Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

L'obiettivo di questa procedura è quello di ingegnerizzare un aumento di tessuti tridimensionali identici che sono incorporati in un gel di collagene per l'uso in molti contesti sperimentali, come determinare l'influenza dello stress meccanico sulla morfogenesi ramificata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella morfogenesi dei tessuti, come determinare i meccanismi alla base del comportamento cellulare collettivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la geometria dei tessuti ingegnerizzati è controllata e riproducibile, consentendo una manipolazione e una misurazione precise di fattori fisici e biochimici.

Pertanto, la dimensione del campione è sufficientemente ampia da consentire di trarre conclusioni con elevata confidenza statistica. Inizia preparando un master in silicio fotomodellato con l'array desiderato utilizzando tecniche di fotolitografia standard. Il modello utilizzato in questo video è costituito da strutture rettangolari distanziate di 200 micron l'una dall'altra.

Successivamente, mescola 50 grammi di PDMS combinando il prepolimero e un agente indurente in un piatto usa e getta con un rapporto 10:1. Quindi, mettere la miscela sotto vuoto per 15-30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria che sono state introdotte durante il processo di miscelazione. Posizionare il lato strutturato del master in silicone verso l'alto nella barca di pesa di plastica e versare la soluzione PDMS degassata sopra lo stampo.

Quindi, metti la pirofila in forno e polimerizza il PDMS a 60 gradi Celsius per 12 ore. Una volta indurito, rimuovere il PDMS e il master dal contenitore di plastica. Separare con cura il PDMS dal wafer di silicio.

Quindi, utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere l'eccesso di PDMS intorno alle caratteristiche stampate. Ora, usa una lama di rasoio per tagliare il PDMS modellato in singoli timbri rettangolari. Conserva questi timbri con il lato rivolto verso l'alto in una capsula di Petri pulita di 100 millimetri di diametro.

Quindi, preparare un nuovo lotto di soluzione PDMS degassata utilizzando lo stesso rapporto 10:1 tra prepolimero e agente indurente. Centrifugare due o tre grammi di questa soluzione su una capsula di Petri di 100 millimetri di diametro, quindi polimerizzare il PDMS per 12 ore a 60 gradi Celsius. Quindi, utilizzare una lama di rasoio per tagliare lo strato sottile di PDMS in rettangoli da utilizzare come supporti per i timbri.

Per ogni timbro sono necessari due supporti. Una volta tagliati tutti i supporti, sterilizzare i timbri e i supporti PDMS immergendoli in etanolo al 70% ed essiccandoli utilizzando un aspiratore in una cappa di biosicurezza. In una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 microlitri di 1% BSA in PBS sulla parte superiore di ogni timbro.

Posiziona i timbri coperti di goccioline a quattro gradi Celsius per un minimo di quattro ore per assicurarti che il BSA si assorba sulla superficie del timbro. Quindi, rimettere i timbri nella cabina di biosicurezza e aspirare la soluzione BSA dai timbri PDMS. Successivamente, lavare due volte le superfici dei timbri con 50 microlitri di terreno di coltura cellulare.

Aspirare il terreno dopo ogni lavaggio. Disporre una piastra per coltura tissutale di 35 millimetri di diametro per ogni timbro PDMS. In ogni piatto, stendere due supporti PDMS separati da una distanza leggermente inferiore alla lunghezza dei timbri PDMS.

Quindi, usa un paio di pinzette per raccogliere vetrini di vetro di 15 millimetri di diametro e sterilizzarli usando etanolo al 70%. Aspirare il liquido in eccesso dai vetrini coprioggetti tenendoli con le pinzette e poi conservarli in una capsula di Petri separata. Quindi, erogare 50 microlitri di una miscela di collagene da quattro milligrammi per millilitro direttamente su ciascun timbro per rivestire uniformemente la superficie dei timbri PDMS.

Usando le pinzette, raccogli ciascuno dei timbri PDMS rivestiti di collagene e capovolgili delicatamente. Abbassare i timbri invertiti con il collagene rivolto verso il basso sopra i supporti PDMS nelle piastre di coltura tissutale. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, erogare 50 microlitri della miscela di collagene rimanente su ciascuno dei vetrini coprioggetti circolari e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. A questo punto, raccogli il tuo tipo di cellula di interesse. Qui, abbiamo cellule epiteliali mammoriche di topo EpH4 che abbiamo sospeso a una concentrazione compresa tra uno e 10 milioni di cellule per millilitro.

Ora, rimuovere i campioni di collagene gelificato dall'incubatore. Usando le pinzette, sollevare delicatamente i timbri PDMS verso l'alto per staccarli dal collagene modellato e scartarli. È importante sollevare il timbro verso l'alto per non distorcere le caratteristiche del gel di collagene.

Erogare 30 microlitri della sospensione cellulare concentrata sulla superficie di ciascun gel di collagene contenente cavità stampate della geometria desiderata. Osservare le cellule al microscopio a campo chiaro mentre si agitano delicatamente le piastre da un lato all'altro per favorire l'insediamento delle cellule all'interno delle cavità. Le cavità devono essere riempite entro cinque minuti.

Per rimuovere le cellule in eccesso intorno alle cavità, inclinare ogni piatto di coltura tissutale su un lato ed erogare delicatamente 400 microlitri di terreno di coltura cellulare sulla superficie del gel di collagene. È importante lavare delicatamente erogando lentamente il terreno di coltura sul gel mentre si inclina il piatto in modo da rimuovere le cellule in eccesso sulla superficie del gel e non spostare le cellule nelle cavità del gel. Aspirare il liquido e ripetere il lavaggio altre due volte.

Controllare i gel di collagene al microscopio tra un lavaggio e l'altro per osservare quando le cellule in eccesso sono state risciacquate. Dopo che le cellule in eccesso sono state rimosse dalle cavità piene di cellule, posizionare le piastre di coltura tissutale in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, usando le pinzette, capovolgere delicatamente i vetrini di copertura in vetro rivestiti di collagene e posizionarli sopra gli stampi di collagene riempiti di cellule in modo che il collagene del vetrino coprioggetti formi un tappo sopra le cavità riempite di cellule.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta che i cappucci di collagene hanno aderito agli stampi di collagene riempiti di cellule, erogare lentamente da due a 2 1/2 millilitri di terreno di coltura cellulare sopra i vetrini di copertura sopra i gel e coltivare i campioni a 37 gradi Celsius per uno o tre giorni. Queste immagini provengono da viste a basso e ad alto ingrandimento degli array modellati in un gel di collagene di tipo I prima della semina cellulare.

La forma dei pozzetti è determinata dalla forma delle caratteristiche sul master in silicio. Qui, i pozzetti rettangolari sono stati riempiti con cellule epiteliali mammoriche. In questo esempio, ogni pozzetto rettangolare di 200 x 50 micron contiene circa 80-100 celle.

24 ore dopo la semina cellulare, è stato osservato che le cellule aderiscono l'una all'altra all'interno dei pozzetti per formare un tessuto. 24 ore dopo l'aggiunta di un fattore di crescita HGF al terreno di coltura, i tessuti sono in fase di morfogenesi ramificata. Una delle proteine coinvolte nella migrazione cellulare è la chinasi di adesione focale che, come si può vedere da questa immagine composita, aumenta alle estremità dei pozzetti dove si verifica tipicamente la ramificazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia della forza di trazione, la RT-PCR in tempo reale e il Western Blotting, al fine di determinare le forze esercitate dalle cellule durante la migrazione e i cambiamenti nei livelli di trascrizione e proteine dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare questo modello di coltura cellulare 3D in cui i tessuti di geometria iniziale definita sono incorporati all'interno di un gel di collagene.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.