Colorazione fluorescente dell'argento: una tecnica per visualizzare le proteine totali nei gel di poliacrilammide

La colorazione fluorescente con argento delle proteine in gel di poliacrilammide impiega sonde fluorogeniche per rilevare e quantificare le proteine.

Inizia con un gel di poliacrilammide con proteine, separate in bande attraverso l'elettroforesi. Immergere in una miscela fissativa di etanolo e acido acetico, che impedisce alle bande di diffondersi denaturando le proteine.

Lavare il gel per rimuovere i residui di acido acetico ed etanolo. Immergere il gel nella macchia di nitrato d'argento. Gli ioni d'argento si legano fortemente ai gruppi caricati negativamente nelle proteine.

Incubare al buio. Sciacquare il gel in acqua ultrapura per rimuovere i complessi di ioni d'argento non legati.

Immergere il gel in una soluzione di sviluppo contenente una sonda fluorogenica multicomponente - TPE-4TA. Questa sonda anionica prende di mira gli ioni d'argento legati alla proteina, formando aggregati insolubili che attivano le proprietà fluorogeniche della sonda, conferendo così fluorescenza.

Poiché l'attivazione della fluorescenza dipende dall'aggregazione, le sonde non legate non emettono alcun segnale, consentendo la colorazione totale delle proteine con ridotta emissione di fondo.

Incubare il gel al buio con una leggera agitazione, garantendo uno sviluppo fluorogenico completo. Trasferire il gel in un tampone di destain per rimuovere le sonde non legate. Infine, visualizza il gel per ottenere l'intensità del segnale della banda. Tracciare l'intensità del segnale di fluorescenza rispetto alla curva proteica standard per calcolare la quantità totale di proteine nel campione.

Dopo l'elettroforesi, immergere il gel in una soluzione da 100 millilitri contenente etanolo e acido acetico su un agitatore orbitale e incubare due volte per 30 minuti ciascuna, a temperatura ambiente agitando a 50 giri/min. Successivamente, lavare il gel tre volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito, con ogni lavaggio della durata di 10 minuti.

Per prima cosa, sciogliere 0,01 grammi di nitrato d'argento in 10 millilitri di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre con una concentrazione dello 0,1%. Aggiungere 100 microlitri di questa soluzione madre in 100 millilitri di acqua ultrapura per ottenere la soluzione di lavoro al nitrato d'argento. In una cappa aspirante, immergere il gel in 100 millilitri della soluzione di lavoro al nitrato d'argento in una camera di vetro sigillata.

Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere il gel dalla luce durante l'impregnazione e incubare per 1 ora agitando a 50 giri/min su un agitatore orbitale. Successivamente, lavare il gel due volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito, con ogni lavaggio utilizzando circa 100 millilitri di acqua e della durata di 60 secondi.

È importante utilizzare acqua ultrapura per pulire il gel dopo la fase di impregnazione dell'argento per ridurre al minimo le macchie di fondo.

Per prima cosa, aggiungi 50 millilitri di acqua ultrapura a 3 milligrammi di colorante TPE-4TA. Sonicare la soluzione per 3 minuti e aggiungere 5 microlitri di soluzione di idrossido di sodio da 1 molare tra ogni sessione di sonicazione, per aiutare a sciogliere il colorante, di solito fino a tre volte. Quindi, controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada UV a 365 nanometri per assicurarsi che il colorante sia completamente disciolto. Solo soluzioni deboli o non emissive indicano la completa dissoluzione.

Per preparare la soluzione di sviluppo fluorogenico, aggiungere 10 millilitri della soluzione madre di TPE-4TA a 90 millilitri di acqua ultrapura. Utilizzare un pHmetro per controllare il pH della soluzione. Regolare la soluzione su un pH compreso tra 7 e 9, utilizzando una soluzione diluita di idrossido di sodio o acido acetico, se il pH è fuori intervallo.

Quindi, trasferisci il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 millilitri della soluzione di sviluppo fluorogenico e assicurati che il gel sia completamente immerso. Sigillare il contenitore e coprirlo per proteggerlo dalla luce. Agitare il contenitore per una notte su un agitatore orbitale a 50 giri/min e a temperatura ambiente.

Trasferire il gel in un contenitore pulito e decolorarlo in 100 millilitri di etanolo al 10% per 30 minuti. Quindi, sciacquare il gel in acqua ultrapura per 5 minuti. Il gel può essere visualizzato su un trans-illuminatore da banco o ripreso su una macchina per la documentazione del gel sul canale a 365 nanometri o sul canale a 302 nanometri.