Name: Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri come generare organoidi cutanei 3D da cellule staminali pluripotenti indotte derivate da sangue del cordone ombelicale. Questo protocollo dettagliato permette di differenziare cheratinociti e fibroblasti per studi dermatologici avanzati.

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Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione la Corea Healthcare Technology R & D Project, Ministero della sanità, Welfare e famiglia, Repubblica di Corea (H16C2177, H18C1178).

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state eseguite in conformità con il laboratorio animali Welfare Act, la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e le linee guida e criteri per la sperimentazione di roditore forniti dalla cura istituzionale degli animali e Utilizzare il Comitato (IACUC) della scuola di medicina dell'Università cattolica della Corea del sud. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Università Cattolica di Corea (CUMC-2018-0191-01). Il IACUC e il dipartimento di animali di laboratorio (DOLA) della Università Cattolica di Corea, Songeui Campus accreditato presso il laboratorio di Corea eccellenza animale la Korea Food and Drug Administration nel 2017 e acquisita l'associazione di valutazione e Accreditamento di accreditamento completo internazionale laboratorio Animal Care International (AAALAC) nel 2018.
1. pelle di differenziazione delle cellule da cellule staminali pluripotenti indotte
<ol><li>Preparazione media Nota: Conservare tutte le medie a 4 ° C in un ambiente buio per fino a 3 mesi. Filtrare tutte le medie, utilizzando un sistema di filtro di 0,22 μm in polietersulfone prima dell'uso per la sterilizzazione. Tutte le medie erano disponibile in un volume totale di 500 mL.<ol>
<li>Preparare KDM1 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 1). Medium (DMEM dell'Aquila per volta di mix Dulbecco) / F12 medium (3:1) con 2% siero bovino fetale (FBS), 0,3 mmol/L di acido L-ascorbico, 5 μg/mL insulina e 24 adenina µ g/mL.</li>
		<li>Preparare KDM2 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 2). Mix definito del keratinocyte privo di siero medio (Vedi la Tabella materiali) con 0,3 mmol/l di acido L-ascorbico, 5 μg/mL insulina e adenina 10 μg/mL. Nota: Medium senza siero del keratinocyte definito è ottimizzata per supportare la crescita e l'espansione dei cheratinociti.</li>
		<li>Preparare KDM3 (mezzo di differenziazione del keratinocyte 3). Mix definito medium senza siero del keratinocyte e medium senza siero del keratinocyte (1:1) vedere la Tabella materiali particolari. Nota: Medium senza siero del Keratinocyte è ottimizzata per la crescita e il mantenimento dei cheratinociti.</li>
		<li>Preparare FDM1 (mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1). Media mix DMEM/F12 (3:1) con 5% FBS, 5 μg/mL insulina, adenina 0.18 mM e 10 ng/mL il fattore di crescita epidermico (EGF).</li>
		<li>Preparare FDM2 (mezzo di differenziazione del fibroblasto 2). Mix DMEM/F12 medium (1:1) con 5% FBS e 1% aminoacidi non essenziali.</li>
		<li>Preparare EP1 (epiteliali medie 1). Mix DMEM/F12 (3:1) con 4 mM L-Glutammina, 40 μM adenina, 10 della transferrina μg/mL, insulina 10 μg/mL e 0,1% FBS.</li>
		<li>Preparare EP2 (epiteliale medio 2). Mescolare EP1 e cloruro di calcio di 1,8 mM.</li>
		<li>Preparare EP3 (epiteliale medio 3, corneificazione medio). Media mix F12 con 4 mM L-Glutammina, 40 μM adenina, transferrina di 10 μg/mL, insulina 10 μg/mL, 2% FBS e cloruro di calcio di 1,8 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Generazione del corpo embrionale
	<ol>
<li>Generare il CBMC-iPSCs utilizzando il protocollo indicato in un precedente studio12.</li>
		<li>Cappotto piastre di coltura, utilizzando vitronectina. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm.<ol>
<li>Scongelare e risospendere 50 μL di vitronectin 0,5 mg/mL (concentrazione finale: 5 µ g/mL) con 5 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a temperatura ambiente (TA) per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mantenere il CBMC-derivato iPSCs al 100 mm rivestite con vitronectina piastra e cambiare il mezzo di iPSC (E8) tutti i giorni a 37 ° C con 10% CO2.</li>
		<li>Generare corpi embrionali (EBs) utilizzando il protocollo indicato in un precedente studio15 (descritti brevemente di seguito). Espandere iPSCs modificando il mezzo fino a quando le cellule hanno raggiunto la confluenza di 80%. 80% confluenza, rimuovere il supporto e lavare con PBS.</li>
		<li>Trattare le cellule con 1 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min e raccogliere le celle utilizzando 3 mL di terreno E8. Centrifugare le cellule a 250 x g per 2 min.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e applicare 5 mL di terreno E8 alle celle. Contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferimento di 1 x 106 cellule in una nuova provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule a 250 x g per 2 min.</li>
		<li>Risospendere le cellule trasferite con 2,5 mL di mezzo di formazione di EB con inibitore di chinasi Rho-collegata (ROCK) 10 μM. Goccia 1 x 104 celle (25 µ l/goccia) su un coperchio di cultura noncoated usando una pipetta multicanale di 10 – 100 μL. Modulo 100 EBs da 1 x 106 celle (1 x 104 cellule/1 EB). Girare il piatto e aspetta la goccia al coperchio. Nota: Inibitore di roccia è necessaria durante la fase di attaccamento nel processo di differenziazione e di manutenzione. Aggiungere l'inibitore di roccia soltanto in fase di aggregazione EB.</li>
		<li>Incubare le goccioline a 37 ° C con 5% CO2 per 1 giorni.</li>
		<li>Il giorno successivo, raccolto il 100 EBs e utilizzarli per la differenziazione. Lavare il coperchio della piastra con iPSC medio (medio E8) o PBS e raccolta del contenuto in una provetta conica da 50 mL. Mantenere l'EBs presso RT per 1 min di stabilirsi li. Aspirare il supernatante e risospendere il EBs con il mezzo di E8 mantenerle in una capsula di Petri di 90 mm fino la differenziazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti Nota: Per un regime della differenziazione del keratinocyte dal CBMC-iPSCs, Vedi Figura 1A.<ol>
<li>Raccolto il 100 EBs in una provetta conica 50 mL con iPSC medium o PBS. Mantenere a temperatura ambiente per 1 min per sistemarsi la EBs. Assicurarsi che si depositano nella parte inferiore del tubo conico. Aspirare il supernatante e risospendere il EBs con E8 medio con 1 proteina morfogenetica dell'osso ng/mL 4 (BMP4). Trasferire l'EBs a una capsula di Petri di 90 mm e mantenerli a 37 ° C con 5% CO2 per 1 giorni.</li>
		<li>Cappotto in piastre di coltura, utilizzando il tipo collageno di IV. Preparare 5 mL di collagene di tipo IV per rivestire un piatto di 100 mm.<ol>
<li>Scongelare e risospendere il tipo di soluzione di collagene IV (concentrazione finale: 50 µ g/mL) con 0,05 N HCl. aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a temperatura ambiente per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare). Nota: Prima di utilizzare le piastre, lavare i piatti 3 x con PBS per rimuovere qualsiasi acido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere l'EBs (punto 1.3.1) in una provetta conica da 50 mL e mantenerle a temperatura ambiente per 1 min di loro stabilirsi. Assicurarsi che si depositano sul fondo del tubo conico, aspirare il supernatante e risospendere il EBs in 6 mL di KDM1 con inibitore ROCK 10 µM. Trasferire l'EBs per il piatto di 100mm rivestite con collagene di tipo IV. Nota: Aggiungere l'inibitore di roccia soltanto in fase di attacco di EB.</li>
		<li>Tra 0 – 8 giorni, cambiare il mezzo ogni altro giorno per KDM1 con acido di 3 µM retinoico (RA) e 25 ng/mL ciascuno di BMP4 ed EGF. Mantenere l'EBs a 37 ° C con 5% CO2.</li>
		<li>Tra i giorni 9 – 12, modificare il mezzo ogni altro giorno KDM2 con 3 µM RA, BMP4 25 ng/mL e 20 ng/mL EGF.</li>
		<li>Tra i giorni 13 – 30, cambiare il mezzo ogni altro giorno a KDM3 con 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione del CBMC-iPSC in fibroblasti Nota: Per un regime della differenziazione dei fibroblasti dal CBMC-iPSCs, vedere Figura 2A.<ol>
<li>Cappotto piastre di coltura, utilizzando la matrice della membrana basale. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm.<ol>
<li>Scongelare la matrice della membrana basale (concentrazione finale: 600 ng/mL) e diluirla con DMEM/F12 medio. Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare a 37 ° C per 30 min. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve seccare).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccolto il 100 EBs in una provetta conica 50 mL utilizzando una pipetta con iPSC medium o PBS. Mantenere a temperatura ambiente per 1 min per sistemarsi la EBs. Assicurarsi che si depositano nella parte inferiore del tubo conico. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il EBs utilizzando una pipetta di 1.000 µ l in 6 mL di FDM1 con inibitore ROCK 10 µM. Trasferire l'EBs (con medie) per un piatto di 100mm rivestite con matrice della membrana dello scantinato e incubare a 37 ° C con 5% CO2. Aggiorna il FDM1 ogni altro giorno per 3 giorni. Nota: Aggiungere solo l'inibitore di roccia presso la fase di collegamento di EB.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 nM ossea morfogenetica (BMP 4) 4 FDM1 tra 4 e 6 giorni.</li>
		<li>Al giorno 7, cambiare il mezzo di FDM2 ogni altro giorno per 1 settimana.</li>
		<li>Al giorno 14, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM2 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1.</li>
		<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro, risospendere le 2 x 106 cellule con il mezzo di FDM1 e trasferire le cellule al piatto noncoated. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno.</li>
		<li>Cappotto di piastre di coltura, utilizzando collagene di tipo I. Preparare 5 mL per rivestire un piatto di 100 mm. Diluire la soluzione di collagene di tipo I (concentrazione finale: 50 µ g/mL) in 0.02 N di acido acetico. Aggiungere la soluzione ai piatti e incubare per 1 h. aspirare il materiale di rivestimento prima dell'uso (non deve asciugarsi) a RT. Nota: Prima di utilizzare le piastre, lavare i piatti 3 x con PBS per rimuovere l'acido.</li>
		<li>Il giorno 21, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM1 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1. Conteggio celle utilizzando un emocitometro e trasferimento 2 x 106 celle al tipo ho piatto rivestite con collagene 100 mm con FDM1 medio. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno.</li>
		<li>Il giorno 28, aggiungere 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule con 3 mL di FDM1 e centrifugare a 250 x g per 2 minuti rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di FDM1. Contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferire 2 x 106 cellule per un piatto di noncoated con FDM1 medio. Mantenere la cella a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno. Nota: iPSC-derivato fibroblasti proliferano come una cellula primaria del fibroblasto e passaggio fino a 10 passaggi. In questo studio, abbiamo utilizzato fibroblasti iPSC-derivato di due a cinque passaggi per ulteriori analisi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. applicazione di cellule differenziate derivate hiPSC
<ol><li>
Generazione di pelle 3D organoid
	<ol>
<li>Preparare tipo neutralizzato ho collagene sul ghiaccio, seguendo le raccomandazioni del produttore. Come concentrazione finale, utilizzare 3 mg/mL di collagene di tipo I (concentrazione stock di tipo I collagene è 3,47 mg/mL) e assicurarsi che il volume finale della miscela è di 5 mL. Calcolare il volume di 10 x PBS (volume finale/10 = 0,5 mL). Calcolare il volume di collagene da utilizzare tipo I (volume finale x concentrazione finale collagene / stock concentrazione di collagene = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calcolare il volume di 1 N NaOH (volume di collagene per essere utilizzato x 0,023 mL = 0,1 mL). Calcolare il volume di dH2O (finale volume - volume di collagene - il volume di PBS 10X - volume di 1 N NaOH = 4,32 5 mL mL-mL 0,5 mL-0,1 mL = 0,08). Mescolare il contenuto del tubo e tenerlo sul ghiaccio fino all'uso.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di EDTA per i fibroblasti iPSC-derivato dal passaggio 1.4.10 e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule indipendente, contare le celle utilizzando un emocitometro e trasferire 2 x 105 cellule ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifugare a 250 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule dei fibroblasti derivati iPSC in 1,5 mL di FDM1 e neutralizzato il tipo ho soluzione di collagene (1:1). Nota: Mescolare la soluzione delicatamente per evitare bolle.</li>
		<li>Collocare l'inserto di membrana su una micropiastra 6-pozzetti, trasferire la miscela all'inserto e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Nota: Non spostare le piastre.</li>
		<li>Dopo aver confermato la gelificazione, aggiungere 2 mL di terreno nella parte superiore dell'inserto e 3 mL per il fondo del pozzo. Incubare la matrice di fibroblasti e collagene a 37 ° C con 5% CO2 per 5-7 giorni, fino a quando la gelificazione è completa e non più contratti.</li>
		<li>Dopo la gelificazione completa, staccare i keratinocytes iPSC-derivato (dal punto 1.3.6) con EDTA. Aggiungere 1 mL di EDTA e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 2 min. raccogliere le cellule indipendente, contarli utilizzando un emocitometro e 1 x 106 cellule di trasferimento ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 250 x g per 2 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule di 1 x 106 a 50-100 µ l di calcio basso epiteliali terreno 1 (EP. 1).</li>
		<li>Aspirare la matrice di tutte le medie (Vedi punto 2.1.5) e 1 x 106 cellule dei keratinocytes iPSC-derivati su ogni strato di fibroblasti di seme. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% CO2 per 30 min. Nota: Non spostare la piastra e non aggiungere qualsiasi supporto per il fissaggio del keratinocyte.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di EP1 alla parte superiore dell'inserto e 3 mL di EP1 sul fondo del pozzo.</li>
		<li>Dopo 2 giorni, aspirare tutto il mezzo della piastra di inserimento della membrana e modificare il mezzo normale del calcio EP2 per 2 giorni.</li>
		<li>Dopo 2 giorni, aspirare tutto il mezzo e aggiungere 3 mL di terreno corneificazione solo verso il basso per generare un'interfaccia aria-liquido.</li>
		<li>Mantenere la pelle 3D organoid fino a 14 giorni a 37 ° C con 5% CO2 e modificare il mezzo ogni altro giorno. Raccogliere la pelle 3D organoid tagliando il bordo dell'inserto e utilizzarlo per un ulteriore studio di colorazione e di innesto di pelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Innesto di pelle
	<ol>
<li>Eseguire l'anestesia per inalazione in topi NOD/scid (maschile, vecchio 6 settimane), utilizzando un metodo standard, approvato dall'istituzione. Per innesto di pelle, radere il pelo della pelle dorsale di ogni mouse.</li>
		<li>Rimuovere una sezione di 1 cm x 2 cm di pelle del mouse, utilizzando forbici curve con il forcipe.</li>
		<li>Posto il CBMC-iPSC-derivati 3D pelle organoid sul sito difetto e sutura utilizzando un metodo di medicazione tie-over con i suturare di seta.</li>
		<li>Osservare i topi per 2 settimane e sacrificarli per l'analisi istologica. Il protocollo di colorazione è stato verificato in precedenti studi16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

IPSCs umane sono stati suggeriti come una nuova alternativa per la medicina rigenerativa personalizzata17. Paziente-derivato personalizzato iPSCs riflettono le caratteristiche dei pazienti che possono essere utilizzate per la modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e di trapianto autologo18,19. L'uso di derivati paziente iPSCs può anche superare problemi per quanto riguarda le cellule primarie, una mancanza di numeri di cell...

Pelle copre la superficie più esterna del corpo e protegge gli organi interni. La pelle ha diverse funzioni, tra cui la protezione contro gli agenti patogeni, assorbire e immagazzinare l'acqua, regolazione della temperatura corporea ed espellendo corpo rifiuti2. Gli innesti di pelle possono essere classificati a seconda dell'origine della pelle; gli innesti usando la pelle da un altro donatore sono denominati allotrapianti, e gli innesti usando la pelle del paziente sono gli autoinnesti. Anche se un autoinnesto è il trattamento preferito a causa del suo rischio basso rifiuto, le biopsie della pelle sono difficili da eseguire su pazienti con lesioni gravi o di un numero insufficiente di cellule della pelle. In pazienti con gravi ustioni, tre volte il numero delle cellule della pelle è necessario per coprire vaste aree. La disponibilità limitata delle cellule della pelle dal corpo di un paziente si traduce in situazioni dove è necessario il trapianto di allogenous. Un documento non autografo è temporaneamente utilizzato fino a trapianto autologo può essere eseguito poiché è rifiutata solitamente dal sistema immunitario dell'ospite dopo circa 1 settimana3. Per superare il rifiuto dal sistema immunitario del paziente, gli innesti devono provenire da una fonte con la stessa identità immune del paziente4.
IPSCs umane sono un emergenti fonte di cellule staminali terapia5. IPSCs umane vengono generati dalle cellule somatiche, utilizzando fattori di riprogrammazione come OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Utilizzando iPSCs umane supera le questioni etiche e immunologiche delle cellule staminali embrionali (ESCs)7,8. IPSCs umane hanno pluripotenza e possono differenziarsi in tre strati germinativi9. La presenza di HLA, un fattore critico nella medicina rigenerativa, determina la risposta immunitaria e la possibilità di rifiuto10. L'uso di derivati paziente iPSCs risolve i problemi di rigetto di limitazione e sistema immunitario cellulare-fonte. CBMC sono emerse anche come fonte alternativa cellulare per la medicina rigenerativa11. Obbligatorio HLA tipizzazione, che si verifica durante operazioni bancarie CBMC, facilmente utilizzabile per la ricerca e trapianto. Più ulteriormente, omozigoti iPSCs HLA-tipo può ampiamente applichi a vari pazienti12. Una banca CBMC-iPSC è un romanzo e una strategia efficace per la terapia cellulare e trapianto allogenico medicina rigenerativa12,13,14. In questo studio, usiamo CBMC-iPSCs, differenziate in cheratinociti e fibroblasti e generare strati della pelle 3D stratificato. Risultati da questo studio indicano che un organoid CBMC-iPSC-derivati della pelle di 3D è un nuovo strumento per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Componente del terreno di differenziazione per i fibroblasti</td></tr><tr><td>AggreWell Medium (terreno di formazione EB)</td><td>STEMCELL</td><td>05893</td><td>Formazione di EB</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fibronectina</td><td>abcam</td><td>ab23750</td><td>Marker dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-KRT14</td><td>abcam</td><td>ab7800</td><td>Marker dei cheratinociti</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Loricrina</td><td>abcam</td><td>ab85679</td><td>Marcatore dello strato corneo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p63 abcam</td><td></td><td>ab124762</td><td>Marcatore dei cheratinociti</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina</td><td>Santa cruz</td><td>sc-7558</td><td>Marcatore di fibroblasti</td></tr><tr><td>BAND AID TESSUTO FLESSIBILE</td><td>Johnson & </td><td></td><td>Johnson-Bendage</td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale (Matrigel)</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Componente del terreno di differenziazione per fibroblasti</td></tr><tr><td>Sutura BLACK SILK</td><td>AILEEE</td><td>SK617</td><td>Innesto cutaneo</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Componente del terreno epiteliale per organoide cutaneo 3D</td></tr><tr><td>Collagene di tipo I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>organoide</td></tr> <tr><td>cutaneo 3DCollagene di tipo IV</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-29010</td><td>Componente del terreno di differenziazione per cheratinociti</td></tr><tr><td>Definito terreno libero da siero per cheratinociti</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>Componente del mezzo di differenziazione per cheratinociti</td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>Componente del mezzo di differenziazione</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>Componente di mezzo di differenziazione</td></tr><tr><td>Essential 8 medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>FBS, qualificato</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Componente del terreno di differenziazione per fibroblasti e cheratinociti</td></tr><tr><td>Glutamax Supplement&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Componente del terreno di differenziazione per fibroblasti</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invtrogen</td><td>12585-014</td><td>Componente del mezzo di differenziazione per fibroblasti e cheratinociti</td></tr><tr><td>Forbice curva standard Iris</td><td>Professional</td><td>PC-02.10</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Cheratinocita Siero libero Medium</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td>Componente del mezzo di differenziazione per cheratinocita</td></tr><tr><td>acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Componente del terreno di differenziazione per cheratinociti</td></tr><tr><td>MEM Aminoacido non essenziale</td><td>Gibco</td><td>1140050</td><td>Componente del mezzo di differenziazione per fibroblasti</td></tr><tr><td>Pinze Meriam Pollice 16 cm</td><td>HIROSE</td><td>HC 2265-1</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc SCID/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td>Ceppo di topi per innesto cutaneo</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 90 mm</td><td>Hyundai Micro</td><td>H10090</td><td>Articoli in plastica</td></tr><tr><td>Ricombinante umano BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Componente del terreno di differenziazione per cheratinociti</td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td>Componente del terreno di differenziazione per cheratinocita</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Componente del mezzo di differenziazione per cheratinocita</td></tr><tr><td>T/C Petridish 100 mm, 240/bx</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Articoli in plastica</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T3705</td><td>Componente del terreno epiteliale per organoide cutaneo 3D</td></tr><tr><td>Inserti di membrana rivestiti di collagene Transwell-COL nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3492</td><td>Articoli in plastica per organoidi cutanei 3D&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life technologies</td><td>A14700</td><td>coltura iPSC</td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato</td><td>peprotech</td><td>1293823</td><td>coltura iPSC</td></tr></tbody></table>

generazione di pelle 3d organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

La pelle è il più grande organo del corpo e ha molte funzioni. La pelle agisce come una barriera fisica e protettore del corpo e regola le funzioni corporee. Biomimetica è l'imitazione dei modelli, sistemi e gli elementi della natura allo scopo di risolvere complessi problemi umani1. Pelle biomimetica è uno strumento utile per la ricerca di malattia in vitro e in vivo della medicina rigenerativa. Cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) hanno la caratteristica di proliferazione illimitata e la capacità di differenziazione di tre strati di germe. IPSCs umane vengono generati da varie cellule primarie, quali le cellule del sangue, cheratinociti e fibroblasti. Fra loro, cellule mononucleari del sangue ombelicale (CBMC) sono emersi come una fonte alternativa cellulare dal punto di vista della medicina rigenerativa allogenica. CBMC sono utili nella medicina rigenerativa perché umano del leucocita (HLA) l'antigene digitando è essenziale alla cella sistema bancario. Mettiamo a disposizione un metodo per la differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibroblasti e per la generazione di un 3D pelle organoid. Fibroblasti e cheratinociti CBMC-iPSC-derivati hanno caratteristiche simili ad una linea cellulare primaria. Il organoids pelle 3D vengono generati mediante la sovrapposizione di uno strato epidermico su uno strato dermico. Trapiantando questo organoid pelle 3D, viene generato un modello di topi umanizzati. Questo studio indica che un organoid 3D pelle umana iPSC-derivato può essere uno strumento di romanzo, alternativo per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

Pelle è composta, per la maggior parte, dell'epidermide e del derma. Cheratinociti sono il tipo principale delle cellule dell'epidermide, e fibroblasti sono il tipo principale delle cellule del derma. Lo schema di differenziazione del keratinocyte è riportato in Figura 1A. CBMC-iPCSc sono state mantenute in un piatto di vitronectin-rivestito (Figura 1B). In questo studio, abbiamo differenziato CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibro...

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale, o CBMC, sono emerse come una potenziale fonte cellulare per la medicina rigenerativa, perché la tipizzazione dell'antigene leucocitare umano è essenziale per il sistema bancario cellulare. Le cellule staminali pluripotenti indotte dal CBMC, o CMBC-iPSC, possono essere differenziate in cheratinociti e fibroblasti. Per generare organoide cutaneo 3D, stiamo usando la ricerca dermatologica.Inizia coltivando CBMC-iPSC su piastre da 100 millilitri rivestite di vitronectina a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica. Quando le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le colture con PBS e trattarle con un millilitro di EDTA millimolare per piastra per due minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con tre millilitri di mezzo E8 per piastra e raccogliere le cellule per centrifugazione.Sospendere di nuovo i pellet in cinque millilitri di mezzo E8 per il conteggio e trasferire una per 10-10-sesta celle in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere nuovamente le cellule trasferite con 2,5 millilitri di mezzo di formazione del corpo embrionale, integrato con 10-micromolare rho-associated chinasi, o inibitore ROCK. Utilizzare una pipetta per trasferire goccioline di celle da 125 microliter su un coperchio di piastra di coltura non rivestito.Quando tutte le goccioline sono state posizionate, girare il piatto per consentire alle goccioline di appendere dal coperchio per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, lavare il coperchio con un mezzo E8 fresco e trasferire la soluzione del corpo embrionale in un tubo conico da 50 millilitri. Lasciare che i corpi embrionali si sistemino per un minuto a temperatura ambiente, prima di aspirare il supernatante e sospendere di nuovo i corpi embrionali con mezzo E8 fresco per la loro coltura in una piastra di Petri di 90 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino alla loro differenziazione.Per la differenziazione dei cheratinociti CBMC-iPSC, sostituire il mezzo E8 dalla coltura del corpo embrionale con un mezzo E8 fresco, integrato con un nanogrammo per millilitro di proteina morfogenetica ossea 4 per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, raccogliere i corpi embrionali in un tubo conico da 50 millilitri come dimostrato e consentire ai corpi di stabilirsi per un minuto a temperatura ambiente. Successivamente, sostituire il supernatante con sei millilitri di mezzo di differenziazione dei cheratinociti 1, o KDM1, integrato con 10 inibitori ROCK micromolari, e trasferire i corpi embrionali in un piatto da 100 millimetri rivestito di collagene di tipo IV.Nei giorni da zero a otto di coltura, sostituire il mezzo a giorni nostri con KDM1 fresco, integrato con acido retinoico trimolare e 25 nanogrammi per millilitro ciascuno della proteina morfogenetica ossea 4 e fattore di crescita epidermico. Tra i nove e i 12 giorni, sostituire il mezzo a giorni nostri con KDM2, integrato con acido retinoico trimolare, 25 nanogrammi per millilitro della proteina morfogenetica ossea 4 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico. Tra i giorni 13 e 30, cambiare il mezzo a giorni diversi in KDM3, integrato con 10 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea 4 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico.Per la differenziazione dei fibroblasti CBMC-iPSC, sospendere nuovamente la coltura embrionale del corpo in sei millilitri di differenziazione dei fibroblasti medium 1, integrati con inibitore ROCK 10 micromolare, e trasferire la sospensione del corpo embrionale in un piatto da 100 millimetri rivestito con matrice di membrana basale. Dopo tre giorni di incubazione, trattare la coltura con proteina morfogenetica ossea 0,5 nanomolare 4 per quattro giorni, prima di cambiare il mezzo di differenziazione medio-fibroblasto 2. Il settimo giorno di cultura, cambia il mezzo in FDM2 a giorni diversi per una settimana.Il giorno 14 di coltura, staccare le cellule con EDTA millimolare come dimostrato e raccogliere le cellule in tre millilitri di differenziazione dei fibroblasti mezzo 2 per la centrifugazione. Sospendere di nuovo le cellule in cinque millilitri di mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1 per il conteggio e trasferire due volte 10-al-sesto cellule in un piatto non rivestito. Il giorno 21 di coltura, trasferire due volte 10-al-sesto cellule dalla coltura a un piatto di 100 millimetri rivestito di collagene di tipo I in mezzo di differenziazione dei fibroblasti freschi 1.Il giorno 28 di coltura, trasferire due volte-10-al-sei dei fibroblasti derivati da iPSC in un nuovo piatto non rivestito. Per la generazione tridimensionale di organoidi della pelle, raccogliere i fibroblasti derivati dall'iPSC dalla coltura e trasferire due volte 10-al-quinto cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet di fibroblasti in 1,5 millilitri di mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1 e 1,5 millilitri di soluzione di collagene di tipo I neutralizzata.Incubare le cellule su un inserto in una micropiatta a sei porri per 30 minuti a temperatura ambiente. Quando la soluzione si è solidificata, aggiungere due millilitri di mezzo alla parte superiore dell'inserto e tre millilitri sul fondo del pozzo. Quindi posizionare la matrice di fibroblasti nell'incubatrice per cinque o sette giorni, fino al completamento della gelazione, e la matrice non si contrae più.Alla fine dell'incubazione, raccogliere i cheratinociti derivati dall'iPSC e trasferire cellule uno-per-10-al-sesto in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet in 50-100 microlitri di mezzo epiteliale a basso calcio 1 e sostituire il mezzo sulla matrice dei fibroblasti con la soluzione cellulare cheratinocita. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, sostituire il mezzo nella parte superiore dell'inserto con due millilitri di mezzo epiteliale 1 e il mezzo nella parte inferiore bene con tre millilitri dello stesso e restituire la piastra all'incubatore.Dopo due giorni, sostituire il mezzo nell'inserto e il pozzo con il normale mezzo epiteliale di calcio 2 per altri due giorni di coltura. Il quarto giorno di coltura, rimuovere tutto il mezzo e aggiungere tre millilitri di mezzo di cornificazione solo sul fondo bene, per generare un'interfaccia aria-liquido. Quindi restituire la piastra all'incubatore per un massimo di 14 giorni prima di raccogliere l'organoide della pelle 3D per l'analisi a valle.I cheratinociti derivati da CBMC-iPSC hanno morfologie simili ai cheratinociti primari, e l'espressione dei marcatori cheratinociti è aumentata in queste cellule. I fibroblasti derivati da CBMC-iPSC hanno una morfologia simile ai fibroblasti primari, e l'espressione del marcatore di cellule staminali pluripotenti Oct-4 è regolata verso il basso, mentre i marcatori di fibroblasti sono regolati verso l'alto. Lo spessore dell'organoide della pelle 3D aumenta durante la coltura 3D, confermando che l'organoide della pelle 3D è generato da cheratinociti e fibroblasti derivati da iPSC.Dopo due settimane, un innesto organoide della pelle 3D trapiantato si incorpora in modo efficiente in una pelle di topo ricevente, come confermato dall'analisi HNE. Inoltre, i marcatori di maturazione dei cheratinociti e differenziazione epidermica sono espressi negli organoidi della pelle 3D derivati da CBMC-iPSC, dimostrando una differenziazione funzionale, un innesto efficiente e una guarigione efficace dei difetti della pelle del topo. Usiamo in passato con l'alto mezzo calcio che induce strati stratificati di organoide della pelle 3D a imitare vicino alla pelle.l'analisi mostra che la pelle è stratificata. I CBMC-iPSC sono una potenziale fonte cellulare per gli innesti cutanei e gli organoidi della pelle 3D derivati da CBMC-iPSC possono essere utilizzati in studi relativi alla dermatologia, allo screening cosmetico e alla medicina rigenerativa.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video descrive il protocollo dettagliato per la generazione di ricostruzioni cutanee organotipiche in vitro 3D per studiare la progressione del melanoma. Questo modello di pelle imita sia l'architettura che la complessità multicellulare degli organi in vivo.

Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

Questo video mostra un test per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le iPSC umane sono indotte a formare corpi embrioidi (EB). Gli EB vengono coltivati su un'impalcatura polimerica utilizzando un mezzo di induzione, promuovendo la differenziazione in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi. Infine, gli EB vengono incorporati in una matrice e trasferiti in un mezzo di mantenimento per la formazione di organoidi cerebrali.

Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.

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Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

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Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L'enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell'agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.

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Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Questo protocollo delinea un metodo per la produzione di organoidi cutanei contenenti follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura planare e fisiologicamente rilevante di interfaccia aria-liquido per replicare l'architettura e la funzione della pelle.

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

L'editing genetico mediato da TALEN presso il locus AAVS1 consente l'aggiunta di transgeni ad alta efficienza nelle iPSC umane. Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione delle iPSC per la somministrazione di TALEN e del vettore donatore, la trasfezione delle iPSC e la selezione e l'isolamento di cloni di iPSC per ottenere un'integrazione mirata di un gene GFP per generare linee reporter.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Scopri come generare organoidi cutanei 3D da cellule staminali pluripotenti indotte derivate da sangue del cordone ombelicale. Questo protocollo dettagliato permette di differenziare cheratinociti e fibroblasti per studi dermatologici avanzati.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

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