soluzione di colorazione del gel 1X secondo il manoscritto in un contenitore di vetro pulito abbastanza largo da adattarsi comodamente al gel. Aggiungere abbastanza soluzione di colorazione del gel 1X al contenitore in modo che il gel sia completamente coperto con la soluzione quando viene posizionato su un rotatore orbitale. Una volta che il gel termina la corsa, rimuovere il gel dall'apparecchio, tagliare i suoi pozzi e un angolo del gel per aiutare a determinare l'orientamento.

Quindi, trasferire con cura il gel nella soluzione di colorazione del gel 1X. Per eseguire l'imaging, decantare attentamente la soluzione di colorazione e risciacquare rapidamente il gel con acqua. Infine, trasferire con cura il gel sul vassoio da posizionare nell'imager.

Arrotolare una pipetta di vetro sul gel per rimuovere le bolle intrappolate e il liquido in eccesso. E procedere a prendere un'immagine gel. Gli aptameri di mango uno, due, tre, quattro sono stati sostanzialmente resistiti alla denaturazione fino a circa una concentrazione molare di Urea.

Il tempo di colorazione da 20 a 40 minuti è stato sufficiente per la massima florescence di gel. Il tempo più lungo non era adatto per i piccoli RNA utilizzati in questo studio quando hanno iniziato a diffondersi dal gel. L'analisi del fluorometro ha mostrato che gli aptameri di Mango uno, due e tre in presenza di Urea potevano piegarsi più rapidamente dell'aptamero quattro.

In assenza di Urea, il ripiegamento è stato molto più rapido come ci si aspettava. La sensibilità del metodo post colorazione è stata dimostrata da singole bande corrispondenti a RNA ben piegate per ciascuna delle varianti mango nei gel nativi e denaturanti con una sensibilità leggermente inferiore per quella successiva. La quantificazione dei gel nativi era log lineare su circa un ordine di grandezza con Mango uno, due e quattro che si comportava in modo più lineare di Mango tre.

La quantificazione dei gel denaturanti era più lineare suggerendo che la presenza di Urea nel gel di denaturazione potrebbe fornire un modo più omogeneo per piegare gli aptameri una volta collocati nella soluzione di colorazione della biotina TO1. Gli RNA taggati al mango possono essere rilevati in presenza di RNA totale utilizzando la colorazione della biotina TO1 rispetto alla colorazione SG. Ricordarsi di assicurarsi che il contenitore di colorazione del gel sia abbastanza grande da adattarsi al gel altrimenti il gel potrebbe ripiegarsi su se stesso.

I campioni di RNA si trasferiranno da un luogo all'altro. Simile ai gel denaturanti, questo metodo può essere eseguito per un gel nativo. Eseguire il gel in una stanza fredda a una potenza inferiore per mantenere le condizioni native.