Valutazione della proliferazione dei cheratinociti su bi - e tri - dimensionale substrati di collagene di tipo I

Questo video mostra come preparare due diversi tipi di substrati di coltura cellulare utilizzando collagene di tipo I e metodo di coltura bidimensionale e tridimensionale. Il metodo di coltura tridimensionale è considerato per l'ambiente biologico, dimostrando come preparare facilmente un substrato di coltura tridimensionale è utile per gli studi. In numerosi tipi di cellule, nonostante utilizzi lo stesso collagene, il comportamento cellulare varia considerevolmente tra substrati bidimensionali e tridimensionali.

Usando il substrato di coltura tridimensionale, il comportamento cellulare più simile a quello degli organismi viventi potrebbe essere facilmente esaminato. Questo metodo è molto semplice e richiede un reagente speciale minimo. La dimostrazione visiva è fondamentale, perché mentre vogliamo dimostrare che questo metodo è facilmente tentato, il gel tridimensionale è fragile e gestirlo correttamente è molto importante.

Per iniziare, preparare il mezzo di coltura appropriato. Per iniziare a preparare il collagene, posizionare 10x PBS, acqua deionizzata, collagene, una piastra di coltura di 96 pozzetti e un tubo vuoto da due millilitri sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta, aggiungere 1,12 millilitri di acqua deionizzata al tubo vuoto a due millilitri.

Aggiungere 200 microlitri di 10x PBS all'acqua deionizzata e scuotere delicatamente il tubo più volte. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 0,66 millilitri di collagene al tubo a due millilitri. Scuotere delicatamente e rapidamente il tubo più volte.

Versare 100 microlitri di questa soluzione di collagene in ogni pozzo della piastra di coltura da 96 porri, assicurandosi di coprire l'intera superficie dei pozzi. Scuotere delicatamente la piastra con un movimento da sinistra a destra. Incubare la piastra di coltura in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi inclinare la piastra per confermare la gelazione del collagene e spostare la piastra di coltura su una panca pulita. Versare delicatamente 150 microlitri di K110 sui gel tubazioni lungo la parete del pozzo. Incubare in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo questo, spostare la piastra di coltura su una panchina pulita. Immediatamente prima della coltura cellulare, utilizzare una pipetta per scartare delicatamente il K110. Utilizzare innanzitutto una pipetta per aggiungere quattro microlitri di collagene a 1,2 millilitri di un acido cloridrico millimolare in un tubo da 1,5 millilitri e mescolare delicatamente.

Versare 100 microlitri di questa miscela di collagene in ogni pozzo di un nuovo piatto di coltura da 96 po '. Agitare delicatamente la piastra con un movimento da sinistra a destra e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo questo, scartare la soluzione di collagene.

Utilizzando una pipetta, lavare ogni bene con PBS. Aggiungere 150 microlitri di 1%BSA e PBS a ogni pozzo della piastra di coltura e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Prima delle impostazioni cultura delle celle, scartare la soluzione 1%BSA.

Per iniziare, preparare le cellule FEPE1L-8 e l'inibitore del K110, della tripparina e della tripparina come delineato nel protocollo di testo. Rimuovere con cura il mezzo dal piatto di coltura e utilizzare una pipetta per aggiungere tre millilitri dello 0,05% di tripside. Riposizionare il piatto nell'incubatrice di anidride carbonica e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi utilizzare la microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 10x per verificare la presenza di distacco cellulare dalla superficie del piatto di coltura. Aggiungere tre millilitri di inibitore della tripside e utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule staccate in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Centrifuga a 200 volte g per cinque minuti.

Successivamente, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di K110. Utilizzare la microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 10x per contare le cellule e diluire le celle con K110 a una densità cellulare di 50.000 celle per millilitro. Seminare delicatamente 0,1 millilitro della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra di coltura tubando lungo la parete del pozzo.

Incubare in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo appropriato. Prima mescolare 130 microlitri di sale tetrazolio e WST-8 con 1,3 millilitri di K110 preriscaldato in un tubo da due millilitri. Spostare la piastra di coltura su una panca pulita e utilizzare una pipetta per scartare delicatamente il K110 dai pozzi.

Lavare delicatamente via e le cellule non arent con K110. Quindi aggiungere 110 microlitri di K110 mescolati con WST-8 ad ogni pozzo. Incubare in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per due ore.

Dopo questo, spostare la piastra di coltura su una panchina pulita. Raccogli 100 microlitri del mezzo condizionato da ogni pozzo e spostalo nei pozzi di una nuova piastra di coltura da 96 porti. Usando un lettore di micropiastrine, misurare l'assorbanza a 450 nanometri e stimare il numero di cellule vitali.

La morfologia cellulare si osserva sulle forme non fibrose e fibrille sono mostrate qui. Nelle prime due ore di coltivazione, le cellule aderiscono e si diffondono su entrambe le forme di collagene. Tre giorni dopo la semina, le cellule in forma non fibrosa continuano a diffondersi e il numero di cellule aumenta, mentre le cellule sulla forma fibrille mostrano una diffusione limitata.

Le cellule FEPE1L-8 continuano a proliferare sulla forma non fibrosa del collagene di tipo I e sulle superfici dei piatti non trattate. Al contrario, le cellule non proliferano sulla forma fibrilla. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che il gel tridimensionale è molto fragile.

Bisogna fare attenzione a garantire che la soluzione o le punte non vengano a contatto diretto con i gel. Questo metodo può essere modificato in numerosi modi. Ad esempio, per mescolare i componenti della membrana del campione, si può creare un substrato di coltura cellulare che imita una membrana basale.

In numerosi casi, le funzioni della matrice extracellulare nei corpi viventi sono sconosciute. Per colturare le cellule sulla coltura tridimensionale, si può esaminare la funzione della componente della matrice extracellulare che è più simile al corpo vivente. Applicando tecniche tridimensionali di coltura del gel, si può testare efficacemente la concentrazione di farmaci nelle cellule.

Questo protocollo, basato sul proprio scopo, potrebbe essere utilizzato per sviluppare complessi substrati di coltura tridimensionale mescolando altri componenti EGM o fattori di crescita durante le gelazioni.