Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

IDBac accoppia i dati delle specifiche di massa provenienti da proteine e regioni metabolite specializzate di isolati batterici sconosciuti per discriminare rapidamente tra isolati in base alla loro identità e alla loro potenziale funzione ambientale. Il nostro software di origine ufficio estende l'utilità delle strategie di identificazione microbica basate su MALDI TOF esistenti. Questa estensione include l'analisi del metabolismo specializzato come un modo aggiuntivo per distinguere tra colonie con fenotipi simili.

Una grande sfida nel caratterizzare microrganismi sconosciuti è distinguere isolati strettamente correlati. IDBac fornisce ai ricercatori un modo semplice e veloce per caratterizzare gli isolati attraverso la profilazione di proteine e piccole molecole. IDBac fornisce un confronto visivo della produzione specializzata di metaboliti all'interno di un campione batterico e può fornire informazioni su un'ampia gamma di argomenti di ricerca, dagli studi ecologici alla scoperta di piombo nel farmaco.

Ci sono molti modi in cui i dati MALDI possono essere salvati tra e tra gli strumenti. Se hai problemi a far funzionare i file con IDBac, invia un problema a GitHub di IDBac. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, trasferire una piccola porzione di una colonia batterica nel punto appropriato su una piastra MALDI pulita.

Stendere uniformemente la colonia batterica sul posto in modo che il punto appaia il più piatto possibile. Sovrapporre un microlitro di acido formico di grado spettrometrico di massa al 70% sui punti di controllo del campione e della matrice e consentire all'acido di asciugarsi all'aria in una cappa aspirante chimica. Successivamente, aggiungere un microlitro di soluzione a matrice MALDI precedentemente preparata ai punti di controllo del campione e del supporto matriciale e lasciare asciugare completamente l'aria.

Dopo aver istituito lo spettrometro di massa MALDI TOF, acquisire gli spettri. Salvare gli spettri proteici in una cartella e gli spettri metaboliti specializzati in una seconda cartella separata. Per iniziare questa procedura, scaricare il software IDBac.

Fare doppio clic sul pulsante install_idbac per avviare il programma di installazione. Fare quindi doppio clic sul collegamento desktop IDBac per avviare IDBac che si aprirà nella scheda introduzione per impostazione predefinita. Fate clic sulla scheda Inizio con dati grezzi (Starting with Raw Data) e scegliete dal menu crea esperimento IDBac il tipo di dati da utilizzare con IDBac.

Quando si imposta la conversione e l'elaborazione dei file di dati, immettere un nome descrittivo per l'esperimento in cui richiesto e fare clic sulla cartella dati non elaborati e selezionare la cartella appropriata. Quindi fare clic su Elabora dati. Dopo aver convertito i file e averli e lavorati con IDBac, passare alla pagina degli esperimenti precedenti e selezionare un esperimento con cui lavorare.

Aggiungere informazioni sugli esempi utilizzando il menu, fare clic qui per modificare l'esperimento selezionato. Immettere informazioni nel foglio di calcolo autopopolazione e premere Salva. Quando si è pronti per iniziare l'analisi, assicurarsi che l'esperimento con cui lavorare sia selezionato.

Quindi selezionare l'analisi dei dati proteici. Nella pagina di analisi dei dati proteici, scegliere le impostazioni di picco di picco e valutare gli spettri proteici dei campioni tramite i grafici a specchio visualizzati. Regolare la percentuale di repliche in cui deve essere presente un picco per includerlo per l'analisi.

Utilizzando i grafici a specchio come guida visiva, regolare il segnale in base al taglio del rumore che mantiene i picchi più autentici e il minimo rumore notando che più repliche in un valore di presenza di picco percentuale più elevato consentirà la selezione di un segnale inferiore al taglio del rumore. In seguito, specificate la massa inferiore e superiore per caricare i cutoff che dettano l'intervallo di valori di massa all'interno di ogni spettro da utilizzare in ulteriori analisi da parte dell'IDBac. All'interno della pagina di analisi dei dati proteici, selezionare la scheda Dendrogramma per consentire il raggruppamento dei campioni in un dendrogramma in base alle misure di distanza selezionate dall'utente e agli algoritmi di clustering.

Fate clic su seleziona campioni (Select Samples) dal menu e seguite le istruzioni per selezionare i campioni da includere nell'analisi. Solo i campioni che contengono spettri proteici verranno visualizzati all'interno della casella dei campioni disponibili. Utilizzare i valori predefiniti per gli algoritmi di distanza e clustering e selezionare le intensità come input.

Per visualizzare i valori del bootstrap sul dendrogramma, immettere un numero compreso tra due e 1.000 sotto le trappole per stivali. Per iniziare a personalizzare il dendrogramma, aprire il menu regola il dendrogramma. Per colorare le linee del dendrogramma, selezionare clic per modificare le linee e selezionare le opzioni desiderate.

Per tracciare le informazioni dal foglio di calcolo accanto al dendrogramma, selezionare il pulsante incorpora informazioni sugli esempi. In questo modo si aprirà un pannello in cui una categoria si autopolerà in base ai valori immessi. Per inserire campioni da un altro esperimento, selezionate il pulsante di menu inserisci campioni da un altro esperimento e seguite le indicazioni nel pannello appena aperto.

Passare alla pagina di analisi dei dati delle piccole molecole per consentire la visualizzazione dei dati in base alle principali reti di analisi dei componenti e di associazione metabolica che utilizzano reti bipartite per visualizzare la correlazione della massa di piccole molecole per caricare i valori con i campioni. Fare clic e trascinare sul dendrogramma per evidenziare alcuni campioni di interesse da analizzare. Se non vengono evidenziati campioni o non è stato creato alcun dendrogramma proteico, apparirà rispettivamente una rete di associazione metabolita di un sottoinsieme casuale o di tutti i campioni.

Per sottrarre un supporto di matrice vuoto nella rete di associazione dei metaboliti, aprire il menu selezionare un campione da sottrarre e scegliere l'esempio appropriato da utilizzare come vuoto. Aprite le impostazioni man di menu show/hide per selezionare i valori desiderati per una percentuale di presenza di picco e replica, segnale al rumore e tagli di massa superiore e inferiore. Utilizzare i grafici a specchio a piccola molecola per guidare la selezione di queste impostazioni.

Per riportare i risultati, copiare il testo all'interno dei suggerimenti per la segnalazione del paragrafo di analisi MAN per fornire all'utente impostazioni definite utilizzate per generare una rete di associazione metabolica creata. Sei ceppi di Micromonospora chokoriensis e due macchie di Bacillus subtilis sono stati analizzati utilizzando i dati nel software IDBac. Seguendo le indicazioni nella scheda iniziale con i dati non elaborati, l'opzione clicca qui per convertire i file Bruker è stata selezionata e l'IDBac ha fornito istruzioni per ogni set di dati.

Ai passaggi di picco di picco di conversione e pre-elaborazione automatizzati, è stato creato un esperimento IDBac combinato trasferendo campioni di Bacillus e Micromonospora dai due esperimenti in un unico esperimento. L'analisi risultante ha comportato il confronto di spettri proteici utilizzando grafici a specchio che sono stati utili per valutare la qualità degli spettri e regolare le impostazioni di picco di picco. Qui viene mostrato uno screenshot dei risultati del clustering proteico con le impostazioni predefinite selezionate.

Il dendrogramma è stato colorato regolando la soglia sulla trama. Da notare che la netta separazione tra generi con M.chokoriensis e B.subtilis isola il clustering separatamente. Facendo clic e trascinando attraverso il dendrogramma proteico, è stato possibile creare rapidamente reti di associazione metabolica per confrontare solo i ceppi di B.subtilis, solo i ceppi di M.chokoriensis e tutti i ceppi contemporaneamente.

La funzione principale di queste reti è fornire ai ricercatori un'ampia panoramica del grado di sovrapposizione di metaboliti specializzati tra batteri. Quando si utilizzano nuovi dati, utilizzare i grafici mirror di IDBac per assicurarsi che i dati siano sensati e che gli spettri siano di alta qualità. Valuta criticamente il tuo progetto sperimentale e i risultati in ogni fase.

IDBac consente ai ricercatori di costruire piccole e diverse librerie di microrganismi per ulteriori indagini. Ciò riduce notevolmente i costi associati alle librerie microbiche tradizionalmente grandi e ridondanti. Poiché IDBac consente di visualizzare sovrapposizioni di metaboliti specializzati all'interno di gruppi filogenetici altamente simili, può essere utilizzato per generare domande e ipotesi di ricerca che collegano due campi tipicamente disconnessi.

L'acido formico è caustico e deve essere maneggiato in una cappa chimica dei fumi. Alcuni isolati ambientali possono rappresentare potenziali rischi per la salute e tutti i ceppi devono essere trattati come livello di biosicurezza due.