Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Questo documento elenca i passaggi necessari per seminare linee cellulari di neuroblastoma su scaffold tridimensionali a base di collagene precedentemente descritti, mantenere la crescita cellulare per un periodo di tempo predeterminato e recuperare scaffold per diverse analisi della crescita cellulare e del comportamento cellulare e applicazioni a valle, adattabili per soddisfare una serie di obiettivi sperimentali.

Il nostro protocollo offre un modello 3D bio-ingegnerizzato che interessa da vicino il tessuto nativo. Questo può potenzialmente essere utilizzato per scoprire nuove terapie e biomarcatori per il trattamento e la diagnosi del neuroblastoma. Il vantaggio principale è che crea condizioni sperimentali più rilevanti dal punto di vista fisiologico per studiare il microambiente tumorale utilizzando una tecnica riproducibile che raggiunge la coerenza da lotto a lotto.

Il nostro metodo scaffold può essere utilizzato in primo luogo per identificare nuove terapie per il neuroblastoma e, in secondo luogo, per incorporare cellule derivate dal paziente per una migliore previsione della risposta individuale del paziente. Per iniziare, posizionare l'impalcatura immagazzinata in PBS nella cappa a flusso laminare. Utilizzare una pinzetta sterile per sollevare delicatamente l'impalcatura dall'angolo e premere contro la parete laterale per rimuovere il PBS in eccesso.

Quindi posizionare l'impalcatura con lo strato lucido rivolto verso il basso al centro del pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non aderente. Etichettare la piastra con i dettagli della linea cellulare, della densità di semina e dei punti temporali. Lavorare con le cellule di una densità di semina alla volta e mantenere le cellule rimanenti a 37 gradi Celsius nell'incubatrice, fino al momento dell'uso.

Per il fissaggio delle cellule nello scaffold, utilizzare una pipetta P20 con puntali sterili per miscelare accuratamente la sospensione cellulare e aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare pertinente al centro di ciascuna impalcatura, assicurandosi che la sospensione cellulare rimanga sopra l'impalcatura e non sulla parete laterale o sulla base del pozzetto. Lascia che le cellule si attacchino per tre o cinque ore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica e al 95% di umidità. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere lentamente un millilitro di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto, evitando lo spostamento degli scaffold, e incubare la piastra durante la notte.

Osservare gli scaffold, inizialmente, ogni due o tre giorni per i cambiamenti di colore del mezzo di crescita man mano che le cellule proliferano all'interno dell'impalcatura. Utilizzare una pistola per pipette da 10 millilitri con modalità lenta per rimuovere ed eliminare un millilitro del mezzo esausto dal pozzetto. Quando il terreno condizionato viene utilizzato per l'esperimento, raccogliere il terreno esausto delle repliche biologiche in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione.

Trasferire il surnatante in una provetta nuova e conservare la provetta a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver impostato la pistola per pipette in modalità gocciolante, aggiungere delicatamente due millilitri di terreno di coltura preriscaldato agli scaffold. Incubare la piastra contenente l'impalcatura e reintegrare il terreno fresco per la durata del periodo di crescita desiderato, come dimostrato.

Nella cappa a flusso laminare, sterilizzare il reagente appropriato per il saggio di vitalità cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri in una provetta da centrifuga. Preriscaldare la soluzione sterile, il terreno di coltura completo e il PBS sterile a bagnomaria, a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold da analizzare in una nuova piastra a 24 pozzetti ed etichettare la piastra con tutti i dettagli pertinenti.

Aggiungere 900 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto. Quindi aggiungere 100 microlitri del reagente sterile per la vitalità cellulare a ciascun pozzetto. Per un controllo negativo, aggiungere 900 microlitri di terreno e 100 microlitri di reagente sterile per la vitalità cellulare in un pozzetto senza scaffold.

Riposizionare il coperchio sulla piastra e far oscillare delicatamente la piastra per circa tre minuti per distribuire il reagente di vitalità cellulare diluito in tutto il pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo aver tolto la piastra dall'incubatrice, scuotetela delicatamente per alcuni secondi e generate le triplicate, come dimostrato nel manoscritto del testo.

Generare le triplicate tecniche trasferendo 100 microlitri del terreno incubato e del reagente da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti in un pozzetto della piastra traslucida a 96 pozzetti ed eseguire questo passaggio per un totale di tre volte per un pozzetto. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio per proteggere il reagente di vitalità cellulare dalla luce. Rimuovere ed eliminare i restanti 700 microlitri di terreno e reagente dagli scaffold nella piastra a 24 pozzetti.

Lavare ogni impalcatura due volte con un millilitro di PBS sterile. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 570 e 600 nanometri e calcolare la riduzione percentuale dei reagenti di vitalità cellulare secondo le raccomandazioni del produttore. Analizzare statisticamente i risultati di vitalità cellulare, utilizzando un software appropriato.

Inserire i valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio. Eseguire un'analisi unidirezionale del test di varianza per esaminare i cambiamenti nella vitalità cellulare nell'arco di tempo sperimentale utilizzando un software biostatistico appropriato. Indicare le differenze significative tra i punti temporali sui grafici, come descritto nel manoscritto del testo.

È stata valutata la vitalità di due linee cellulari di neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, coltivate sugli scaffold. L'aumento della densità cellulare ha comportato una maggiore riduzione del reagente di vitalità cellulare nel tempo. La crescita cellulare sugli scaffold è stata misurata indirettamente quantificando il DNA estratto dagli scaffold e sono state calcolate le cellule per campione.

Le cellule IMR32 hanno mostrato un aumento della crescita, quindi le cellule KellyLuc, con il tempo. La morfologia di crescita e la distribuzione delle cellule sugli scaffold sono state valutate visivamente mediante ematossilina, eosina e colorazione immunoistochimica. Le cellule KellyCis83 sono cresciute più velocemente e si sono infiltrate più in profondità in entrambe le composizioni di scaffold rispetto alla linea cellulare Kelly meno invasiva.

IMR32 coltivato su nano-idrossiapatite ha dimostrato un modello di crescita contrastante con grappoli grandi e densamente impacchettati, nell'arco di 14 giorni. I tratti cellulo-specifici sono stati monitorati mediante colorazione immunoistochimica, seguita da colorazione falloidina e DAPI, e l'abbondanza di actina è stata osservata nelle cellule Kelly e KellyCis83 su scaffold di collagene-glicosaminoglicani. Per la valutazione dell'attività cellulare in vitro, sono stati misurati i livelli secreti di cromogranina A e le cellule cresciute su scaffold di collagene-glicosaminoglicani e nano-idrossiapatite di collagene hanno prodotto più cromogranina A rispetto alla crescita su coltura 2D convenzionale.

La linea cellulare KellyCis83 resistente alla chemio ha secreto più cromogranina A rispetto alla linea cellulare Kelly. Dopo l'attacco cellulare, le cellule possono essere trattate con varie terapie. Ciò fornirebbe risultati fisiologicamente più rilevanti per la risposta delle cellule ai farmaci rispetto alla coltura 2D convenzionale.

Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare meglio come le cellule tumorali si comportano e reagiscono a uno stimolo all'interno del microambiente tumorale, che va dalla risposta alle terapie o alle interazioni con altri tipi di cellule.