Name: Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati allinterno di matrice extracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara a ingegnerizzare tessuti epiteliali tridimensionali in gel di collagene per studiare la morfogenesi tissutale. Questo metodo consente manipolazione precisa di fattori fisici e biochimici con elevata riproducibilità.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), il Packard Fondazione David e Lucile, la Camille &amp; Henry Dreyfus Foundation, e la Burroughs Welcome Fondo. ASP è stato sostenuto in parte da un Charlotte Elizabeth Procter onorifico Fellowship.

1. preparazione di soluzioni <ol><li> Per preparare un 5 mg / ml soluzione di insulina, diluire l&#39;insulina magazzino in polvere con 5 mm di acido cloridrico (HCl) in DH 2 O (500 mg di insulina in 100 ml di solvente). Preparare 100 ml di solvente con l&#39;aggiunta di 50 ml di HCl concentrato a 100 ml di acqua distillata (DH 2 O). </li><li> Per fare una soluzione 1x di PBS, diluire la soluzione madre 10x tampone fosfato (PBS) a 1x con dH 2 O in condizioni sterili. </li><li> Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) elastomero soluzione come segue: mescolare il prepolimero PDMS insieme con il catalizzatore in un rapporto di 10: 1 (w w). </li><li> Preparare il terreno di coltura cellulare come segue: a 500 ml di Modified Eagle Medium azioni di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM / F-12), aggiungere 10 ml di sterile siero fetale bovino (FBS), 500 ml di reagente di gentamicina, e 500 microlitri di 5 mg / ml di insulina. </li><li> Per preparare l&#39;1% di siero albumina bovina (BSA) in soluzione PBS 1x, aggiungere 1% (w: V) di polvere di BSA a 1x PBS e mescolare accuratamente. </li><li> Per preparare un 4 mg / ml soluzione di tipo bovino neutralizzato collagene, aggiungere 50 microlitri 10x soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) tampone, 30 microlitri 0,1 N di idrossido di sodio (NaOH), mezzo di coltura cellulare 30 microlitri, e 400 ml di archivio collagene ad un freddo 1,5 ml provetta. Mescolare lentamente pipettando su e giù; evitare di introdurre bolle. Per rimuovere eventuali bolle, centrifugare brevemente la miscela a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione fissativa diluendo 16% paraformaldeide 1: 4 (v: v) in PBS 1x. </li><li> Preparare una soluzione di etichettatura nuclei diluendo la soluzione madre nuclei di etichettatura 1: 1.000 (v: v) in PBS 1x. </li><li> Preparare una soluzione salina tamponata con fosfato 0,3% e soluzione detergente (PBST) mescolando 1x PBS con 0,3% (v: v) detergente. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio diluendo capra siero 1:10 (v: v) nello 0,3% PBST. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo primario per una particolare proteina di interesse diluendo primary anticorpi (per esempio, coniglio anti-adesione focale chinasi (FAK)) 1: 200 (v: v) in tampone di bloccaggio. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo secondario diluendo un anticorpo coniugato sonda fluorescente (per esempio, capra anti-coniglio) 1: 1.000 (v: v) in tampone di bloccaggio. </li></ol> 2. Preparazione di francobolli elastomerici per micropatterning 3D Nota: francobolli elastomerici sono realizzati con PDMS. <ol><li> Fare una soluzione PDMS allo stesso rapporto come descritto al punto 1.3 e mescolare accuratamente. Mettere il composto in una camera a vuoto per 15-30 minuti per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria che sono stati introdotti durante il processo di miscelazione. </li><li> Versare la soluzione degasato in una plastica pesare barca o un piatto di Petri contenente un maestro di silicio che viene litografia modellato con le caratteristiche di geometria desiderata. Per ottenere risultati ottimali, curare la soluzione PDMS a 60 ° C per ~ 12 ore. Nota: I maestri di silicio sono altamente personalizzabili; Questo protocollo utilizza strutture rettangolari con dimensioni di 50micron x 200 micron x 50 micron distanziati di 200 micron a parte. I maestri di silicio possono essere effettuate utilizzando tecniche di fotolitografia standard. Brevemente, un fotoresist a base epossidica è spin-rivestito sulla cima di un wafer di silicio. Una maschera dettaglio le caratteristiche desiderati del timbro è posto sulla parte superiore della fetta photoresist rivestite, che viene poi esposto a luce UV. Le caratteristiche desiderate non bloccate dalla maschera sono esposti alla luce e il fotoresist in questi luoghi diventa reticolato, mentre il resto del rivestimento photoresist è solubile e può essere lavato via. </li><li> Dopo il PDMS ha curato circa le caratteristiche desiderate sul master silicio, rimuovere le PDMS e master dal contenitore di plastica. separare con attenzione il PDMS dal wafer di silicio e rimuovere PDMS in eccesso provenienti da tutto le caratteristiche impresse con una lama di rasoio pulito. </li><li> Ora tagliare il PDMS fantasia con le caratteristiche impresso in singoli timbri rettangolari (~ 8 mm x 5 mm), con una lama di rasoio. Conservare queste feature-side-up in un CLEuna capsula di Petri da 100 mm di diametro. </li><li> Inoltre, utilizzare la soluzione PDMS descritto al punto 1.3 per rendere supporti per i francobolli rettangolari. </li><li> Utilizzando un coater rotazione, diffondere ~ 2-3 g della soluzione PDMS uniformemente su 100 mm di diametro Petri e curare le PDMS per ~ 12 ore a 60 ° C come al punto 2.1. Poi, usando una lama di rasoio, tagliare lo strato sottile di PDMS in rettangoli (di ~ 5 mm x 2 mm). Nota: due supporti sono necessari per ogni francobollo PDMS fatto in fase 2.3. I supporti possono essere memorizzati nei 100 mm di diametro Petri che contiene i PDMS francobolli. </li><li> Prima che i PDMS francobolli e supporti possono essere utilizzati per coltura cellulare, sterilizzare in immersione in 70% etanolo e secco utilizzando un aspiratore in un armadio biosicurezza (cappa di coltura cellulare). </li></ol> 3. Preparazione del 3D epiteliale tessuti <ol><li> In un armadio biosicurezza, aggiungere una goccia di circa 50 ml di 1% BSA in PBS all&#39;inizio di ogni timbro. Posizionare la goccia coperto francobolli a 4 ° C per un minimum di 4 ore per assicurare che la BSA adsorbe sulla superficie del timbro. </li><li> Aspirare soluzione BSA dalle PDMS francobolli. </li><li> Lavare le superfici dei timbri due volte con mezzo di coltura cellulare (50 microlitri a lavaggio per provvisorie dovrebbero essere sufficienti), aspirando dopo ogni lavaggio. </li><li> Maneggiare il PDMS francobolli e supporti sterilizzati utilizzando curve pinzette in acciaio inox. In un armadio biosicurezza, lay out uno di 35 mm di diametro piatto di coltura di tessuti per ogni timbro PDMS. In ogni piatto, stabiliscono due supporti PDMS separate da una distanza leggermente inferiore alla lunghezza delle PDMS francobolli. </li><li> Utilizzando le pinzette, sterilizzare il maggior numero di vetrini circolari (15 mm di diametro, # 1) in quanto vi sono PDMS francobolli con il 70% di etanolo. Aspirare il liquido in eccesso dai vetrini mentre tenendole con le pinzette. Conservare i coprioggetti lavati in un 100 mm di diametro Petri piatto a parte. </li><li> Dispensare ~ 50 ml di miscela di collagene in modo uniforme rivestire la superficie di ogni timbro PDMS. </li><li> Raccogliereogni PDMS collagene rivestite timbro con le pinzette e delicatamente invertono. Abbassare i francobolli invertiti sulla parte superiore del PDMS supporti disposti in coltura tissutale da 35 mm di diametro elargiti tale che il collagene è tra il timbro e il fondo del piatto di coltura tissutale. Incubare le piastre a 37 ° C per 30 min. </li><li> Distribuire ~ 50 microlitri della miscela di collagene rimanente su ciascuno dei coprioggetto circolari (in seguito, questi saranno posizionati sopra i tessuti ingegnerizzati loro incapsulare completamente in collagene) e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Ottenere un 100 mm di diametro coltura di tessuti piatto contenente cellule epiteliali (es. EpH4 topo cellule epiteliali mammarie) al ~ 40% di confluenza. Aspirare il terreno di coltura delle cellule e lavare una volta con 10 ml di PBS 1X. Aggiungere 2 ml di tripsina per le cellule e incubare a 37 ° C per 5-10 min. </li><li> Aggiungere 8 ml di terreno di coltura fresco al piatto coltura di tessuti contenenti cellule trypsinized, staccando eventuali cellule aderenti rimanenti dal piatto. Mescolare delicatamente pipettando e spostare la miscela di cellule in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 100 g per 5 min. </li><li> Aspirare il supernatante dal tubo conico e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura cellulare. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule per determinare la concentrazione della sospensione. Regolare il volume sospensione per ottenere una concentrazione finale di 10 ~ 6 -10 7 cellule / ml. </li><li> Rimuovere i campioni di collagene gelificata dal termostato. Utilizzando le pinzette, sollevare delicatamente i PDMS francobolli dritto verso l&#39;alto per staccarli dal collagene stampata e gettarli. </li><li> Pipettare ~ 30 microlitri della sospensione cellulare concentrata sulla superficie di ciascun gel di collagene contenente cavità sagomate di geometria desiderata. Osservare le cellule al microscopio campo chiaro con un obiettivo 10X / 0.25 NA agitando delicatamente il lato piatti a lato di promuovere la cella di stabilirsi all&#39;interno delle cavità. Le cavità devono essere riempiti entro ~ 5 min. </li><li> per rimuovi cellule in eccesso intorno cavità, inclinare ciascun tessuto piatto di coltura su un lato ed erogare delicatamente ~ 400 microlitri terreno di coltura cellulare sulla superficie del gel di collagene. Aspirare il liquido e ripetere il lavaggio 1-2 più volte, controllando i gel di collagene al microscopio tra ogni lavaggio. </li><li> Dopo che le cellule in eccesso sono state cancellate da tutto cavità cellulari pieno nello stampo collagene, posizionare le piastre di coltura dei tessuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 15 min. Poi, con le pinze, capovolgere delicatamente il coprioggetto classe collagene rivestite e metterli in cima stampi collagene cellule ripiene che il collagene dalle coprioggetti forma un cappuccio sulle cavità cellula-riempita. Incubare i campioni a 37 ° C per 15 min. </li><li> Una volta che i tappi di collagene hanno aderito allo stampo collagene cell-riempite, dispensare ~ 2-2.5 mezzo di coltura cellulare ml lentamente nel vetrino di vetro sopra i gel. Culture i campioni a 37 ° C per 1-3 giorni. Nota:24 ore dopo la semina iniziale, i tessuti epiteliali possono essere trattati con fattori di crescita come il fattore di crescita epidermico (EGF) o fattore di crescita degli epatociti (HGF) per indurre ramificazione. </li></ol> 4. immunofluorescenza e Image Analysis <ol><li> Aspirare il terreno di coltura cellulare dai piatti di coltura di tessuti e aggiungere soluzione fissativa sufficiente a coprire i gel di cellule contenenti. Incubare i piatti a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 200 rpm. </li><li> Aspirare il fissativo, riempire le piastre di coltura tissutale con 1x PBS, e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 200 rpm. Ripetere l&#39;operazione due volte per tre lavaggi totali. </li><li> Per etichettare i nuclei: Aspirare il PBS dal piatto di coltura tissutale e sostituirlo con una soluzione Hoechst. Incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Per colorare per FAK o di un altro indicatore che è rilevabile con gli anticorpi, passare al punto 4.5. </li><li> Aspirare la soluzione di etichettatura nucleare e lavare la g cellule contenentiels tre volte con PBS 1x come nel passo 4.2. campioni macchiati possono essere conservati in 1x PBS a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per colorare per una proteina di interesse: Aspirare il PBS dai piatti di coltura tissutale, aggiungere 300 ml di 0,3% PBST, e incubare il campione a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aspirare il PBS, coprire il gel con tampone di bloccaggio, e incubare su shaker (200 rpm) a temperatura ambiente per ~ 4 ore. </li><li> Aspirare il tampone bloccante, coprire il gel con una soluzione di anticorpo primario e incubare su un agitatore a 200 rpm notte a 4 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione di anticorpo primario, aggiungere la soluzione PBST 0,3%, e incubare su un agitatore a 200 rpm a temperatura ambiente per 30 min. Aspirare il PBST e ripetere ogni 30 minuti per 3-4 ore. </li><li> Ripetere i punti 4.7 e 4.8, questa volta incubazione con la soluzione di anticorpo secondario. Avvolgere le piastre di coltura dei tessuti con un foglio di alluminio per evitare photobleaching dell&#39;anticorpo secondario. Dopo la Final lavaggio, campioni macchiati può essere memorizzato in 1x PBS a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per visualizzare campioni, utilizzare un 10X / 0.30 obiettivo NA focalizzata sul piano di simmetria dei tessuti epiteliali. </li><li> Per visualizzare i nuclei delle cellule, campioni di immagini fisse marcati con un marcatore nucleare utilizzando un obiettivo NA 10X / 0.30 sotto illuminazione UV. </li><li> Per visualizzare campioni colorati per una proteina di interesse, immagine utilizzando un obiettivo 10X / 0.30 NA su un microscopio invertito a fluorescenza. </li><li> Per creare mappe delle frequenze di proteine ​​colorazione dei tessuti multipli (tipicamente 50 o più) di geometria iniziale identici, prima importazione ognuna delle immagini utilizzando il software di analisi di immagine standard (vedi Materiali) e convertirli in 8-bit in scala di grigi. </li><li> Per soglia di queste immagini, convertirle in binario (cioè, mezzitoni / bianco e nero) per la definizione di un punto di taglio in scala di grigi; valori di grigio inferiori alla soglia diventano neri, e quelli sopra della soglia diventano bianchi. Poi, unireciascuna delle singole immagini binarie in una singola pila. </li><li> Successivamente, registrare le immagini sovrapposte (cioè allineare o della partita) nel software di analisi. Molti pacchetti software di analisi delle immagini dotate di un plug-in di registrazione liberamente disponibile. <ol><li> Utilizzare ogni immagine in una pila come un modello per l&#39;allineamento dell&#39;immagine successiva, tale che le immagini nella intero stack sono allineate per propagazione. Infine, overlay (progetto) le immagini nella serie di immagini allineate sulla base di intensità media per formare una singola immagine con una mappa frequenza dei pixel. Questa immagine può quindi essere color-coded utilizzando un software di editing delle immagini di scelta 10,11. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).</li>
<li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK%28ERK-1%2C2%29+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li>
<li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li>
<li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li>
<li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li>
<li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458(2015).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li>
<li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo sopra descritto delinea un metodo per produrre tessuti epiteliali identici di forma predefinita, consentendo il controllo spaziale dello stress meccanico sperimentato dalle cellule del tessuto. Uno stampo elastomerico viene utilizzato per creare cavità nel collagene di tipo I che vengono poi riempite con cellule epiteliali e ricoperte da uno strato aggiuntivo di collagene in modo che le cellule siano completamente incapsulate in un ambiente di matrice di collagene 3D. L'ulteriore coltura di questi tessuti e...

Lo sviluppo dei tessuti epiteliali ramificati, noto come ramificazione morfogenesi, è regolata da, e fattori ambientali fisici derivati ​​dalle cellule. Nella ghiandola mammaria, branching morfogenesi è un processo iterativo attraverso il quale guidata migrazione cellulare collettiva crea un&#39;architettura ad albero. Il primo passo è la formazione gemma primaria dai condotti del latte, seguita da iniziazione ramo e l&#39;allungamento 1,2. Invasione delle filiali in stroma circostante è indotta dal rilascio sistemico di ormoni steroidei alla pubertà. Nuovi germogli primarie poi iniziano dalle estremità dei rami esistenti, e questo processo continua a creare un albero epiteliale 3. Anche se molti importanti segnali biochimici sono state identificate, una comprensione globale dei meccanismi cellulari biologici che guidano questo complesso processo di sviluppo è attualmente carente. Inoltre, gli studi meccanicistici sulle influenze dei segnali specifici sono difficili da decostruire da esperimentimenti in vivo, come precisi perturbazioni spazio-temporali e misure spesso non sono possibili. Tridimensionali (3D) le tecniche di coltura, quali la cultura tutto l&#39;organo, organoidi primarie, e modelli di coltura cellulare, sono strumenti utili per indagare in modo sistematico i meccanismi alla base del tessuto morfogenesi 4-6. Questi possono essere particolarmente utile per determinare le influenze di fattori specifici singolarmente, ad esempio forze meccaniche e segnali biochimici, su una varietà di comportamenti cellulari, compresa la migrazione, la proliferazione e la differenziazione. 6 modelli di coltura cellulare Engineered, in particolare, facilmente abilitare la perturbazione delle singole cellule e loro microambiente. Un tale modello di coltura utilizza un approccio microfabbricazione-based per ingegnerizzare modello tessuti epiteliali mammarie con struttura 3D controllato che in modo coerente e riproducibile formano rami che migrano collettivamente quando indotto con l&#39;unafattori di crescita ppropriate. Il principale vantaggio del modello è la capacità di manipolare e misurare gli effetti di fattori fisici e biochimici, come modelli di stress meccanico, con elevata affidabilità statistica precisione. Questa tecnica, insieme alla modellizzazione computazionale, è già stato utilizzato per determinare il contributo relativo di segnali fisici e biochimici nel guida del normale sviluppo dei tessuti epiteliali mammarie e di altri epiteli ramificati 7-11. Qui presentato è un protocollo dettagliato per la costruzione di questi tessuti modello, che possono essere facilmente estese ad altri tipi di cellule e della matrice extracellulare (ECM) gel, e che serve come un potenziale strumento per il test di terapie.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Agente indurente</td><td>PDMS Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Master in silicone litograficamente modellato</td><td>autoprodotto</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pesa in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm di diametro</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Preparare una soluzione di EtOH al 70% (v:v) miscelandola con dH2O</td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>di sicurezza americano</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco' s Aquila modificata' s Mezzo : Ham' s Miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Siero di iclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank' Life</td> <td>Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovino collagene di tipo I (non pepsinizzato)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta curva in acciaio inossidabile</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture tissutali da 35 mm di diametro</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti circolari #1, diametro 15 mm Bellco</td><td>Glass Inc.</td><td>Ordine</td><td></td>speciale</tr><tr><td>0,05% 1x Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Risospeso in dH2O a 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Coniglio anti-topo FAK anticorpo</td><td>Life Tecnologie</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa 488 anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per la codifica a colori delle mappe di frequenza dei pixel.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH n</td><td>/A</td><td>Software gratuito di analisi delle immagini utilizzato per la soglia, la registrazione e la sovrapposizione di immagini per creare una mappa di frequenza dei pixel. Il plug-in StackReg è stato utilizzato per la registrazione di immagini binarie.</td></tr></tbody></table>

tessuti epiteliali ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

L'architettura degli organi ramificati come i polmoni, i reni e le ghiandole mammarie nasce attraverso il processo di sviluppo della morfogenesi ramificata, che è regolata da una varietà di segnali solubili e fisici nel microambiente. Qui descritto è un metodo creato per studiare il processo di morfogenesi ramificata formando tessuti epiteliali tridimensionali ingegnerizzati (3D) di forma e dimensioni definite che sono completamente incorporati all'interno di una matrice extracellulare (ECM). Questo metodo consente la formazione di array di tessuti identici e consente il controllo di una varietà di fattori ambientali, tra cui la geometria dei tessuti, la spaziatura e la composizione della ECM. Questo metodo può anche essere combinato con tecniche ampiamente utilizzate come la microscopia a forza di trazione (TFM) per ottenere maggiori informazioni sulle interazioni tra le cellule e la MEC circostante. Il protocollo può essere utilizzato per studiare una varietà di processi cellulari e tissutali oltre alla morfogenesi ramificata, inclusa l'invasione del cancro.

Schematica generale di mammaria microfabrication tessuto epiteliale Uno schema generale della procedura microfabbricazione illustra il flusso di lavoro sperimentale è mostrato in Figura 1. Il risultato finale è un array di tessuti epiteliali della geometria identica e spaziatura che sono completamente incorporati all&#39;interno di un gel ECM. Un esperimento rappresentativo utilizza EpH4 topo cellule epiteliali mammarie colti...

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Lo scopo di questa procedura è ottenere un innalzamento di tessuti tridimensionali identici inglobati in un gel di collagene, utilizzabili in diversi contesti sperimentali, ad esempio per determinare l'influenza dello stress meccanico sulla morfogenesi ramificata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella morfogenesi tissutale, come individuare i meccanismi alla base del comportamento collettivo delle cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la geometria dei tessuti ingegnerizzati è controllata e riproducibile, consentendo una manipolazione e una misurazione precise dei fattori fisici e biochimici.Pertanto, la dimensione del campione è sufficientemente ampia da permettere di trarre conclusioni con un'elevata affidabilità statistica. Iniziare preparando un master in silicio fotolitografato con la matrice desiderata, utilizzando tecniche standard di fotolitografia. Il modello utilizzato in questo video è costituito da strutture rettangolari distanziate di 200 micron.Successivamente, mescolare 50 grammi di PDMS combinando il prepolymer e un agente indurente in un contenitore monouso in un rapporto di 10:1. Quindi, porre la miscela sotto vuoto per 15-30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria introdotte durante il processo di miscelazione. Posizionare il master di silicio con il lato strutturato rivolto verso l'alto in una barchetta di plastica per pesate e versare la soluzione di PDMS disareata sopra il mold.Quindi, posizionare la piastra in un forno e polimerizzare il PDMS a 60 gradi Celsius per 12 ore. Una volta polimerizzato, rimuovere il PDMS e il master dal contenitore di plastica. Separare con attenzione il PDMS dalla wafer di silicio.Quindi, utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere qualsiasi eccesso di PDMS dalle aree circostanti le strutture stampate. A questo punto, usare una lama di rasoio per tagliare il PDMS stampato in timbri rettangolari individuali. Conservare questi timbri con la faccia delle strutture rivolta verso l'alto in una piastra di Petri pulita di 100 millimetri di diametro.Successivamente, preparare un nuovo lotto di soluzione di PDMS disgassata utilizzando lo stesso rapporto 10:1 di prepolymero rispetto all'agente indurente. Applicare per spin-coating da due a tre grammi di questa soluzione su una piastra di Petri di 100 millimetri di diametro, quindi indurire il PDMS per 12 ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare lo strato sottile di PDMS in rettangoli da utilizzare come supporti per i timbri.Sono necessari due supporti per ogni stampo. Una volta tagliati tutti i supporti, sterilizzare gli stampi in PDMS e i supporti immergendoli in etanolo al 70% e asciugandoli mediante un aspiratore all'interno di una cappa a sicurezza biologica. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, aggiungere 50 microlitri di BSA all'1% in PBS sulla parte superiore di ogni stampo.Posizionare i timbri con la goccia a quattro gradi Celsius per un minimo di quattro ore per garantire che la BSA si fissi alla superficie del timbro. Successivamente, riportare i timbri all'interno della cappa a sicurezza biologica ed aspirare la soluzione di BSA dai timbri in PDMS. In seguito, lavare le superfici dei timbri due volte con 50 microlitri di mezzo di coltura cellulare.Aspirare il mezzo dopo ogni lavaggio. Preparare una piastra per colture cellulari di 35 millimetri di diametro per ogni stampo in PDMS. In ogni piastra, posizionare due supporti in PDMS separati da una distanza leggermente inferiore alla lunghezza degli stampi in PDMS.Quindi, utilizzare una pinzetta per prendere coprioggetti di vetro con un diametro di 15 millimetri e sterilizzarli con etanolo al 70%. Aspirare il liquido in eccesso dai coprioggetti mentre vengono tenuti con la pinzetta e quindi conservarli in una piastra di Petri separata. Successivamente, distribuire 50 microlitri di una miscela di collagene a quattro milligrammi per millilitro direttamente su ciascuno stampo, in modo da ricoprire uniformemente la superficie degli stampi in PDMS.Utilizzando le pinzette, prendere ciascuno dei timbri in PDMS rivestiti con collagene e capovolgerli delicatamente. Posizionare i timbri capovolti, con il lato del collagene rivolto verso il basso, sopra i supporti in PDMS nelle piastre per colture cellulari. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Successivamente, distribuire 50 microlitri della miscela di collagene rimanente su ciascun coprioggetto circolare e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. A questo punto, raccogliere il tipo cellulare di interesse. In questo caso, abbiamo cellule epiteliali mammarie murine EpH4 che abbiamo sospeso a una concentrazione compresa tra uno e 10 milioni di cellule per millilitro.Ora, rimuovere i campioni di collagene gelificato dall'incubatrice. Utilizzando le pinzette, sollevare delicatamente i timbri in PDMS verticalmente per staccarli dal collagene modellato e scartarli. È importante sollevare il timbro verticalmente per non deformare le strutture nel gel di collagene.Distribuire 30 microlitri della sospensione cellulare concentrata sulla superficie di ciascun gel di collagene contenente cavità modellate con la geometria desiderata. Osservare le cellule al microscopio a campo chiaro agitando delicatamente le piastre da un lato all'altro per favorire l'insediamento cellulare all'interno delle cavità. Le cavità dovrebbero riempirsi entro cinque minuti.Per rimuovere le cellule in eccesso presenti intorno alle cavità, inclinare ogni piastra per colture cellulari sul lato e dispensare delicatamente 400 microlitri di mezzo di coltura cellulare sulla superficie del gel di collagene. È importante eseguire il lavaggio delicatamente, dispensando lentamente il mezzo di coltura sul gel mentre si inclina la piastra, in modo da rimuovere le cellule in eccesso sulla superficie del gel senza spostare le cellule all'interno delle cavità del gel. Aspirare il liquido e ripetere il lavaggio altre due volte.Controllare i gel di collagene al microscopio tra un lavaggio e l'altro per osservare quando le cellule in eccesso sono state rimosse. Una volta eliminate le cellule in eccesso dalle cavità contenenti le cellule, posizionare le piastre per colture cellulari in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, utilizzando le pinzette, capovolgere delicatamente le coprioggetti di vetro rivestite di collagene e posizionarle sopra gli stampi di collagene contenenti le cellule, in modo che il collagene del coprioggetto formi un cappuccio sulle cavità riempite di cellule.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta che i tappi di collagene si sono aderiti agli stampi di collagene riempiti di cellule, aggiungere lentamente da due a 2 1/2 millilitri di mezzo di coltura cellulare sopra i coprioggetti di vetro posti in cima ai gel e coltivare i campioni a 37 gradi Celsius per uno a tre giorni. Queste immagini provengono da viste a bassa e alta ingrandimento degli array modellati in un gel di collagene di tipo I prima della semina cellulare.La forma dei pozzetti è determinata dalla forma delle strutture sul master di silicio. In questo caso, i pozzetti rettangolari sono stati riempiti con cellule epiteliali mammari. In questo esempio, ogni pozzetto rettangolare di 200 per 50 micron contiene circa da 80 a 100 cellule.24 ore dopo la semina delle cellule, si osserva che le cellule aderiscono l'una all'altra all'interno delle pozzette formando un tessuto. 24 ore dopo l'aggiunta del fattore di crescita HGF al mezzo di coltura, si osserva che i tessuti subiscono una morfogenesi ramificata. Una delle proteine coinvolte nella migrazione cellulare è la chinasi della adesione focale, la cui concentrazione aumenta, come si può vedere da questa immagine composita, alle estremità delle pozzette dove tipicamente avviene la ramificazione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore se eseguita correttamente. Dopo questo procedimento, altri metodi come la microscopia delle forze di trazione, la RT-PCR in tempo reale e il Western blotting possono essere eseguiti per determinare le forze esercitate dalle cellule durante la migrazione e le variazioni nei livelli di trascritti e proteine dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare questo modello di coltura cellulare tridimensionale in cui tessuti con geometria iniziale definita sono inclusi in un gel di collagene.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Ingegneria tessutale fibroblasti derivati ​​da matrice nativa è uno strumento emergente per generare un substrato stromale che supporta la proliferazione delle cellule epiteliali e differenziazione. Ecco un protocollo di applicazione di tale metodologia per valutare l'impatto dei diversi tipi di cellule stromali sulla biologia delle cellule tumorali è presentato.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Qui, descriviamo un metodo di coltura tridimensionale per analizzare la morfologia del primario del seno le cellule tumorali, come pure per studiare le interazioni diretta/indiretta con i monociti ed i risultati come degradazione del collagene, reclutamento delle cellule immuni, cell invasione e promozione dell'infiammazione legata al cancro.

Analizzando la comunicazione tra i monociti e le cellule di cancro al seno primario in una tabella extracellulare estrarre (ECME)-sistema tridimensionale basato su

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.

Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

Qui, dimostriamo come le cellule epiteliali coltivate con fibroblasti nel sistema a due strati basato su membrana nanofibrosa possano aderire e crescere stabilmente sulla membrana.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Impara a ingegnerizzare tessuti epiteliali tridimensionali in gel di collagene per studiare la morfogenesi tissutale. Questo metodo consente manipolazione precisa di fattori fisici e biochimici con elevata riproducibilità.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

Esplora altri video