Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Prove sperimentali e cliniche dimostrano che la riperfusione di ischemia epatica può aumentare la formazione di focolai metastatici facendo circolare le cellule tumorali e la crescita della malattia micrometastatica. Questo modello murino riproducibile consente lo studio rilevante sia della creazione di metastasi che della crescita del tumore preesiste all'interno del fegato. La chirurgia epatica, il sanguinamento e lo shock settico sono tutti associati alla riperfusione di ischemia epatica e possono influenzare la crescita della malattia metastatica.

Queste tecniche consentono lo studio di questi fenomeni nel tentativo di diagnosticare e prevenire meglio l'effetto dannoso della riperfusione di ischemia sulla crescita tumorale in un contesto clinico. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un topo maschio C57 black 6 di otto-12 settimane anestetizzato, disinfettare la pelle esposta della parete addominale con uno scrub povidone-iodio e utilizzare le forcette dentate per sollevare la pelle. Utilizzando un bisturi chirurgico, fare un'incisione della linea mediana nella pelle e sollevare il muscolo addominale e il peritoneo per facilitare la creazione di un'incisione della linea mediana di tre centimetri per esporre il contenuto addominale.

Dopo aver posizionato un emostato su entrambi i lati dell'incisione e sotto il processo xifoide, tirare e nastro la coda verso il basso per estendere l'addome e utilizzare un applicatore sterile a punta di cotone da sei pollici per separare ed esporre la milza dal tessuto adiposo pancreatico. Successivamente, vortice la sospensione delle cellule tumorali di interesse per dissociare eventuali grumi cellulari e caricare le cellule in una siringa per insulina da 0,5 millilitri dotata di un ago calibro 28. Iniettare lentamente e con cura 100 microlitri di cellule nella punta della milza, posizionando una punta di cotone adiacente al lato della puntura dell'ago per assorbire qualsiasi possibile fuoriuscita di tumore nella cavità peritoneale aggiungendo una leggera pressione per stabilizzare la milza durante l'iniezione.

Un'iniezione riuscita sarà evidente da un cambiamento nel colore del fegato. Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, posizionare un pezzo di garza sterile imbevuta di PBS sull'area sezionata e posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante per 15 minuti per consentire alle cellule tumorali di circolare all'interno del sistema. Per indurre un'ischemia e una lesione da riperfusione, utilizzare due punte di cotone inumidito per spostare delicatamente l'intestino dalla cavità per esporre la vena del portale e posizionare il mouse sotto un microscopio sezionante.

Sollevare i lobi del fegato laterale mediano e sinistro contro il diaframma. Posizionare un piccolo batuffolo di cotone umido tra il lobo mediano e il lobo laterale destro per creare spazio sufficiente per il bloccaggio e passare con cura un dilatatore di vasi dietro la triade del portale e, utilizzando le pinze del dilatatore del vaso, utilizzare un pezzo di 10 centimetri di sutura di polipropilene 4-0 per passare dietro e sollevare la triade del portale. Utilizzare un applicatore di morsetto micro-serrifine con una serratura per posizionare un morsetto microvascolare sui lobi epatici sinistro e mediano per occludere tutte le strutture nella triade del portale.

Quando si osserva sbiancamento, rimuovere la sutura di polipropilene 4-0 e il piccolo batuffolo di cotone e restituire con cura l'intestino alla cavità addominale. Coprire la parete addominale con un nuovo pezzo di garza imbevuta di PBS e coprire la garza con un involucro di plastica per ridurre al minimo la perdita evaporativa. Quindi riposizionare il mouse sulla pastiglia di riscaldamento per 60 minuti.

Durante l'intervallo ischemico, visualizzare il pallido sbiancamento dei lobi mediali destro, mediali sinistro e laterale per confermare le prove della lesione da ischemia. Alla fine del periodo di lesione, rimuovere il morsetto. Per eseguire una splenectomia, sollevare con cura la milza con forcende lisce e utilizzare un dispositivo cautery portatile per cauterizzare i vasi sanguigni splenici per evitare un eccessivo sanguinamento.

Trasezionare i vasi nella sezione cauterizzata per rimuovere la milza e utilizzare immediatamente 4-0 suture in polipropilene per chiudere le incisioni muscolari e cutanee in un modello di sutura a doppio strato. Quindi riposizionare il mouse nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Lo stress chirurgico aumenta significativamente la quantità di micrometastasi prestabilite all'interno del fegato.

Questa differenza si osserva anche due settimane dopo la riperfusione dell'ischemia rispetto ai topi non ischemia riperfusi. La riperfusione di ischemia epatica e l'iniezione di cellule tumorali possono essere influenzate dalla temperatura ambiente e dalla vitalità cellulare, quindi fai attenzione a controllare queste variabili. Questa tecnica facilita lo studio degli effetti dello stress chirurgico e della lesione epatica sulla crescita della malattia metastatica.

Ciò aiuterà i ricercatori a comprendere meglio il fenomeno della crescita tumorale indotta dalla chirurgia.