Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

Lo scopo di questa procedura è ottenere un innalzamento di tessuti tridimensionali identici inglobati in un gel di collagene, utilizzabili in diversi contesti sperimentali, ad esempio per determinare l'influenza dello stress meccanico sulla morfogenesi ramificata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella morfogenesi tissutale, come individuare i meccanismi alla base del comportamento collettivo delle cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la geometria dei tessuti ingegnerizzati è controllata e riproducibile, consentendo una manipolazione e una misurazione precise dei fattori fisici e biochimici.

Pertanto, la dimensione del campione è sufficientemente ampia da permettere di trarre conclusioni con un'elevata affidabilità statistica. Iniziare preparando un master in silicio fotolitografato con la matrice desiderata, utilizzando tecniche standard di fotolitografia. Il modello utilizzato in questo video è costituito da strutture rettangolari distanziate di 200 micron.

Successivamente, mescolare 50 grammi di PDMS combinando il prepolymer e un agente indurente in un contenitore monouso in un rapporto di 10:1. Quindi, porre la miscela sotto vuoto per 15-30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria introdotte durante il processo di miscelazione. Posizionare il master di silicio con il lato strutturato rivolto verso l'alto in una barchetta di plastica per pesate e versare la soluzione di PDMS disareata sopra il mold.

Quindi, posizionare la piastra in un forno e polimerizzare il PDMS a 60 gradi Celsius per 12 ore. Una volta polimerizzato, rimuovere il PDMS e il master dal contenitore di plastica. Separare con attenzione il PDMS dalla wafer di silicio.

Quindi, utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere qualsiasi eccesso di PDMS dalle aree circostanti le strutture stampate. A questo punto, usare una lama di rasoio per tagliare il PDMS stampato in timbri rettangolari individuali. Conservare questi timbri con la faccia delle strutture rivolta verso l'alto in una piastra di Petri pulita di 100 millimetri di diametro.

Successivamente, preparare un nuovo lotto di soluzione di PDMS disgassata utilizzando lo stesso rapporto 10:1 di prepolymero rispetto all'agente indurente. Applicare per spin-coating da due a tre grammi di questa soluzione su una piastra di Petri di 100 millimetri di diametro, quindi indurire il PDMS per 12 ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare lo strato sottile di PDMS in rettangoli da utilizzare come supporti per i timbri.

Sono necessari due supporti per ogni stampo. Una volta tagliati tutti i supporti, sterilizzare gli stampi in PDMS e i supporti immergendoli in etanolo al 70% e asciugandoli mediante un aspiratore all'interno di una cappa a sicurezza biologica. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, aggiungere 50 microlitri di BSA all'1% in PBS sulla parte superiore di ogni stampo.

Posizionare i timbri con la goccia a quattro gradi Celsius per un minimo di quattro ore per garantire che la BSA si fissi alla superficie del timbro. Successivamente, riportare i timbri all'interno della cappa a sicurezza biologica ed aspirare la soluzione di BSA dai timbri in PDMS. In seguito, lavare le superfici dei timbri due volte con 50 microlitri di mezzo di coltura cellulare.

Aspirare il mezzo dopo ogni lavaggio. Preparare una piastra per colture cellulari di 35 millimetri di diametro per ogni stampo in PDMS. In ogni piastra, posizionare due supporti in PDMS separati da una distanza leggermente inferiore alla lunghezza degli stampi in PDMS.

Quindi, utilizzare una pinzetta per prendere coprioggetti di vetro con un diametro di 15 millimetri e sterilizzarli con etanolo al 70%. Aspirare il liquido in eccesso dai coprioggetti mentre vengono tenuti con la pinzetta e quindi conservarli in una piastra di Petri separata. Successivamente, distribuire 50 microlitri di una miscela di collagene a quattro milligrammi per millilitro direttamente su ciascuno stampo, in modo da ricoprire uniformemente la superficie degli stampi in PDMS.

Utilizzando le pinzette, prendere ciascuno dei timbri in PDMS rivestiti con collagene e capovolgerli delicatamente. Posizionare i timbri capovolti, con il lato del collagene rivolto verso il basso, sopra i supporti in PDMS nelle piastre per colture cellulari. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, distribuire 50 microlitri della miscela di collagene rimanente su ciascun coprioggetto circolare e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. A questo punto, raccogliere il tipo cellulare di interesse. In questo caso, abbiamo cellule epiteliali mammarie murine EpH4 che abbiamo sospeso a una concentrazione compresa tra uno e 10 milioni di cellule per millilitro.

Ora, rimuovere i campioni di collagene gelificato dall'incubatrice. Utilizzando le pinzette, sollevare delicatamente i timbri in PDMS verticalmente per staccarli dal collagene modellato e scartarli. È importante sollevare il timbro verticalmente per non deformare le strutture nel gel di collagene.

Distribuire 30 microlitri della sospensione cellulare concentrata sulla superficie di ciascun gel di collagene contenente cavità modellate con la geometria desiderata. Osservare le cellule al microscopio a campo chiaro agitando delicatamente le piastre da un lato all'altro per favorire l'insediamento cellulare all'interno delle cavità. Le cavità dovrebbero riempirsi entro cinque minuti.

Per rimuovere le cellule in eccesso presenti intorno alle cavità, inclinare ogni piastra per colture cellulari sul lato e dispensare delicatamente 400 microlitri di mezzo di coltura cellulare sulla superficie del gel di collagene. È importante eseguire il lavaggio delicatamente, dispensando lentamente il mezzo di coltura sul gel mentre si inclina la piastra, in modo da rimuovere le cellule in eccesso sulla superficie del gel senza spostare le cellule all'interno delle cavità del gel. Aspirare il liquido e ripetere il lavaggio altre due volte.

Controllare i gel di collagene al microscopio tra un lavaggio e l'altro per osservare quando le cellule in eccesso sono state rimosse. Una volta eliminate le cellule in eccesso dalle cavità contenenti le cellule, posizionare le piastre per colture cellulari in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, utilizzando le pinzette, capovolgere delicatamente le coprioggetti di vetro rivestite di collagene e posizionarle sopra gli stampi di collagene contenenti le cellule, in modo che il collagene del coprioggetto formi un cappuccio sulle cavità riempite di cellule.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Una volta che i tappi di collagene si sono aderiti agli stampi di collagene riempiti di cellule, aggiungere lentamente da due a 2 1/2 millilitri di mezzo di coltura cellulare sopra i coprioggetti di vetro posti in cima ai gel e coltivare i campioni a 37 gradi Celsius per uno a tre giorni. Queste immagini provengono da viste a bassa e alta ingrandimento degli array modellati in un gel di collagene di tipo I prima della semina cellulare.

La forma dei pozzetti è determinata dalla forma delle strutture sul master di silicio. In questo caso, i pozzetti rettangolari sono stati riempiti con cellule epiteliali mammari. In questo esempio, ogni pozzetto rettangolare di 200 per 50 micron contiene circa da 80 a 100 cellule.

24 ore dopo la semina delle cellule, si osserva che le cellule aderiscono l'una all'altra all'interno delle pozzette formando un tessuto. 24 ore dopo l'aggiunta del fattore di crescita HGF al mezzo di coltura, si osserva che i tessuti subiscono una morfogenesi ramificata. Una delle proteine coinvolte nella migrazione cellulare è la chinasi della adesione focale, la cui concentrazione aumenta, come si può vedere da questa immagine composita, alle estremità delle pozzette dove tipicamente avviene la ramificazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro due ore se eseguita correttamente. Dopo questo procedimento, altri metodi come la microscopia delle forze di trazione, la RT-PCR in tempo reale e il Western blotting possono essere eseguiti per determinare le forze esercitate dalle cellule durante la migrazione e le variazioni nei livelli di trascritti e proteine dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare questo modello di coltura cellulare tridimensionale in cui tessuti con geometria iniziale definita sono inclusi in un gel di collagene.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.